3D打印海藻酸钠/聚乙烯醇全物理交联双网络水凝胶支架的方法

摘要

本发明公开了一种3D打印海藻酸钠/聚乙烯醇全物理交联双网络水凝胶支架的方法。技术方案包括含有SA/PVA的混合溶液加入气相二氧化硅混合后制成具有触变性能的溶胶，并以此作为打印材料进行3D打印得到溶胶支架，然后将溶胶支架先冷冻使聚合物PVA引发聚合并充分交联成一重网络得到预成型的凝胶支架，然后取出室温解冻，再将预成型的凝胶支架浸泡在CaCl2水溶液中，使SA充分交联成另一重凝胶网络，得到水凝胶支架。本发明工艺简单、生产流程短、控制简便、生产成本低、可靠性好的3D打印海藻酸钠/聚乙烯醇全物理交联双网络水凝胶支架的方法，得到的水凝胶支架无毒、机械性能优良、吸水率高和生物相容性好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高分子材料的3D打印技术领域，具体的说是一种3D打印海藻酸钠/聚乙烯醇全物理交联双网络水凝胶支架的方法。

背景技术

当前人体组织和器官的重建，已从短寿命的修复发展到永久性的修复和替换，从简单的机械固定发展到重建具有生命的人体组织，组织工程医学也有望进入制造组织和器官的新时代。3D打印是一种新型增材制造方法，通过一层一层把材料堆砌成模型所需的形状。由于生物组织形态的复杂性，3D打印制备水凝胶生物医学组织工程材料有重要的意义。由于水凝胶一般力学性能较差，且化学交联的水凝胶还存在组织相容性差的缺点，无法满足使用的要求。理想的水凝胶支架材料应该具有如下特征：1.支架内部应具有相互贯通的三维网络结构，以利于细胞生长时营养物质的输送及代谢产物的排出；2.支架本身应具有良好的生物相容性及可控的降解性，以使其被新生成的组织所替代，以此来达到修复受损组织或器官的目的；3.支架应具有合适的表面化学性能，以适应细胞的粘附、增殖及分化；4.支架应具有较高的力学性能来承受消毒灭菌或在体内进行组织修复时所受到的外力作用。

中国专利公开号为CN 103205107A公开了一种富有韧性的高粘结度3D打印成型材料及其制备方法，该方法是以聚酰胺树脂为基料，通过加入合适颜填料及粘结剂，虽然制备出了粘结强度较好牢固度较高的韧性三维支架，但该发明没有解决与生物良好相容性问题。而且细胞无法在此支架上增殖及分化。中国专利公开号为CN101544767A公开了一种生物相容性高强度连通多孔PVA水凝胶的制备方法，该发明采用高温高压溶融、表面活性剂与可溶性固体颗粒复合致孔、循环冷冻溶融物理交联成型、超声波清洗的工艺方法制备三维多孔聚乙烯醇水凝胶支架。该发明虽然具有较高孔隙度，孔径也很均匀，但力学性能无法满足生物组织材料的需要。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种工艺简单、生产流程短、控制简便、生产成本低、可靠性好的3D打印海藻酸钠/聚乙烯醇全物理交联双网络水凝胶支架的方法，得到的水凝胶支架无毒、机械性能优良、吸水率高和生物相容性好。

本发明方法包括以下步骤：

步骤1：原料的准备，包括如下子步骤：

子步骤1.1：溶胶的配制：将SA(海藻酸钠)加入去离子水中搅拌分散，置于65℃恒温水域中冷凝回流1～2小时，至SA完全溶解，得到SA溶液；

子步骤1.2：将PVA(聚乙烯醇)树脂加入去离子水中搅拌分散，置于95℃恒温水域中冷凝回流2～3小时，至PVA完全溶解，得到PVA溶液；

子步骤1.3：将子步骤(1.1)的SA溶液与子步骤(1.2)的PVA溶液混合，搅拌均匀，得到含有SA/PVA混合溶液,混合溶液中SA：PVA：去离子水的摩尔比为1：(30～70)：(4.33～7.30)。

