一种带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒，及其制备方法和应用。所述带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒包括表面修饰有活性官能团的掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒及在其表面修饰的苯硼酸类衍生物和末端带有羟基的保护分子。所述表面修饰有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒对糖类物质能够特异性吸附的，可以消除其他干扰物的非特异性吸附，有效去除其中的蛋白和多肽等非特异性干扰物，快速灵敏的对低丰度的糖类样品进行分析。

说明书

技术领域

本发明涉及带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒及其制备方法，以及所述带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒在特异性吸附糖类物质中的应用，尤其是在糖类物质的纯化分析方法中的应用。

背景技术

糖基化是真核细胞中最常见和最重要的翻译后修饰过程之一，在生物体各种功能的发挥中扮演着重要的角色。越来越多的证据表明，蛋白质糖基化以及糖类物质的异常表达与各种疾病和蛋白质的功能的正确发挥有着密切的联系，例如炎症，免疫疾病，肿瘤以及代谢综合征等。此外，葡萄糖和聚糖类化合物也是人类和动物的重要的能量来源。因此，对糖类物质的分析是非常重要的，但却充满挑战，因为糖类物质的分析涉及到一系列繁琐和复杂的生化步骤。传统的糖类的分离方法主要是亲和层析，这种方法不仅分离过程复杂，同时也很容易损失样品，因此，亲和层析对低丰度糖类样品的分析有一定的局限性。

目前，磁性纳米粒子因其比表面积大，在外加磁场条件下易于分离等特点，被广泛的应用于生物样品的分离纯化中。但由于糖类物质一般与蛋白或多肽类物质并存，在对纯糖类物质的纯化过程中，蛋白或多肽会在很大程度上影响纯糖类物质的纯化分析和研究。因此，现有的方法仍不能快速、灵敏地对低丰度纯糖类样品进行有效的分析。为了分析和富集纯糖类物质，我们需要尽可能多的除去样品中含有的多肽和蛋白等非特异性干扰物。

发明内容

本发明的目的是在于克服上述缺陷，提供了一种能够在较大程度上除去糖类物质样品中含有的多肽和蛋白等非特异性干扰物，且能够快速、灵敏地对低丰度纯糖类样品进行有效分析的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒及其制备方法，以及所述带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒在特异性吸附糖类物质中的应用，尤其是在糖类物质的纯化分析方法中的应用。

第一方面，本发明提供了一种带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒，其中，所述带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒包括磁性纳米颗粒以及在其表面修饰的苯硼酸功能基团和保护基团；

其中，所述磁性纳米颗粒是表面修饰有活性基团的掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒；

所述保护基团为末端带有羟基的保护分子。

第二方面，本发明提供了一种制备带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒的方法，其中，该方法包括：

(1)将磁性纳米颗粒与正硅酸乙酯接触获得掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒；

(2)将所述掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒与带有活性基团的硅烷偶联剂接触获得表面修饰有活性基团的掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒；

(3)将所述表面修饰有活性基团的掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒与苯硼酸类衍生物和保护基团接触，获得带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒；其中，所述保护基团为末端带有羟基的保护分子。

第三方面，本发明提供了如上所述的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒或如上所述的方法制备的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒在特异性吸附糖类物质中的应用。

第四方面，本发明提供了一种糖类物质的纯化分析方法，其中，该方法包括：将磁性纳米颗粒与待测样品接触获得接触后物料，并用质谱分析方法对接触后物料进行分析；

其中，所述待测样品中含有糖类物质；所述磁性纳米颗粒为如上所述的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒或如上所述的方法制备的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒。

本发明提供的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒能够对糖类物质进行特异性结合，有效去除其中的蛋白和多肽等非特异性干扰物，快速灵敏的对低丰度的糖类物质样品进行分析。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1：磁滞曲线，其中，曲线a为制备例制备的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒的磁滞曲线；曲线b为实施例1制备的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒的磁滞曲线。

图2：实施例1制备的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒对鸡卵清白蛋白中N糖链的纯化分析质谱图。

图3：对比例1制备的不带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒对鸡卵清白蛋白中N糖链的纯化分析质谱图。

