连翘酯苷B与金石蚕苷配伍组合物及其应用

摘要

本发明公开了一种治疗出血症的药物组合，主要由连翘酯苷B与金石蚕苷配伍组成，连翘酯苷B和金石蚕苷配伍的组合物由下列重量比的药物均匀混合制成：连翘酯苷B1~5份，金石蚕苷1~5份，该药物组合物在止血作用上具有协同增效作用，机制明确，可用于止血药物。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体是连翘酯苷B与金石蚕苷配伍组合物及其应用。

背景技术

出血是指血液从血管或心脏外出至组织间隙、体腔或身体表面。出血可以导致出血性休克、贫血，紫癜，也能够引起局部组织破坏和功能障碍，如大脑内囊出血可以引起对侧肢体偏瘫，视网膜出血引起失明。出血原因复杂，可造成阴血亏虚，机体衰弱，其涉及内科和外科。对于内科或外科的出血病症，如不及时有效地控制出血现象，严重者可危及生命。目前临床上应用止血药存在较为严重的副作用：如血凝酶大剂量时引起纤维蛋白原降低，血液粘滞度下降以及静脉血栓形成；氨甲环酸则导致血栓形成，因而禁用于尿道手术；抑肽酶则明显增高过敏反应的发生率以及增加肾功能衰竭、心肌梗死、心脏衰竭、中风风险及死亡率，限制了它们在临床上的广泛应用。因此，利用毒副作用小的天然活性物质治疗各种出血症的研究越来越受到重视。

广东紫珠(Callicarpa>Chun)为马鞭草科(Verbenaceae)紫珠属(Callicarpa>L.)植物，具有收敛止血，散瘀，清热解毒之功效。用于衄血，咯血，吐血，便血，崩漏，外伤出血等，为民间临床妇科及各科出血症的常用药物。发明人从临床治疗各种出血症疗效确切的广东紫珠药材出发，筛选出广东紫珠总苯乙醇苷具有止血作用，化学研究表明，广东紫珠总苯乙醇苷中化学成分复杂，主要含有连翘酯苷B和金石蚕苷。然而，单方连翘酯苷B、金石蚕苷对小鼠出血和凝血时间作用不明显。因此，发明人在前期研究基础上，以小鼠出血和凝血时间为指标，选择连翘酯苷B与金石蚕苷两个有效成分进行新配伍组合，发现连翘酯苷B与金石蚕苷配伍能明显缩短小鼠的出血时间和凝血时间，具有显著止血作用。

发明内容

本发明提供了治疗出血症的一种连翘酯苷B与金石蚕苷配伍的药物组合物。

连翘酯苷B与金石蚕苷配伍的药物组合物，连翘酯苷B与金石蚕苷重量份之比为1~5:1~5。

连翘酯苷B与金石蚕苷配伍的药物组合物可直接药用，或添加合适的辅料制成片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂、注射剂等各种剂型进行使用。

本发明通过连翘酯苷B配伍金石蚕苷对小鼠出血和凝血时间进行研究，发现两者具有协同增效作用(单用连翘酯苷B、金石蚕苷止血作用不明显)。

本发明确证了连翘酯苷B与金石蚕苷配伍药物止血作用是通过增加血小板数量，减少出血时间，达到止血的目的。

本发明中的原料连翘酯苷B和金石蚕苷按照下述方法制备：取广东紫珠药干燥茎枝和叶粗粉，以水浸润，8~12倍量溶剂回流热提取2~4次，每次1~3小时，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度为1.10~1.25，依次用等体积的乙酸乙酯、水饱和正丁醇分别萃取三次，收集正丁醇提取液，减压浓缩至干。正丁醇提取浸膏水溶后上D101大孔树脂柱，分别采用水、30%乙醇、50%乙醇、95%乙醇洗脱，收集30%乙醇部分，减压浓缩至干，加入等量反相硅胶拌样，经中压制备液相色谱柱，以乙腈-水(85:15)等度洗脱，每500mL为一馏分，收集相应馏分，合并，减压浓缩，馏分13~22得到连翘酯苷B，馏分36~45得到金石蚕苷，得率分别为1%~2%和0.5%~1%，纯度均为92%~95%。

本发明的制备工艺方法为：以上两味，混合，加辅料适量，混匀，制成临床上可接受的口服制剂和注射剂。

本发明药物的片剂的制备方法是：取以上两味，加淀粉、羧甲基纤维素，制粒，压片，得到片剂；

本发明药物的胶囊剂的制备方法是：取以上两味，加淀粉、羧甲基纤维素，制粒，灌装，得到胶囊剂。

本发明的药物注射液的制备方法是：取以上两味，加水溶解、用氢氧化钠溶液调整pH值至6.0~8.0，过滤，滤液灭菌后灌封在安剖瓶中，灭菌，得到注射液。

附图说明

图1为连翘酯苷B、金石蚕苷单方及连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1；2:1)给药对小鼠出血时间的影响图；