子步骤1.4：将子步骤(1.3)所得的混合溶液脱气后缓慢的加入气相二氧化硅中，并搅拌均匀，得到具有触变性能的溶胶；

步骤2：3D打印成型：

以步骤1得到的溶胶作为打印材料，通过3D打印成型方法得到溶胶支架；

步骤3：支架的后处理：

将打印出的溶胶支架置于冷冻室冷冻，使聚合物PVA引发聚合并充分交联成一重网络得到预成型的凝胶支架，然后取出室温解冻，再将预成型的凝胶支架浸泡在CaCl₂水溶液中，使SA充分交联成另一重凝胶网络，得到水凝胶支架。

所述子步骤1.4中，所述混合溶液与气相二氧化硅的质量比为(16～20):1。

所述气相二氧化硅的粒径范围为20～100nm

所述步骤1.3中，所述混合溶液中SA：PVA：去离子水的摩尔比为1：(30～70)：(4.33～7.30)。

所述步骤(3)中控制冷冻室的冷冻温度为-20℃～-40℃，冷冻时间为20～24小时，室温解冻时间为1～2小时；所述CaCl₂水溶液的浓度为0.1～1mol/L。

所述3D打印成型方法包括利用机器人点胶机驱动医用注射器连接精细针管或移液管滴头将所述打印材料挤出进行3D打印，得到溶胶支架。

所述3D打印成型方法中，控制以下参数进行3D打印：

点胶机挤出速率(体积流率)0.5～1mm³/s

XY轴平台移动速率180mm～250mm/min

Z轴步进高度 0.3mm～0.6mm

所述精细针管或移液管滴头的内孔直径为0.1～0.5mm。

所述水凝胶支架为三维多孔水凝胶支架。

由于水凝胶支架主要应用于生物医疗领域的软骨修复支架，安全无毒及生物相溶性非常重要，在原料选择时，则会有更多的限制，另一方面，水凝胶支架植入体内时，其机械性能和吸水率与支架使用寿命和可靠性息息相关，获得高强度、长寿命的支架是技术人员追求的目标。本申请采用3D打印技术与双网络高强度水凝胶制备技术结合的方法，制备出了一种用于工程软骨修复的水凝胶支架。该支架是由SA/PVA双网络结构水凝胶打印而成的，在打印出聚合物溶胶支架后，先采用冷冻的方式使第一层网络充分交联，然后放入CaCl₂溶液中使SA充分交联，整个方法无化学交朕，而是采用全物理交联形成双网络结构水凝胶，从而保证了支架的精细结构，且使强度大幅度提高，得到的支架具有与正常软骨组织相符的宏观形貌和力学性能，良好的生物相容性、以及更易打印形成理想的三维多孔结构。

为了得到高强度水凝胶支架，发明人发现SA/PVA混合溶液中SA/PVA的比例非常重要，SA：PVA：去离子水的摩尔比应严格控制在1：(30～70)：(4.33～7.30)，SA：PVA的摩尔比过高会导致韧性降低，摩尔比过低会导致拉伸强度和断裂伸长率同时降低，优选的SA：PVA：去离子水的摩尔比应为1：(30～70)：(4.33～7.30)。

进一步地，向脱气后的混合溶液中加入了纳米无机粉体——气相二氧化硅，利用了气体二氧化硅具有增稠性和触变性的特性，一方面，气体二氧化硅的添加对混合溶液起到一定的增稠效果，添加后能与SA和PVA携同，增加水凝胶支架的强度；另一方面，由于纳米无机粉体表面具有很多高活性的硅羟基，表面硅羟基能够通过氢键与水发生强烈的作用而充满于整个体系，使得体系的粘度增加的同时，还提高了触变性和水凝胶支架的吸水率。所述混合溶液与气相二氧化硅的质量比为(15～20):1，气相二氧化硅的添加量过多会导致体系触变性能降低，难以挤出，过少会导致支架难以成型；所述气相二氧化硅的粒径范围优选为20～100nm，粒径过大会导致二氧化硅在溶胶中难以分散均匀，挤出时易堵塞针头，进而影响支架的完整性，粒径过小将导致成本过高。在此粒径范围内具有易成型成本低的优点。