图4：实施例1制备的带保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒对人乳中游离寡糖的纯化分析质谱图。其中，图4的内嵌图是图5从荷质比400到1800的局部放大。

图5：对比例1制备的不带保护基团的苯硼酸功能化超顺磁性纳米颗粒对人乳中游离寡糖的纯化分析质谱图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

第一方面，本发明提供了一种带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒，其中，所述带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒包括磁性纳米颗粒以及在其表面修饰的苯硼酸功能基团和保护基团；

其中，所述磁性纳米颗粒是表面修饰有活性基团的掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒；

所述保护基团为末端带有羟基的保护分子。

本发明中，所述磁性纳米颗粒优选为超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒。

本发明中，所述苯硼酸功能基团由苯硼酸类衍生物提供，所述苯硼酸类衍生物可以在较宽的范围内选择，例如，可以为带有活性可修饰基团的苯硼酸，优选的，所述带有活性可修饰基团的苯硼酸选自羧基苯硼酸、氨基苯硼酸或巯基苯硼酸中的一种或多种，更优选的，所述带有活性可修饰基团的苯硼酸选自2-氨基苯硼酸，2-羧基苯硼酸，3-巯基苯硼酸，3-氨基苯硼酸，3-羟基苯硼酸，3-羧基苯硼酸，4-巯基苯硼酸，4-氨基苯硼酸，4-羟基苯硼酸，4-羧基苯硼酸和4-(反式-2-羧基乙烯基)苯基硼酸中的一种或多种。

本发明中，所述末端带有羟基的保护分子可以在较宽的范围内进行选择，优选为，带有羟基的亲水链状分子，例如，带有可修饰活性基团的聚乙二醇，2-(2-氨基乙氧基)乙醇，2-(2-甲氧基乙氧基)乙硫醇，2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇，3-[2-(2-羟乙氧基)乙氧基]丙酸，2-(2-甲氧基乙氧基)乙硫醇，1-氨基-3,6,9-三噁-11-十一醇，1-巯基-3,6,9-三噁-11-十一醇和2-[2-(3-氨基丙 氧基)乙氧基]乙醇中的一种或多种。其中，所述聚乙二醇优选为短链聚乙二醇，所述短链聚乙二醇是指由2-5个乙二醇分子聚合而成的聚乙二醇。

根据本发明，尽管在磁性纳米颗粒的表面修饰有苯硼酸功能基团和保护基团即可以实现本发明的目的，但本发明的发明人发现，当磁性纳米颗粒表面修饰的苯硼酸功能基团和保护基团的摩尔比为1:1-3的范围时，能够进一步实现本发明的目的。

第二方面，本发明还提供了一种带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒的制备方法，其中，该方法包括：

(1)将磁性纳米颗粒与正硅酸乙酯接触获得掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒；

(2)将所述掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒与带有活性基团的硅烷偶联剂接触获得表面修饰有活性基团的掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒；

(3)将所述表面修饰有活性基团的掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒与苯硼酸类衍生物和保护基团接触，获得带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒；其中，所述保护基团为末端带有羟基的保护分子。

根据本发明，所述磁性纳米颗粒、苯硼酸类衍生物和末端带有羟基的保护分子的选择可以参照如上列举的范畴，但并不限于此，本发明再此不再详细赘述。

以下示例性的详细介绍如上的方法，但本发明并不受此限制，在本领域技术人员的认知范围内，能够进行等同变型且实现相同目的的制备方法均在本发明的保护范围内。

根据本发明，在步骤(1)中，所述磁性纳米颗粒与正硅酸乙酯的接触可以通过以下步骤进行：

将磁性纳米颗粒悬浮于乙醇中获得乙醇悬浮液1，然后将所述乙醇悬浮液1与氨水、水以及正硅酸乙酯接触，获得掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒； 其中，相对于100mg的所述磁性纳米颗粒，所述乙醇的用量为30-50ml，所述氨水的用量为3-5ml，所述水的用量为3-5ml，所述正硅酸乙酯的用量为0.04-0.06mL。

在步骤(2)中，所述掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒与带有活性基团的硅烷偶联剂的接触可以通过以下步骤进行：

