一种分离纯化乳铁蛋白的免疫亲和柱及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种分离纯化乳铁蛋白的免疫亲和柱及其制备方法和用途，该免疫亲和纯化柱利用SPA蛋白偶联到琼脂糖凝胶载体上，然后用抗乳铁蛋白的抗体与琼脂糖上的SPA蛋白偶联，再利用交联剂对乳铁蛋白抗体—蛋白G-琼脂糖凝胶载体进行交联后装填亲和柱。该免疫亲和柱主要用于对牛奶、奶粉、乳制品以及其他多种样本中的乳铁蛋白的纯化，以得到乳铁蛋白纯品做为药品、保健品、食品添加剂等使用。本亲和柱还可以从样本中纯化得到乳铁蛋白，以便后期对样本中乳铁蛋白含量进行蛋白电泳或者高效液相色谱（HPLC）检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离纯化乳铁蛋白的免疫亲和柱及其制备方法和用途，属于乳铁蛋白分离纯化领域。

背景技术

乳铁蛋白（Lacoferrin）是一种相对分子质量约为80KD的糖蛋白，主要存在于乳中，特别在初乳中可达7g/L。不管是人乳还是牛乳，随着乳汁的成熟，其含量会有所下降。乳铁蛋白是一种天然的抗菌糖蛋白，乳铁蛋白的特异性的铁离子结合能力使其对革兰氏阳性菌和阴性菌都有抗菌能力。研究证明，天然的乳铁蛋白具有抗病毒能力，还具有抗氧化作用和免疫调节作用。因此，乳铁蛋白被用于食品和药品等多种领域。

美国食品药品管理局(FDA)允许将乳铁蛋白作为食品添加剂应用于运动、功能性食品中，在日本、韩国也允许将乳铁蛋白作为食品添加剂应用于食品中。在我国，卫生部在国家标准《食品添加剂使用卫生标准GB2760一19966》2004年增补品种中允许在婴儿配方奶粉中添加乳铁蛋白。

目前，国内外对乳铁蛋白分离方法的研究比较多，主要有盐析法、超滤法、色谱法等。

盐析法和超滤法的原理都是去掉乳品中的一些杂质蛋白，得到含有高浓度的乳铁蛋白制品，但是无论盐析法还是超滤法都无法得到乳铁蛋白的纯品。这两种方法主要的优势在于可以短时间处理大量的乳品样本，但纯化得到的乳铁蛋白的纯度低，适用于保健品和食品添加剂等对乳铁蛋白的纯度要求不高的行业。

肝素亲和层析利用亲和层析原理纯化乳铁蛋白，目前被认为是比较好的纯化乳铁蛋白的方法。肝素亲和柱操作比较简单，但由于肝素亲和的原理是通过酸性多糖和碱性蛋白相互吸附。因此，乳中很多蛋白和肽段也能够与肝素结合从而被洗脱下来，影响了乳铁蛋白的纯度。此外，肝素亲和柱价格较高，不适宜处理大量的原奶，一般用于精细化学品的制备。

免疫亲和柱是本发明利用的方法，主要利用了抗原抗体特异性结合的原理，将乳铁蛋白抗体联接在载体上纯化样品中的乳铁蛋白。免疫亲和柱操作简单，与肝素亲和柱和乳中多种蛋白有结合不同，特异性的乳铁蛋白抗体只识别乳中的乳铁蛋白，因此得到的乳铁蛋白纯度较高，基本上没有乳中其他蛋白的污染。常规的免疫亲和柱制备是直接将抗体偶联到载体上，因为抗体较为昂贵限制了其应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服了现有技术的不足，提供一种分离纯化乳铁蛋白的免疫亲和柱，并给出其制备方法和说明用途，可高效、快捷、简便、经济的得到高纯度乳铁蛋白。该免疫亲和纯化柱利用SPA蛋白偶联到琼脂糖凝胶载体上，然后用抗乳铁蛋白的抗体与琼脂糖上的SPA蛋白偶联，再利用交联剂对乳铁蛋白抗体—蛋白G-琼脂糖凝胶载体进行交联后装填亲和柱。该免疫亲和柱主要用于对牛奶、奶粉、乳制品以及其他多种样本中的乳铁蛋白的纯化，以得到乳铁蛋白纯品做为药品、保健品、食品添加剂等使用。本亲和柱还可以从样本中纯化得到乳铁蛋白，以便后期对样本中乳铁蛋白含量进行蛋白电泳或者高效液相色谱（HPLC）检测。