为了进一步提高支架强度，发明人对3D打印后的物理交联过程进行研究，发现应对溶胶支架进行冷冻，使聚合物PVA引发聚合并充分交联成一重网络得到预成型的凝胶支架，然后再放入CaCl₂溶液中使SA充分交联，采用上述交联顺序有利于进一步提高支架的强度，以获得理想的三维多孔结构，也进一步避免成型支架坍塌问题的发生。

所述3D打印成型方法可以采用本领域中打印组织工程软骨修复支架用常用的各种3D打印方法，本领域技术人员可以在现有3D打印设备中进行合理选择，考虑便捷可靠、打印简单等因素，优选采用机器人点胶机驱动医用注射器连接精细针管或移液管滴头将所述打印材料挤出进行3D打印的方法，针对本发明材料，优选控制以下参数进行3D打印：

所述精细针管或移液管滴头的内孔直径为0.1～0.5mm。

所述水凝胶支架可以为长方体或圆柱体或其它可实现的形状，组成所述水凝胶支架的水凝胶线条截面直径优选为0.3～1mm。

有益效果：

(1)本发明的生物支架采用基体材料PVA和SA聚合物，均具有良好的生物相容性，二者通过全物理交联得到高强度且具生物相容性的双网络水凝胶支架；

(2)本发明在生物支架的制备过程中没有引入任何有毒及污染的物质；

(3)本发明采用3D打印配合有效的双物理交联方法，实现了高含水生物支架结构以及内部孔隙的可控，便于支架在细胞培养过程中营养物质、细胞代谢产物的流通与排泄。

(4)制备的水凝胶支架较同类3D打印的水凝胶支架相比，机械性能优良、强度高、精度好、吸水率高，使用寿命长。

附图说明

图1为实施例(1)中水凝胶支架荧光显微俯视图。

图2为实施例(1)中水凝胶支架宏观图。

具体实施方式

实施例1

步骤1：双网络水凝胶支架材料的准备，包括如下子步骤：

子步骤1.1：溶胶的配制：取2g海藻酸钠(SA)加入38g去离子水中搅拌分散，置于65℃恒温水域中冷凝回流1～2小时，至海藻酸钠(SA)完全溶解，得到海藻酸钠溶液；

子步骤1.2：取13.332g聚乙烯醇(PVA)树脂加入40g去离子水中搅拌分散，置于95℃恒温水域中冷凝回流2～3小时，至PVA完全溶解，得到PVA溶液；

子步骤1.3：子步骤(1.1)的SA溶液与子步骤(1.2)的PVA溶液充分混合搅拌均匀，得到SA/PVA混合溶液。

子步骤1.4：将子步骤(1.3)所得的混合溶液于95℃真空干燥箱内脱气0.5h，脱气完毕，将93.332g混合溶液缓慢的加入4.667g粒径为20nm的气相二氧化硅(SiO₂)中，并搅拌均匀，使混合溶液与气相二氧化硅的质量比为20:1，得到具有触变性能的溶胶。

步骤2：利用机器人点胶机驱动医用注射器连接移液管滴头挤出溶胶，调节XY轴平台移动速率为180mm/min，Z轴步进高度为0.3mm，点胶机挤出体积流率为1.0mm³/s，3D成型得到溶胶支架样品。

步骤3：支架的后处理

将溶胶支架样品置于-25℃，冷冻室冷冻20小时，取出后室温解冻2小时，然后将解冻后的预成型凝胶支架放入浓度为0.1mol/L的CaCl₂溶液中12小时，得到水凝胶支架样品。

测得凝胶支架的拉伸强度为0.235MPa，伸长率为204％。

样品外形为方体，测得其外形尺寸为：长×宽×高＝30×30×2mm；组成支架的水凝胶线条截面直径为0.6mm；内部孔洞为正四边形，边长为0.4mm。

图1为实施例1中水凝胶支架荧光显微俯视图；图2为实施例1中水凝胶支架宏观图。由图1和图2看出，支架的成型效果较好，没有出现坍塌现象。支架的孔隙尺寸在300um～700um之间，凝胶纤维丝的直径也在300um～700um之间。该支架内部具有相互贯通的三维网络结构，这种三维网络结构有利于细胞生长时营养物质的输送及代谢产物的排出。