将所述掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒悬浮于乙醇中获得乙醇悬浮液2(其中，相对于100mg的磁性纳米颗粒原料，乙醇的用量可以为20-30mL)，然后，将所述乙醇悬浮液2依次与氨水和带有活性基团的硅烷偶联剂进行接触，获得表面修饰有活性基团的掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒；其中，相对于1ml的所述乙醇悬浮液2，所述氨水的用量为0.04-0.06ml，带有活性基团的硅烷偶联剂的用量为0.001-0.002mL。

其中，所述活性基团可以为本领域公知的能够在硅烷偶联剂上修饰且修饰后能够具有目标活性的基团，例如，所述活性基团可以选自氨基，羧基，羟基和巯基一种或多种。基于此，所述带有活性基团的硅烷偶联剂优选选自3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-巯丙基三乙氧基硅烷、3-巯丙基三甲氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷一种或多种。

在步骤(3)中，以保护基团为2-(2-氨基乙氧基)乙醇为例进行说明所述表面修饰有活性基团的掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒与苯硼酸类衍生物和保护基团的接触：

将所述表面修饰有活性基团的掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒悬浮于二甲基甲酰胺溶液中获得悬浮液3，将所述悬浮液3与2-(7-偶氮苯并三氮锉)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟硫酸酯(HATU)、苯硼酸类衍生物和N,N’-二异丙基乙胺(DIEA)接触获得混合物1，将所述混合物1与丙二酸接触获得混合物2，再将所述混合物2和保护基团接触获得所述磁性纳米颗粒；在所述悬浮液3中，所述表面修饰有活性基团的掺杂有二氧化硅的磁性纳米颗粒 的浓度为4-6mg/mL重量％，相对于3ml所述悬浮液3，所述2-(7-偶氮苯并三氮锉)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟硫酸酯的用量为0.2-0.3mmol，所述苯硼酸类衍生物的用量为1-3mmol，所述N,N’-二异丙基乙胺的用量为4-6mmol，所述丙二酸的用量为21-3mmol，所述保护基团的量为1-3mmol。

其中，所述苯硼酸类衍生物和保护基团的用量能够使得制备的所述带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒表面的苯硼酸功能基团和保护基团的比例可为1:1-3。

第三方面，本发明提供了如上所述的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒或如上所述的方法制备的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒在特异性吸附糖类物质中的应用。

基于以上应用，第四方面，本发明提供了一种糖类物质的纯化分析方法，其中，该方法包括：将磁性纳米颗粒与待测样品接触获得接触后物料，并用质谱分析方法对接触后物料进行分析；其中，所述待测样品中含有糖类物质；所述磁性纳米颗粒为如上所述的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒或如上所述的方法制备的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒。

所述纯化分析方法可以通过以下步骤进行：(1)将带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒解于pH 8-9的碱性缓冲液中获得所述带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒的分散溶液，简称分散溶液A，相对于1mg的所述分散溶液A，所述碱性缓冲液的用量为100μL；(2)将所述分散溶液A与待测样品接触获得接触后物料；(3)用pH 8-9的碱性缓冲液冲洗所述接触后物料4-5次；(4)用三蒸水将经过冲洗的接触后物料悬浮获得悬浮液，相对于1mg的所述带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒，所述三蒸水的用量为10μL；(5)取1μL所述悬浮液与1μL 0.13M的2,5-二羟基苯甲酸混匀获得检测液；(6)对所述检测液进行质谱分析。

其中，所述碱性缓冲液为pH 8-9的氨水溶液，碳酸氢铵，氢氧化钠， 氢氧化钾等水溶液中的一种。

其中，糖类物质具有本领域公知的含义。典型地，糖类物质是对多羟基醛或多羟基酮及其缩聚物和某些衍生物的总称，一般由碳、氢与氧三种元素所组成，广布自然界。

本发明中所使用的质谱为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱，本仪器具有高灵敏性，易于操作，可以高通量的分析微量生物样品。磁滞曲线是通过物性测试仪在300K的温度下从-20000Oe到20000Oe的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒的磁性参数测试数据。