本发明的分离纯化乳铁蛋白的免疫亲和柱，按照以下方法制备而成：

1.载体溶胀活化

使用溴化氢法活化琼脂糖载体，选择经过溴化氰活化的琼脂糖载体CNBr-sepharose4B，用1mmol/L的盐酸溶胀活化。

2.将SPA蛋白与活化载体sepharose4B的偶联

将活化好的琼脂糖凝胶sepharose4B用偶联缓冲液（0.1M的NaHCO₃，0.8M>

将偶联好的琼脂糖载体采用常规方法用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次，偶联有SPA蛋白的琼脂糖载体sepharose命名为SPA蛋白-sepharose。

3.抗乳铁蛋白抗体与SPA蛋白-sepharose载体结合

将抗乳铁蛋白抗体溶于50mM、PH7.5~9.0的Tris.HCl缓冲液中，终浓度2~2.5mg/ml。将抗体加入用50mM、PH7.5~9.0的Tris.HCl缓冲液洗涤过的SPA蛋白-sepharose中，室温结合20-50分钟。结合后的载体用50mM、PH7.5~9.0的Tris.HCl缓冲液洗涤，每克蛋白SPA-sepharose加入200nmol-1.2umol抗体反应，连接有抗体的载体命名为抗体-SPA蛋白-sepharose。

4.抗体交联

将抗体-SPA蛋白-sepharose用PH7.4-8.4的硼酸缓冲液洗涤1次，然后在缓冲液中加入交联剂，交联剂包括庚二亚氨酸二甲酯（DMP）、N-琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸酯（SIAB）、琥珀酰亚胺基-6-[（β-马来酰亚胺丙酰胺基）]己酯（SMPH）、N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酯（SPDP）、N-[ε-马来酰亚胺乙酰基氧]硫代琥珀酰亚胺酯(Sulfo-EMCS)，至终浓度2-10mM，室温交联0.5~2小时，加入PH7.4~8.9的乙醇胺终止反应5~15分钟。

交联后的抗体-SPA蛋白-sepharose载体用20mM，PH7.4的PBS洗涤3次。

5.装柱

将交联后的抗体—琼脂糖载体装入层析柱中，制备出乳铁蛋白纯化柱，规格为1~200ml。

利用上述技术方案制成的免疫亲和柱，可用于包括牛奶、羊奶、奶粉、酸奶、冰淇淋、奶酪、其它乳制品以及乳品饮料中乳铁蛋白的分离纯化，并且结合SDS-PAGE蛋白凝胶电泳或者高效液相色谱（HPLC）法检测，用于检验样本中乳铁蛋白的含量。纯化得到的乳铁蛋白可以作为药品、保健品、食品或者食品添加剂的原料。采用本发明制成的乳铁蛋白免疫亲和柱乳铁蛋白的纯化效率高达95%以上，且操作简便，三步就可以得到纯度较高的乳铁蛋白，更方便操作者使用，节省了操作者的时间和费用。