实施例2

步骤1：双网络水凝胶支架材料的准备，包括如下子步骤：

子步骤1.1：溶胶的配制：取2g海藻酸钠(SA)加入38g去离子水中搅拌分散，置于65℃恒温水域中冷凝回流1～2小时，至海藻酸钠(SA)完全溶解，得到海藻酸钠溶液；

子步骤1.2：取22.22g聚乙烯醇(PVA)树脂加入66.667g去离子水中搅拌分散，置于95℃恒温水域中冷凝回流2～3小时，至PVA完全溶解，得到PVA溶液；

子步骤1.3：子步骤(1.1)SA溶液与子步骤(1.2)的PVA溶液混合搅拌均匀，得到SA/PVA混合溶液。

子步骤1.4：将子步骤(1.3)所得的混合溶液于95℃真空干燥箱内脱气0.5h，脱气完毕，将93.332g混合溶液缓慢的加入5.833g粒径为50nm气相二氧化硅(SiO₂)中，并搅拌均匀，使混合溶液与气相二氧化硅的质量比为16:1，得到具有触变性能的溶胶。

步骤2：利用机器人点胶机驱动医用注射器连接移液管滴头挤出溶胶，调节XY轴平台移动速率为220mm/min，Z轴步进高度为0.5mm，点胶机挤出体积流率为1.0mm³/s，3D成型得到溶胶支架样品。

步骤3：支架后处理

将溶胶支架样品置于-25℃冷冻室冷冻24小时，取出后室温解冻1小时，然后将解冻后的预成型凝胶支架放入浓度为0.5mol/L的CaCl₂溶液中12小时，得到水凝胶支架样品。

测得凝胶支架的拉伸强度为0.227MPa，伸长率为242％。

样品外形为方体，测得其外形尺寸为：长×宽×高＝30×30×2mm；组成支架的水凝胶线条截面直径为0.6mm；内部孔洞为正四边形，边长为0.4mm。

实施例3

步骤1：双网络水凝胶支架材料的准备，包括如下子步骤：

子步骤1.1：溶胶的配制：取2g海藻酸钠(SA)加入38g去离子水中搅拌分散，置于65℃恒温水域中冷凝回流1～2小时，至海藻酸钠(SA)完全溶解，得到海藻酸钠溶液；

子步骤1.2：取26.667g聚乙烯醇(PVA)树脂加入80g去离子水中搅拌分散，置于95℃恒温水域中冷凝回流2～3小时，至PVA完全溶解，得到PVA溶液；

子步骤1.3：子步骤(1.1)的SA溶液与子步骤(1.2)的PVA溶液充分混合，并搅拌均匀，得到均相混合溶液。

子步骤1.4：将子步骤(1.3)所得的混合溶液于95℃真空干燥箱内脱气0.5h，脱气完毕，将146.667g混合溶液缓慢的加入8.63g粒径为100nm气相二氧化硅(SiO₂)中，并搅拌均匀，使混合溶液与气相二氧化硅的质量比为17:1，得到具有触变性能的溶胶。

步骤2：利用机器人点胶机驱动医用注射器连接移液管滴头挤出溶胶，调节XY轴平台移动速率为240mm/min，Z轴步进高度为0.5mm，点胶机挤出体积流率为1.0mm³/s，3D成型得到溶胶支架样品。

步骤3：支架后处理

将溶胶支架样品置于-25℃冷冻室冷冻22小时，取出后室温解冻2小时，然后将解冻后的预成型凝胶支架放入浓度为0.6mol/L的CaCl₂溶液中12小时，得到水凝胶支架样品。

测得凝胶支架的拉伸强度为0.309MPa，伸长率为222％。

样品外形为方体，测得其外形尺寸为：长×宽×高＝30×30×2mm；组成支架的水凝胶线条截面直径为0.5mm；内部孔洞为正四边形，边长为0.5mm。

实施例4

步骤1：双网络水凝胶支架材料的准备，包括如下子步骤：

子步骤1.1：溶胶的配制：取2g海藻酸钠(SA)加入38g去离子水中搅拌分散，置于65℃恒温水域中冷凝回流1～2小时，至海藻酸钠(SA)完全溶解，得到海藻酸钠溶液；