本发明还提供了超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒，其中，该方法包括以下步骤：(1)将四水合氯化亚铁和六水合氯化铁溶于盐酸中，然后进行剧烈搅拌，当其完全溶解于盐酸中后，向反应体系中逐滴加入氨水溶液，继续搅拌20-40min，得到超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒。在搅拌过程中，向反应体系中不断通入氮气，防止制得的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒被氧化。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。

以下通过实施例进一步详细说明本发明。

制备例1

超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备

向250mL三口烧瓶中加入25mL 2M的盐酸溶液，然后把2g四水合氯化亚铁(FeCl₂·4H₂O)和5.4g六水合氯化铁(FeCl₃·6H₂O)的混合样品加入到盐酸中，并通入氮气进行保护。将反应体系在室温条件下剧烈搅拌，待 FeCl₂·4H₂O和FeCl₃·6H₂O完全溶解后，向反应体系中逐滴加入30mL氨水溶液(28～30重量％)，滴加完毕后，继续将反应体系在室温条件下剧烈搅拌30分钟，得到超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒。将制得的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒用50mL三蒸水洗涤三次，最后将其保存到50mL的脱气的三蒸水中，浓度设为40mg/mL。

对比例1

不带有保护基团的苯硼酸磁性纳米颗粒的制备

(1)将5mL制备例所得的超顺磁性四氧化三铁磁性颗粒溶液重悬于80mL的乙醇，置于250mL三口烧瓶中，超声10分钟，使其完全分散。然后将其中先后加入8mL的氨水溶液，7.5mL的三蒸水以及0.1mL的正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate，TEOS)，于40℃剧烈搅拌4h，得到掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒。将所得的掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒用50mL的三蒸水洗涤三次，除去未掺杂二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒。最后将所得颗粒悬于50mL乙醇中。

(2)取20mL步骤(1)得到的掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒溶液，置于100mL三口烧瓶中，超声30min，然后逐滴加入1mL氨水溶液和0.03mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl)triethoxysilane,APS)，于室温条件下搅拌24h，磁性粒子表面被巯基化。将所得的氨基化的磁性纳米颗粒用30mL的三蒸水洗涤三次，除去未掺杂二氧化硅的磁性纳米颗粒。最后将所得颗粒悬于30mL二甲基甲酰胺(Dimethyl Formamide,DMF)中。

(3)取3mL表面氨基化的磁性粒子，超声30min使其充分分散。向反应体系中先后加入5mL HATU的DMF溶液(0.5M)，2.5mmol 4-羧基苯 硼酸和5mmol DIEA。在4℃条件下搅拌24h反应。反应完毕后，将所制得的不带有保护基团的4-羧基苯硼酸功能化磁性粒子用5mL三蒸水洗涤5次，将其浓度设置为1.0mg/mL。

按照以下苯硼酸和保护基团的选择设置实施例

实施例苯硼酸保护基团14-羧基苯硼酸2-(2-氨基乙氧基)乙醇24-巯基苯硼酸2-(2-甲氧基乙氧基)乙硫醇33-羧基苯硼酸3-[2-(2-羟乙氧基)乙氧基]丙酸43-羧基苯硼酸1-氨基-3,6,9-三噁-11-十一醇54-巯基苯硼酸1-巯基-3,6,9-三噁-11-十一醇64-氨基苯硼酸1-氨基-3,6,9-三噁-11-十一醇

实施例1

带有保护基团(2-(2-氨基乙氧基)乙醇)的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒的制备

(1)将5mL制备例所得的超顺磁性四氧化三铁磁性颗粒溶液重悬于80mL的乙醇，置于250mL三口烧瓶中，超声10分钟，使其完全分散。然后将其中先后加入8mL的氨水溶液，7.5mL的三蒸水以及0.1mL的正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate，TEOS)，于40℃剧烈搅拌4h，得到掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒。将所得的掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒用50mL的三蒸水洗涤三次，除去未与磁性铁掺杂的物料。最后将所得颗粒悬于50mL乙醇中。

