一种氧化壳寡糖交联胶原并原位生成纳米银制备抗菌型胶原的方法

摘要

本发明公开了一种氧化壳寡糖交联胶原并原位生成纳米银制备抗菌型胶原的方法，其方法是采用过量的氧化壳寡糖交联胶原，再引入银离子，已连接到胶原上的氧化壳寡糖上的残留醛基将银离子原位还原得到纳米银粒子，并在氨基的作用下得到稳定，从而制备出具有优良使用性能、生物相容性和双重抗菌效果的胶原材料。本方法将胶原的交联、残留醛基的消除与原位纳米银的生成及稳定有机整合起来，为新一代抗菌型胶原材料的制备开辟出了新途径。该方法可用于生物材料与皮革工业中。

说明书

技术领域

本发明涉及一种氧化壳寡糖交联胶原并原位生成纳米银制备抗菌型胶原的方法，可应用于生物医用材料及皮革行业。

背景技术

众所周知，我们生存的环境中充斥着各种的细菌，部分细菌属于致病菌，时刻危协着人类的健康。人类依靠自身的免疫力以及皮肤的屏障作用，抵御外界微生物的入侵。在创伤、烧伤、手术治疗中，由于清创不彻底、交叉感染等原因，伤口会受到微生物的侵袭，如果微生物的数量超过一定的限度，伤口就会形成临床感染，增加伤口的疼痛，并使创面形成大量的脓包，影响伤口愈合，严重时甚至危及生命。手术中的感染，也是造成医疗事故的重要原因。普通的医用生物材料，往往不具备抗菌/抑菌功能，因此，研究具有抗菌/抑菌功能的生物材料具有十分重要的理论和实际意义。此外，在日常生活中，生产具有抗菌/抑菌功能的革制品也有重要的实际意义。

要赋予材料以抗菌/抑菌性，一般是将抗菌剂通过物理复合或化学接枝的方法加入到目标材料上。常用的抗菌剂包括有机抗菌剂（如季铵盐）、天然抗菌剂（如壳聚糖）、无机抗菌剂（如纳米银）等。

纳米银是纳米技术的一种产物，是金属银粒径在纳米水平上的单质，从纳米银被发现至今，已被大量实验证明其具有极大的比表面积、小尺寸效应和量子尺寸效应，同时具有广谱抗菌性和细菌对其无耐药性的优点，比普通银离子安全性更高，效果更持久，具有其他材料无法比拟的抗菌活性，并且对一些真菌、病毒等也有较强的杀灭作用［陈飞飞，陈芳艳，王叶云，等. 纳米银灭菌机制及应用研究进展[J]，安徽农业科学，2016，44(9):28~30.］。故而纳米银粒子已成为当前抗菌材料的研究的一大焦点，并被应用于医用生物材料。

常见的纳米银材料的制备方法是：在材料之外，先将银通过直接制备法（如真空气体冷凝法），物理、化学或生物还原法得到纳米银分散体[代小英, 许欣, 陈昭斌,等. 纳米银制备方法概述[J]. 中国消毒学杂志, 2007, 24(6):561-563.]，然后将其与材料复合得到纳米银材料。在制备过程中步骤繁杂且可能引入其他物质（如纳米银制备过程中用到的稳定剂等）对材料的其他性能造成一定影响，并不是一种理想的方法。

壳聚糖是目前自然界广泛存在的唯一一种带正电荷的单体物质，具有抗菌性、抗肿瘤、增强免疫力等功能。氧化壳寡糖是由壳聚糖的衍生物壳寡糖经选择性氧化后得到的产物，既保留了壳聚糖一定的抗菌性，又含有具有交联活性的醛基，可与胶原类材料交联，赋予材料良好的使用性与一定的功能性，并保留了胶原材料良好的生物相容性[Y Chen, NDan, L Wang. Study on the cross-linking effect of a natural derived oxidizedchitosan oligosaccharide on the porcine acellular dermal matrix[J]. RscAdvances, 2016, 6, 38052–38063]。但由于空间位阻、活性反应基团有限，氧化壳寡糖中的醛基不能完全参与反应，部分具有反应活性的醛基残留并被引入胶原材料内。因此，向与氧化壳寡糖交联后的胶原中直接加入银离子，利用这些极具活性的醛基将银离子在胶原内部原位还原成纳米银，并在糖上氨基的作用下得到稳定，可在反应的同时将纳米银粒子负载于材料内，达到清除残留醛基、原位生成纳米银粒子、纳米银粒子稳定的一举三得之功效。此外，还能将壳寡糖的抗菌性能与纳米银粒子的抗菌性能有机地统一在一起，以适应及克服越来越复杂的细菌环境。