子步骤1.2：取31.11g聚乙烯醇(PVA)树脂加入93.333g去离子水中搅拌分散，置于95℃恒温水域中冷凝回流2～3小时，至PVA完全溶解，得到PVA溶液；

子步骤1.3：子步骤(1.1)的SA溶液与子步骤(1.2)的PVA溶液充分混合，并搅拌均匀，得到均相混合溶液。

子步骤1.4：将子步骤(1.3)所得的混合溶液于95℃真空干燥箱内脱气0.5h，脱气完毕，将164.444g混合溶液缓慢的加入9.14g无机粉体气相二氧化硅(SiO₂)中，并搅拌均匀，使混合溶液与气相二氧化硅的质量比为18:1，得到具有触变性能的溶胶。

步骤2：利用机器人点胶机驱动医用注射器连接移液管滴头挤出溶胶，调节XY轴平台移动速率为250mm/min，Z轴步进高度为0.6mm，点胶机挤出体积流率为1.0mm³/s，3D成型得到溶胶支架样品。

步骤3：支架后处理

将溶胶支架样品置于-25℃冷冻室冷冻20小时，取出后室温解冻1.5小时，然后将解冻后的预成型凝胶支架放入浓度为1mol/L的CaCl₂溶液中12小时，得到水凝胶支架样品。

测得凝胶支架的拉伸强度为0.218MPa，伸长率为230％。

样品外形为方体，测得其外形尺寸为：长×宽×高＝30×30×2mm；组成支架的水凝胶线条截面直径为0.5mm；内部孔洞为正四边形，边长为0.4mm。

比较例1

步骤1：将10gPVA树脂与30g去离子水，置于95℃恒温水浴中冷凝回流2小时，充分搅拌至PVA完全溶解；

步骤2：将步骤(1)所得的PVA溶液置于95℃真空干燥箱内脱气30分钟，脱气完后，将40g PVA溶液缓慢加入2g气相二氧化硅(SiO₂)中，并进行搅拌，得到具有触变性能的溶胶；

步骤3：利用机器人点胶机驱动医用注射器连接移液管滴头挤出溶胶，调节XY轴平台移动速率为190mm/min，Z轴步进高度为0.3mm，点胶机挤出体积流率为1.0mm³/s，3D成型得到溶胶支架样品。

步骤3：支架后处理

将溶胶支架样品置于-25℃冷冻室冷冻20小时，取出后室温解冻2小时，得到水凝胶支架样品。

测得凝胶支架的拉伸强度为0.06MPa,伸长率为120％。

样品外形为方体，测得其外形尺寸为：长×宽×高＝10×10×2mm；组成支架的水凝胶线条截面直径为0.5mm；内部孔洞为正四边形，边长为0.3mm。

比较例2

步骤1：将2gSA与38g去离子水，置于65℃恒温水浴中冷凝回流1小时，充分搅拌至SA完全溶解；

步骤2：将步骤(1)所得的PVA溶液置于95℃真空干燥箱内脱气30分钟，脱气完后，将40gSA溶液缓慢加入2g气相二氧化硅(SiO₂)中，并进行搅拌，得到具有触变性能的溶胶；

步骤3：利用机器人点胶机驱动医用注射器连接移液管滴头挤出溶胶，调节XY轴平台移动速率为200mm/min，Z轴步进高度为0.3mm，点胶机挤出体积流率为1.0mm³/s，3D成型得到溶胶支架样品。

步骤3：支架后处理

将成型的支架置于1mol/L的CaCl₂溶液中浸泡12小时，得到水凝胶支架样品。

测得凝胶支架的拉伸强度为0.1MPa,伸长率为20％。

样品外形为方体，测得其外形尺寸为：长×宽×高＝10×10×2mm；组成支架的水凝胶线条截面直径为0.3mm；内部孔洞为正四边形，边长为0.3mm。

比较例3

步骤1：双网络水凝胶支架材料的准备，包括如下子步骤：

子步骤1.1：溶胶的配制：取1g海藻酸钠(SA)加入19g去离子水中搅拌分散，置于65℃恒温水域中冷凝回流2个小时，至海藻酸钠(SA)完全溶解，得到海藻酸钠溶液；