附图说明

图1：乳铁蛋白抗体-SPA蛋白-载体复合物结构示意图。

A：琼脂糖凝胶B：SPA蛋白C：乳铁蛋白抗体。

图2：乳铁蛋白免疫亲和柱结构示意图。

A：进样口； B：柱体； C：筛板； D：乳铁蛋白抗体-SPA蛋白-sepharose填料E：筛板； F：出样口。

图3：从牛初乳中纯化乳铁蛋白的电泳图谱。

M: 蛋白Maker；1：未纯化乳样；2：乳样中的杂蛋白；3：纯化的乳铁蛋白收集1； 4：纯化的乳铁蛋白收集2。

图4. 奶粉样本中乳铁蛋白含量检测HPLC图谱。

Lf：乳铁蛋白峰。

图5：从奶粉中纯化乳铁蛋白的电泳图谱。

M: 蛋白Maker；1：未纯化奶粉样本；2：奶粉样中的杂蛋白；3：纯化的乳铁蛋白。

图6. 奶粉样本中乳铁蛋白含量检测HPLC图谱。

Lf：乳铁蛋白峰。

具体实施例

实施例1：乳铁蛋白免疫亲和纯化柱的制备

本发明制备乳铁蛋白免疫亲和纯化柱的一个优选的实施方案如下：

1.琼脂糖凝胶活化

称取5g经过溴化氰活化的琼脂糖载体，CNBr-sepharose4B，用50ml 1mmol/L的盐酸溶胀活化。反应后，用50mmol/L的盐酸洗涤3次。

2.SPA蛋白与活化的琼脂糖凝胶的偶联

取活化后的琼脂糖凝胶，用偶联缓冲液（0.1M的NaHCO₃，0.8M>

将偶联好的琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次。偶联有SPA蛋白的琼脂糖载体sepharose命名为SPA蛋白-sepharose。

3.抗乳铁蛋白抗体与SPA蛋白-sepharose载体结合

将抗乳铁蛋白抗体溶于PH7.5的Tris.HCl缓冲液中，终浓度2.2mg/ml。将抗体加入PH7.5的Tris.HCl缓冲液洗涤过的SPA蛋白-sepharose中，室温结合20分钟。 结合后的载体用Tris.HCl缓冲液洗涤。连接有抗体的载体命名为抗体—SPA蛋白—sepharose。

4.结合IgG的琼脂糖sepharose交联

将抗体-SPA蛋白-sepharose用PH7.5的硼酸缓冲液洗涤1次，然后在缓冲液中加入交联剂，交联剂包括庚二亚氨酸二甲酯（DMP）、N-琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸酯（SIAB）、琥珀酰亚胺基-6-[（β-马来酰亚胺丙酰胺基）]己酯（SMPH）、N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酯（SPDP）、N-[ε-马来酰亚胺乙酰基氧]硫代琥珀酰亚胺酯(Sulfo-EMCS)，至终浓度2.5mM，室温交联0.5小时，加入PH7.5的乙醇胺终止反应10分钟。