(2)取20mL步骤(1)得到的掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒溶液，置于100mL三口烧瓶中，超声30min，然后逐滴加入1mL氨水溶液和0.03mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl)triethoxysilane,APS)，于室温条件下搅拌24h，磁性粒子表面被氨基化。将 所得的氨基化的磁性纳米颗粒用30mL的三蒸水洗涤三次，除去未发生反应的物料。最后将所得颗粒悬于30mL二甲基甲酰胺(Dimethyl Formamide,DMF)中。

(3)取3mL表面氨基化的磁性粒子，超声30min使其充分分散。向反应体系中先后加入5mL HATU的DMF溶液(0.5M)，1.25mmol 4-羧基苯硼酸和5mmol DIEA。常温下剧烈搅拌0.5h后，再向反应体系中加入1.25mmol丙二酸，于4℃条件下搅拌24h反应。然后向反应体系中加入1.25mmol 2-(2-氨基乙氧基)乙醇的DMF溶液，继续4℃剧烈搅拌24h。反应完毕后，将所制得的带2-(2-氨基乙氧基)乙醇保护基团的苯硼酸功能化磁性粒子用5mL三蒸水洗涤5次，洗去未修饰到磁性铁上的物料，将其浓度设置为1.0mg/mL。

实施例2

带有保护基团(2-(2-甲氧基乙氧基)乙硫醇)的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒的制备

(1)将5mL制备例所得的超顺磁性四氧化三铁磁性颗粒溶液重悬于80mL的乙醇，置于250mL三口烧瓶中，超声10分钟，使其完全分散。然后将其中先后加入8mL的氨水溶液，7.5mL的三蒸水以及0.1mL的正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate，TEOS)，于40℃剧烈搅拌4h，得到掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒。将所得的掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒用50mL的三蒸水洗涤三次，除去未与磁性铁掺杂的物料。最后将所得颗粒悬于50mL乙醇中。

(2)取20mL步骤(1)得到的掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒溶液，置于100mL三口烧瓶中，超声30min，然后逐滴加入1mL氨水溶液和0.03mL的3-巯丙基三乙氧基硅烷 (3-Mercaptopropyltriethoxysilane，MPS)，于室温条件下搅拌24h，磁性粒子表面被巯基化。将所得的巯基化的磁性纳米颗粒用30mL的三蒸水洗涤三次，除去未发生反应的物料。最后将所得颗粒悬于30mL二甲基甲酰胺(Dimethyl Formamide,DMF)中。

(3)取3mL表面巯基化的磁性粒子，超声30min使其充分分散。向反应体系中加入1.0mmol 4-巯基苯硼酸。在搅拌的情况下，向反应体系中滴加溴水作为氧化剂，直到反应体系中没有溴化氢气体放出，继续于常温搅拌4h。然后向反应体系中加入1.5mmol 2-(2-甲氧基乙氧基)乙硫醇，继续滴加溴水进行氧化，直到无溴化氢气体放出。反应完毕后，将所制得的带有2-(2-甲氧基乙氧基)乙硫醇保护基团的苯硼酸功能化磁性粒子用5mL三蒸水洗涤5次，洗去未修饰到磁性铁上的物料，将其浓度设置为1.0mg/mL。

实施例3

带有保护基团(3-[2-(2-羟乙氧基)乙氧基]丙酸)的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒的制备

(1)将5mL制备例所得的超顺磁性四氧化三铁磁性颗粒溶液重悬于80mL的乙醇，置于250mL三口烧瓶中，超声10分钟，使其完全分散。然后将其中先后加入8mL的氨水溶液，7.5mL的三蒸水以及0.1mL的正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate，TEOS)，于40℃剧烈搅拌4h，得到掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒。将所得的掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒用50mL的三蒸水洗涤三次，除去未发生反应的物料。最后将所得颗粒悬于50mL乙醇中。

2)取20mL步骤(1)得到的掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒溶液，置于100mL三口烧瓶中，超声30min，然后逐滴加入1mL氨水溶液和0.03mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl)triethoxysilane, APS)，于室温条件下搅拌24h，磁性粒子表面被氨基化。将所得的氨基化的磁性纳米颗粒用30mL的三蒸水洗涤三次，除去未掺杂二氧化硅的磁性纳米颗粒。最后将所得颗粒悬于30mL二甲基甲酰胺(Dimethyl Formamide,DMF)中。