子步骤1.2：取20g聚乙烯醇(PVA)树脂加入60g去离子水中搅拌分散，置于95℃恒温水域中冷凝回流3小时，至PVA完全溶解，得到PVA溶液；

子步骤1.3：子步骤(1.1)的SA溶液与子步骤(1.2)的PVA溶液充分混合搅拌均匀，得到SA/PVA混合溶液。

子步骤1.4：将子步骤(1.3)所得的混合溶液于95℃真空干燥箱内脱气0.5h，脱气完毕，将100g混合溶液缓慢的加入5g粒径为20nm的气相二氧化硅(SiO₂)中，并搅拌均匀，使混合溶液与气相二氧化硅的质量比为20:1，得到具有触变性能的溶胶。

步骤2：利用机器人点胶机驱动医用注射器连接移液管滴头挤出溶胶，调节XY轴平台移动速率为180mm/min，Z轴步进高度为0.3mm，点胶机挤出体积流率为1.0mm³/s，3D成型得到溶胶支架样品。

步骤3：支架后处理

将溶胶支架样品置于-25℃冷冻室冷冻20小时，取出后室温解冻2小时，然后将解冻后的预成型凝胶支架放入浓度为0.1mol/L的CaCl₂溶液中12小时，得到水凝胶支架样品。

测得凝胶支架的拉伸强度为0.195MPa，伸长率为184％。

样品外形为方体，测得其外形尺寸为：长×宽×高＝30×30×2mm；组成支架的水凝胶线条截面直径为0.6mm；内部孔洞为正四边形，边长为0.5mm。

比较例4

步骤1：双网络水凝胶支架材料的准备，包括如下子步骤：

子步骤1.1：溶胶的配制：取2g海藻酸钠(SA)加入38g去离子水中搅拌分散，置于65℃恒温水域中冷凝回流2个小时，至海藻酸钠(SA)完全溶解，得到海藻酸钠溶液；

子步骤1.2：取22.22g聚乙烯醇(PVA)树脂加入66.66g去离子水中搅拌分散，置于95℃恒温水域中冷凝回流3小时，至PVA完全溶解，得到PVA溶液；

子步骤1.3：子步骤(1.1)的SA溶液与子步骤(1.2)的PVA溶液充分混合搅拌均匀，得到SA/PVA混合溶液。

子步骤1.4：将子步骤(1.3)所得的混合溶液于95℃真空干燥箱内脱气0.5h，脱气完毕，将100g混合溶液缓慢的加入5g粒径为20nm的气相二氧化硅(SiO₂)中，并搅拌均匀，使混合溶液与气相二氧化硅的质量比为20:1，得到具有触变性能的溶胶。

步骤2：利用机器人点胶机驱动医用注射器连接移液管滴头挤出溶胶，调节XY轴平台移动速率为180mm/min，Z轴步进高度为0.3mm，点胶机挤出体积流率为1.0mm³/s，3D成型得到溶胶支架样品。

步骤3：支架后处理

将溶胶支架样品放入浓度为0.1mol/L的CaCl₂溶液中12小时，使其充分交联，然后再置于-25℃冷冻室冷冻20小时，取出后室温解冻2小时，最后浸泡在去离子水中3个小时，得到水凝胶支架样品。从去离子水中取出支架，发现支架出现大面积的坍塌和胀破，孔隙大小不均且有部分孔隙因凝胶纤维丝胀大而消失。

表1：PVA、SA与SA/PVA凝胶支架的线条直径、线条间距、拉伸应力及拉伸应变。

通过以上比较例和实施例可以看出：

以上通过二氧化硅改性的四种不同配比的SA/PVA复合溶液均能通过机器人点胶机驱动医用注射器来3D成型水凝胶支架，可方便的设计支架的外部形貌、精细的调控支架内部空隙的贯通，同时制备过程中没有引入其他有害的化学品，保留SA/PVA水凝胶无毒、机械性能优良、吸水率高和生物相容性好等良好性能。