可见，在交联胶原使其具备使用性和功能性的同时，在胶原内部原位生成、稳定并负载纳米银粒子，得到交联型含纳米银的抗菌胶原材料，是新一代纳米银胶原抗菌材料的制备方法。

发明内容

一种氧化壳寡糖交联胶原并原位生成纳米银制备抗菌型胶原的方法，其特征是：

（1）交联：称取100重量份的胶原（以干重计）；对于胶原纤维及其聚集体，将其浸泡于1000～10000重量份的pH4.0~12.0的缓冲溶液中，加入1~20重量份的氧化度为10%~95%的氧化壳寡糖，在0℃～45℃条件下保持震荡反应1～48小时；对于提取得到的胶原分子，加入8000～100000重量份的pH3.0～6.5的醋酸溶液，震荡或搅拌使其完全溶解，将1～20重量份的氧化度为10%~95%的氧化壳寡糖溶于20～1000重量份的pH3.0～6.5的醋酸溶液中，将氧化壳寡糖溶液加入到胶原分子溶液中，在0℃～10℃条件下保持震荡或搅拌，反应1～48小时；

（2）交联后处理：对于胶原纤维及其聚集体，用硝酸或硫酸铵将浴液pH调至中性，弃去浴液，加入1000～10000重量份的超纯水或注射水，保持震荡或搅拌清洗0.5～2小时，弃去清洗液，反复清洗3~7次；对于提取得到的胶原分子，交联反应后，在0℃~4℃下，首先用氢氧化钠溶液调节pH值为弱碱性（pH值约7.50），缓慢加入固体硫酸铵使其浓度约为1.5 mol/L，连续搅拌至硫酸铵完全溶解，然后静置过夜（10～12h）；次日用高速低温离心机离心分离（8000~12000 r/min，15 min，0℃~4℃），弃上清液，向沉淀中加入800-10000重量份的pH3.0～6.5的硝酸溶液，搅拌30 min；将其注入透析袋（截留分子量为3500～14000Da）中，在超纯水或注射水中透析2~5天；

（3）硝酸银溶液的配置：称取0.017~0.255重量份的硝酸银，溶于1000重量份的超纯水或注射水中；

（4）原位生成纳米银：对于交联后的胶原纤维及其聚集体，加入500-10000重量份的硝酸银溶液，用硝酸调节溶液pH值为1~7，在0℃～37℃条件下保持震荡反应4～48小时；对于提取得到的胶原分子，加入500-10000重量份的硝酸银溶液至胶原溶液中，在0℃～10℃条件下保持搅拌反应4～48小时；

（5）纳米银胶原后处理：对于胶原纤维及其聚集体，弃去浴液，加入1000～10000重量份超纯水，保持震荡或搅拌清洗0.5～2小时，弃去清洗液，反复清洗1～5次，用冷冻干燥机冻干；对于提取得到胶原分子，将反应后的胶原溶液直接注入透析袋（截留分子量为3500～14000Da）中，在超纯水或注射水中透析2~5天。

根据权利要求1所述的一种氧化壳寡糖交联胶原并原位生成纳米银制备抗菌型胶原的方法，其中所述的溶液均采用超纯水或注射水为溶剂。

根据权利要求1所述的一种氧化壳寡糖交联胶原并原位生成纳米银制备抗菌型胶原的方法，其中所述的缓冲溶液是指硼酸-硼砂缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、氢氧化钠-碳酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、磷酸盐缓冲液。

权利要求1所述的一种氧化壳寡糖交联胶原并原位生成纳米银制备抗菌型胶原的方法，其特征在于该方法可用于抗菌型胶原类生物医学材料的制备或皮革行业中抗菌型猪、牛、羊动物皮的加工。