(3)取3mL表面氨基化的磁性粒子，超声30min使其充分分散。向反应体系中先后加入5mL HATU的DMF溶液(0.5M)，1.5mmol 3-羧基-苯硼酸，1mmol的3-[2-(2-羟乙氧基)乙氧基]丙酸和5mmol的DIEA，然后于4℃搅拌24h反应。反应完毕后，将所制得的带3-[2-(2-羟乙氧基)乙氧基]丙酸保护基团的苯硼酸功能化磁性粒子用5mL三蒸水洗涤5次，洗去未修饰到磁性铁上的物料，将其浓度设置为1.0mg/mL。

实施例4

带有保护基团(1-氨基-3,6,9-三噁-11-十一醇)的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒的制备

(1)将5mL制备例所得的超顺磁性四氧化三铁磁性颗粒溶液重悬于80mL的乙醇，置于250mL三口烧瓶中，超声10分钟，使其完全分散。然后将其中先后加入8mL的氨水溶液，7.5mL的三蒸水以及0.1mL的正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate，TEOS)，于40℃剧烈搅拌4h，得到掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒。将所得的掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒用50mL的三蒸水洗涤三次，除去未与磁性铁掺杂的物料。最后将所得颗粒悬于50mL乙醇中。

(2)取20mL步骤(1)得到的掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒溶液，置于100mL三口烧瓶中，超声30min，然后逐滴加入1mL氨水溶液和0.03mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl)triethoxysilane,APS)，于室温条件下搅拌24h，磁性粒子表面被氨基化。将 所得的氨基化的磁性纳米颗粒用30mL的三蒸水洗涤三次，除去未发生反应的物料。最后将所得颗粒悬于30mL二甲基甲酰胺(Dimethyl Formamide,DMF)中。

(3)取3mL表面氨基化的磁性粒子，超声30min使其充分分散。向反应体系中先后加入5mL HATU的DMF溶液(0.5M)，1.0mmol 3-羧基-苯硼酸和5mmol DIEA。常温下剧烈搅拌0.5h后，向反应体系中加入1.5mmol丙二酸，于4℃条件下搅拌24h反应。然后向反应体系中加入1.5mmol1-氨基-3,6,9-三噁-11-十一醇的DMF溶液，继续4℃剧烈搅拌24h。反应完毕后，将所制得的带1-氨基-3,6,9-三噁-11-十一醇保护基团的苯硼酸功能化磁性粒子用5mL三蒸水洗涤5次，洗去未修饰到磁性铁上的物料，将其浓度设置为1.0mg/mL。

实施例5

带有保护基团(1-巯基-3,6,9-三噁-11-十一醇)的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒的制备

(1)将5mL制备例所得的超顺磁性四氧化三铁磁性颗粒溶液重悬于80mL的乙醇，置于250mL三口烧瓶中，超声10分钟，使其完全分散。然后将其中先后加入8mL的氨水溶液，7.5mL的三蒸水以及0.1mL的正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate，TEOS)，于40℃剧烈搅拌4h，得到掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒。将所得的掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒用50mL的三蒸水洗涤三次，除去未与磁性铁掺杂的物料。最后将所得颗粒悬于50mL乙醇中。

(2)取20mL步骤(1)得到的掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒溶液，置于100mL三口烧瓶中，超声30min，然后逐滴加入1mL氨水溶液和0.03mL的3-巯丙基三乙氧基硅烷 (3-Mercaptopropyltriethoxysilane，MPS)，于室温条件下搅拌24h，磁性粒子表面被巯基化。将所得的巯基化的磁性纳米颗粒用30mL的三蒸水洗涤三次，除去未发生反应的物料。最后将所得颗粒悬于30mL二甲基甲酰胺(Dimethyl Formamide,DMF)中。