5.将交联后的sepharose用10毫升20mM PBS PH7.4重悬，然后装入空的亲和纯化柱柱体中。

实施例2：利用乳铁蛋白免疫亲和柱从牛初乳纯化乳铁蛋白

1.牛初乳样品处理

1)将牛初乳在4℃，5000×g离心30分钟，去除上层乳脂。

2)将脱脂的初乳用0.22um的滤膜过滤。

3)过滤后的牛初乳样本，用于纯化上样。

2.将乳铁蛋白免疫亲和纯化柱室温平衡10分钟。

3.将乳铁蛋白免疫亲和柱用20mM PH7.4 PBS缓冲液洗涤3个柱体积。

4.将上述过滤后的牛初乳加入到乳铁蛋白免疫亲和柱中，调节流速为1滴/秒，直至乳样全部流过。

5.用20mM PH7.4 PBS洗涤亲和柱10个柱体积，直至无蛋白流出。

6.用100mM PH3.0的甘氨酸缓冲液洗脱亲和柱，收集洗脱液3个柱体积。

7.洗脱产物用于SDS-PAGE检测，结果见图3。

8.洗脱产物用HPLC检测，结果见图4。

9.继续用用100mM PH3.0的甘氨酸缓冲液洗脱亲和柱5个柱体积。

10.用20%的乙醇洗脱亲和柱10个柱体积，然后放冰箱保存。

11.检测结果

从SDS-PAGE检测结果可以看出，样品中乳铁蛋白经过纯化后，纯度达到95%以上。从HPLC图谱可以看出，乳铁蛋白纯化后，在HPLC上检出单一峰，表明纯度很高。

实施例3：利用乳铁蛋白免疫亲和柱从奶粉中纯化乳铁蛋白

1.牛初乳样品处理

1)称取奶粉样品5g，溶于20ml 20mM PBS，颠倒混匀，使样品完全溶解。

2)将冷冻离心机设置到4℃，8000转每分钟，待离心机温度降至所设置温度，将样品与配平样品放入离心机，离心10分钟。

3)离心后轻轻取出，上层有脂质，下面有沉淀，用大量程的移液枪将中间液体部分吸出，注意不要吸取上层脂质和下层沉淀。

4)4.将所得到的液体用0.45um的虑膜过滤，即可上样使用。

2.将乳铁蛋白免疫亲和纯化柱室温平衡10分钟。

3.将乳铁蛋白免疫亲和柱用20mM PH7.4 PBS缓冲液洗涤3个柱体积。

将上述过滤后的牛初乳加入到乳铁蛋白免疫亲和柱中，调节流速为1滴/秒，直至乳样全部流过。

5.用20mM PH7.4 PBS洗涤亲和柱10个柱体积，直至无蛋白流出。

6.用100mM PH3.0的甘氨酸缓冲液洗脱亲和柱，收集洗脱液3个柱体积。

7.洗脱产物用于SDS-PAGE检测，结果见图5。

8.洗脱产物用HPLC检测，结果见图6。

9.继续用用100mM PH3.0的甘氨酸缓冲液洗脱亲和柱5个柱体积。

10.用20%的乙醇洗脱亲和柱10个柱体积，然后放冰箱保存。

11.检测结果：从SDS-PAGE检测结果可以看出，样品中乳铁蛋白经过纯化后，纯度达到95%以上。

SEQUENCE LISTING

<110>北京美正生物科技有限公司

<120>一种分离纯化乳铁蛋白的免疫亲和柱及其制备方法和用途

<130>1

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>516

<212>PRT

<213>PSA蛋白（protein PSA）

<400>1

Met Lys Lys Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Arg Lys Leu Gly Val Gly Ile

1 5 1015

Ala Ser Val Thr Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser Gly Gly Val Thr Pro

202530

Ala Ala Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr

354045

Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe

505560

Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly

65707580

Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln

859095

Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu

100 105 110

Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser

115 120 125

Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys

130 135 140

Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys

145 150 155 160

Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn

165 170 175

Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser

180 185 190

Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln

195 200 205

Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe

210 215 220

Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly

225 230 235 240

Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu

245 250 255

Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn

260 265 270

Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu

275 280 285

Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys

290 295 300

Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu

305 310 315 320

Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys

325 330 335

Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys

340 345 350

Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys

355 360 365

Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys

370 375 380

Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys

385 390 395 400

Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys

405 410 415

Glu Asp Gly Asn Gly Val His Val Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Asn

420 425 430

Asp Ile Ala Lys Ala Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys Ile Ala Ala Asp

435 440 445

Asn Lys Leu Ala Asp Lys Asn Met Ile Lys Pro Gly Gln Glu Leu Val

450 455 460

Val Asp Lys Lys Gln Pro Ala Asn His Ala Asp Ala Asn Lys Ala Gln

465 470 475 480

Ala Leu Pro Glu Thr Gly Glu Glu Asn Pro Phe Ile Gly Thr Thr Val

485 490 495

Phe Gly Gly Leu Ser Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg

500 505 510

Arg Arg Glu Leu

515