注：与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；

1. 空白对照组 2. 阳性药组(云南白药) 3. 连翘酯苷B低剂量组4. 连翘酯苷B中剂量组5. 连翘酯苷B高剂量组 6. 金石蚕苷低剂量组 7. 金石蚕苷中剂量组 8.金石蚕苷高剂量组9. 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)低剂量组 10. 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)中剂量组 11. 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)高剂量组 12. 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(2:1)低剂量组 13. 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(2:1)中剂量组 14. 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(2:1)高剂量组。

图2为连翘酯苷B、金石蚕苷单方及连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1；2:1)给药对小鼠凝血时间的影响图。

注：与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；

1. 空白对照组 2. 阳性药组(云南白药) 3. 连翘酯苷B低剂量组4. 连翘酯苷B中剂量组5. 连翘酯苷B高剂量组 6. 金石蚕苷低剂量组 7. 金石蚕苷中剂量组 8.金石蚕苷高剂量组9. 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)低剂量组 10. 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)中剂量组 11. 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)高剂量组 12. 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(2:1)低剂量组 13. 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(2:1)中剂量组 14. 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(2:1)高剂量组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述。必须说明下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：连翘酯苷B、金石蚕苷单方给药及连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1；2:1)给药对小鼠出血时间的影响

动物：km小鼠140只，雄性，体重20±2g，来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号:SCXK(湘)2011-0003。

试药：药物翘酯苷B和金石蚕苷为自制，含量均98%以上；云南白药(云南白药集团股份有限公司，批号：ZLA1425)；羧甲基纤维素钠(J&K scientific LTD，批号：L460M09)；水为纯化水。

试验方法：将小鼠固定，露尾于外，用手术刀片切割左侧尾静脉1/2处(严格控制切割深度深3mm宽2mm)，待血液自行溢出开始用秒表计时，每隔30s用滤纸吸去血滴一次，直至血流自然停止(滤纸吸时无血)为止，即为出血时间。

小鼠随机分为8组，每组10只，雄性。分别为空白对照组(0.5% CMC-Na)、连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1；2:1)低、中、高剂量组和阳性对照组(云南白药)。各组连续灌胃给药3天，末次给药1h后测小鼠的出血时间。各组试验数据见表1和图1。

试验结果：跟空白对照组相比，阳性药组(云南白药)的出血时间明显缩短(P＜0.01＝；连翘酯苷B、金石蚕苷单方给药低、中、高剂量组小鼠出血时间的影响来看，作用不明显(P＞0.05)。连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)给药中、高剂量组的出血时间明显缩短(P＜0.01)；连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(2:1)给药低、中剂量组的出血时间明显缩短(P＜0.01)；连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(2:1)给药高剂量组的出血时间明显缩短(P＜0.05)；

表1连翘酯苷B、金石蚕苷单方给药及连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1；2:1)给药对小鼠出血时间的影响(n>

注：与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；

实施例2：连翘酯苷B、金石蚕苷单方给药及连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1；2:1)给药对小鼠凝血时间的影响：

动物：km小鼠140只，雄性，体重20±2g，来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号:SCXK(湘)2011-0003。

试药：药物翘酯苷B和金石蚕苷为自制，含量均98%以上；云南白药(云南白药集团股份有限公司，批号：ZLA1425)；羧甲基纤维素钠(J&K scientific LTD，批号：L460M09)；水为纯化水。

试验方法：将小鼠固定，用内径为1mm的毛细管插入小鼠内眦球后静脉丛取血，达5cm血柱，平放桌面。每隔30s折断毛细管一小截，检查有无凝血出现。记录从毛细管采血到出现血凝丝的时间，即为凝血时间。

小鼠随机分为8组，每组10只，雄性。分别为空白对照组(0.5% CMC-Na)、连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1；2:1)低、中、高剂量组和阳性对照组(云南白药)。各组连续灌胃给药3天，末次给药1h后测小鼠的凝血时间。各组试验数据见表2和图2。

试验结果：跟空白对照组相比，阳性药组(云南白药)的出血时间明显缩短(P＜0.01)；连翘酯苷B、金石蚕苷单方给药低、中、高剂量组小鼠凝血时间的影响来看，作用不明显(P＞.05)；连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)给药低、中、高剂量组的凝血时间明显缩短(P＜0.01)；连翘酯苷B与金石蚕苷(2:1)配伍给药低、中剂量组的凝血时间明显缩短(P＜0.01)。表明连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1；2:1)有明显缩短出血时间和凝血时间。

表2连翘酯苷B、金石蚕苷单方给药及连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1；2:1)给药对小鼠凝血时间的影响(n>

注：与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；

实施例3：连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)给药对大鼠凝血四项及血小板计数的影响：

动物：SD大鼠50只，雄性，体重200~220g，来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号:SCXK(湘)2013-0004。