本发明具有以下的优点：

（1）氧化壳寡糖继承了壳聚糖的优良生物相容性和抗菌性的优点，克服了其水溶性差和渗透性差的缺点，并具有活泼的反应性，可赋予胶原良好的使用性能与一定的抗菌性；

（2）通过过量氧化壳寡糖交联，可降低胶原纤维的抗原性，向胶原中引入氧化壳寡糖分子中的醛基和氨基；

（3）被引入的醛基成为还原剂，在胶原中将银离子原位还原为纳米银，既有效避免了醛基的残留，又赋予了胶原抗菌性；

（4）被引入的氨基成为纳米银粒子的稳定剂，有效避免了纳米银粒子的团聚与迁移；

（5）整合了壳寡糖与纳米银抗菌性，兼顾了其生物相容性，构建了双重抗菌/抑菌系统，保证了其功能性。

综上所述， 本方法采用氧化壳寡糖交联胶原，在保证了交联性、使用性的同时利用未交联完全的醛基原位将银离子还原成纳米银，并在氨基的作用下使其稳定，交联后的胶原材料成功负载纳米银，本方法兼顾优良的使用性能、较好生物相容性及双重抗菌功能性，是一种可行性强，极具潜力的新型交联与功能化的方法。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例1

（1）称取胶原膜3克；

（2）称取氧化度为60%的氧化壳寡糖0.36克，置于盛有50ml pH7.4的磷酸盐缓冲溶液的烧杯中，振摇使其完全溶解；

（3）将胶原膜放入上述烧杯内，封闭杯口；

（3）向上述烧杯内放入磁力搅拌子，并将烧杯置于磁力搅拌器上，调节反应温度为25℃，搅拌速度为1000r/min；

（4）反应12小时后，弃去反应液，加入50ml超纯水清洗0.5小时，重复清洗若干次至逐滴加入硝酸银溶液不出现白色沉淀为止；

（5）弃去清洗液，加入25ml浓度为1mmol/L的硝酸银溶液，并将烧杯置于磁力搅拌器上，调节反应温度为15℃，搅拌速度为1000r/min；

（6）反应2小时后，取出交联胶原膜，在超纯水中漂洗3次，在超净工作台上风干。

实施例2

（1）称取脱细胞猪真皮基质100克（干重）于不锈钢转鼓中，加入1000ml pH9.4的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液；

（2）称取氧化度为45%的氧化壳寡糖8克，溶于1000ml pH9.4的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液后加入上述反应釜中；

（3）调节反应温度为37℃，开启转鼓；

（4）反应24小时，弃去反应液，加入稀硝酸调节反应液至pH呈中性，再弃去溶液，加入2000ml超纯水清洗0.5小时，弃去清洗液，反复清洗7次；

（5）弃去清洗液，加入800ml浓度为0.2 mmol/L的硝酸银溶液，调节反应温度为25℃，开启转鼓；

（6）4h后弃去反应液，加入2000ml超纯水清洗0.5小时，弃去清洗液，反复清洗2次；

（7）取出交联脱细胞猪真皮基质，置于冷冻干燥机中冻干。

实施例3

（1）将胶原溶解在乙酸-乙酸钠溶液中（0.5M，pH4）配制成5mg/mL的I型胶原溶液；

（2）将氧化度为30%的壳寡糖配制成浓度为0.4mg/mL的氧化壳寡糖溶液，并将其逐滴加入5mg/mL的 I型胶原溶液中，使最终质量浓度为胶原的5%；

（3）在4℃下磁力搅拌反应 24h；

（4）将交联后的胶原用高速低温离心机在转速10000 r/min，4℃下离心15 min，弃上清液，向沉淀中加入稀硝酸溶液，搅拌，并将其注入透析袋（截留分子量为3500Da）中，最后置于注射水中透析3天，白天每4h换透析液一次；

（5）将透析后的胶原转入烧杯中，逐滴加入浓度为0.1mmol/L的硝酸银溶液使其体积分数为胶原的4%，并在滴加的同时保持搅拌；

（6）在室温下磁力搅拌反应2h；

（7）将反应后的胶原注入透析袋（截留分子量为3500Da）中，最后置于注射水中透析2天，白天每4h换透析液一次；

（8）将透析后的胶原溶液使用冷冻干燥机冻干成胶原海绵。