试药：药物翘酯苷B和金石蚕苷为自制，含量均98%以上；云南白药(云南白药集团股份有限公司，批号：ZLA1425)；羧甲基纤维素钠(J&K scientific LTD，批号：L460M09)；水为纯化水。

仪器：高速冷冻离心机(ST16R，Thermo Fisher 公司，德国)；全自动凝血分析仪(ACL 7000，Instrumentation Laboratory .Co，美国)；全自动五分类血液分析仪(TEK8510，江西特康科技有限公司)

试验方法：SD大鼠50只，雄性，随机分为5组。分别为空白对照组(0.5% CMC-Na)、连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)低(6mg/kg)、中(12mg/kg)、高剂量(24mg/kg)组和阳性对照组(云南白药，0.33g/kg)。各组每日分别灌胃给药，连续给药10天，末次给药1h后，用3%戊巴比妥将大鼠麻醉，打开大鼠腹腔，暴露腹主动脉，用一次性头皮针接于3.8%枸橼酸钠抗凝真空采血管及EDTA抗凝真空采血管腹主动脉取血，轻轻混匀。置于3.8%枸橼酸钠抗凝真空采血管中的全血，4℃ 3000rpm离心10分钟，取上清液，采用ACL7000全自动凝血分析仪测凝血四项指标；置于EDTA抗凝真空采血管中的全血，采用全自动血细胞分析仪观察血小板的变化。结果见表3和4。

试验结果：跟空白对照组相比，连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)各剂量组APTT、PT时间明显缩短(P＜0.01)，其中低剂量组(P＜0.05)；其可能是通过增加血小板数量，减少出血时间，达到止血的目的。

表3 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)给药对大鼠凝血四项指标的影响(n=>)

注：与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；

表4 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)给药对大鼠血小板计数的影响(n=>)

注：与空白对照组比较**P＜0.01；

实施例4：连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)给药ELISA法检测TAT、P-选择素、TXB2、6-K-PG对血小板的影响：

动物：SD大鼠50只，雄性，体重200~220g，来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号:SCXK(湘)2013-0004。

试药：药物连翘酯苷B和金石蚕苷为自制，含量均98%以上；云南白药(云南白药集团股份有限公司，批号：ZLA1425)；羧甲基纤维素钠(J&K scientific LTD，批号：L460M09)；水为纯化水。

仪器：高速冷冻离心机(ST16R，Thermo Fisher 公司，德国)；全自动凝血分析仪(ACL 7000，Instrumentation Laboratory .Co，美国)；全自动五分类血液分析仪(TEK8510，江西特康科技有限公司)

试验方法：大鼠随机分为5组，每组10只，雄性。分别为空白对照组(0.5% CMC-Na)、连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)低(6mg/kg)、中(12mg/kg)、高剂量(24mg/kg)组和阳性对照组(云南白药，0.33g/kg)。各组每日分别灌胃给药，连续给药10天，末次给药1h后，用3%戊巴比妥将大鼠麻醉，打开大鼠腹腔，暴露腹主动脉，用一次性头皮针接于3.8%枸橼酸钠抗凝真空采血管及EDTA抗凝真空采血管腹主动脉取血，轻轻混匀。分别用 EDTA 、3.8%枸橼酸钠(枸橼酸钠:血液 = 1：9)作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的 30 分钟内于2-8℃ 1000g 离心 15 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃ 或-80℃保存，但应避免反复冻融。采用ELISA法检测定血小板中TAT、P-选择素、TXB2、6-K-PG含量。结果见表5~8。

试验结果：连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)对血小板中凝血酶/抗凝血酶复合物、6-keto-PGFIa均无影响，无统计学意义(P>P>

表5 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)给药对大鼠血浆中TAT含量的影响(n>)

表6 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)给药对大鼠血浆中P-选择素含量的影响(n>)

表7 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)给药对大鼠血浆中TXB2含量的影响(n=10,)

表8 连翘酯苷B与金石蚕苷配伍(1:1)给药对大鼠血浆中6-K-PG含量的影响(n=10,)

实施例5：

取连翘酯苷B 1g，金石蚕苷1g，以注射用水加热搅拌以充分溶解，再加水至1000ml，调节pH值至7，搅匀，过滤分装于中性玻璃容器中，用流通蒸汽100℃30min灭菌，过滤，精滤，灌封，灭菌，检验，得注射液。

实施例6：

取连翘酯苷B 2g，金石蚕苷1.5g，加入淀粉、微晶纤维素、滑石粉、5%淀粉浆适量，混匀，制成颗粒，干燥，装入胶囊，质检包装即得。

实施例7：

取连翘酯苷B 1.2g，金石蚕苷2g，加入淀粉、微晶纤维素、滑石粉、5%淀粉浆适量，混匀，制成颗粒，干燥，压片，质检包装即得。

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