(3)取3mL表面巯基化的磁性粒子，超声30min使其充分分散。向反应体系中加入1mmol的1-巯基-3,6,9-三噁-11-十一醇。在搅拌的情况下，向反应体系中滴加溴水作为氧化剂，直到反应体系中没有溴化氢气体放出，继续于常温搅拌4h。然后再向反应体系中加入1.5mmol的4-巯基苯硼酸，并继续向反应体系中滴加溴水进行氧化，直到没有溴化氢放出。反应完毕后，将所制得的带有1-巯基-3,6,9-三噁-11-十一醇保护基团的苯硼酸功能化磁性粒子用5mL三蒸水洗涤5次，洗去未修饰到磁性铁上的物料，将其浓度设置为1.0mg/mL。

实施例6

带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒的制备

(1)将5mL制备例所得的超顺磁性四氧化三铁磁性颗粒溶液重悬于80mL的乙醇，置于250mL三口烧瓶中，超声10分钟，使其完全分散。然后将其中先后加入8mL的氨水溶液，7.5mL的三蒸水以及0.1mL的正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate，TEOS)，于40℃剧烈搅拌4h，得到掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒。将所得的掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒用50mL的三蒸水洗涤三次，除去未与磁性铁掺杂的物料。最后将所得颗粒悬于50mL乙醇中。

(2)取20mL步骤(1)得到的掺杂有二氧化硅的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒溶液，置于100mL三口烧瓶中，超声30min，然后逐滴加入1mL氨水溶液和0.03mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl) triethoxysilane,APS)，于室温条件下搅拌24h，磁性粒子表面被氨基化。将所得的氨基化的磁性纳米颗粒用30mL的三蒸水洗涤三次，除去未发生反应的物料。最后将所得颗粒悬于30mL二甲基甲酰胺(Dimethyl Formamide,DMF)中。

(3)取3mL表面氨基化的磁性粒子，超声30min使其充分分散。向反应体系中先后加入10mL HATU的DMF溶液(0.5M)，2.5mmol丙二酸和10mmol DIEA。4℃下剧烈搅拌4h后，向反应体系中加入1.5mmol 4-氨基苯硼酸和1.0mmol 1-氨基-3,6,9-三噁-11-十一醇，于4℃条件下搅拌24h反应。反应完毕后，将所制得的带1-氨基-3,6,9-三噁-11-十一醇保护基团的苯硼酸功能化磁性粒子用5mL三蒸水洗涤5次，洗去未修饰到磁性铁上的物料，将其浓度设置为1.0mg/mL。

测试例1

通过Quantum Design公司的物性测试仪按照其说明书中的方法，对制备例制备的超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒和实施例1-6制备的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒进行磁滞曲线测定。结果显示，制备例制备的四氧化三铁磁性纳米颗粒具有很强的磁响应性，同时具有超顺磁性(图1曲线a)，实施例1制得的苯硼酸功能化及2-(2-氨基乙氧基)乙醇保护的磁性纳米颗粒，仍具有更强磁性，且保持超顺磁性(图1曲线b)(实施例2-6所制备的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒进行磁滞曲线与实施例1类似)。图1的结果说明所制备的苯硼酸功能化及2-(2-氨基乙氧基)乙醇保护的磁性纳米颗粒具有更强的磁响应性，同时具有超顺磁性，为快速分离糖类样品提供了保障。

测试例2

本测试例用于说明本发明提供的磁性纳米颗粒对鸡卵清白蛋白的N糖链进行分析。

取100mg(100μL)实施例1-6制备的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒，通过磁铁将其从水中分离出来，然后重悬于100μL pH 8.5的氨水溶液中，超声10min，使其充分分散。然后向所述磁性纳米颗粒悬液中加入10mg通过PNGase F酶解(酶解方法参照New England Lab提供的标准方法执行)后的鸡卵清白蛋白，室温震荡30min。然后用pH 8.5的氨水溶液将磁性纳米颗粒洗涤4-5次，洗去样品中未与其识别的蛋白和多肽，将其悬于三蒸水中，并取出1μL与1μL的2,5-二羟基苯甲酸(DHB)混匀，混合后直接滴到基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)的样品板上，无需将被吸附的糖链从磁性纳米颗粒上解离下来，然后进行质谱分析测试。实施例1制备的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒结果如图2所示。图2的结果说明所制备的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒在可以很好的纯化出N糖链，并可以被质谱检测分析。实施例2-6所制备的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒对鸡卵清白蛋白的N糖链进行分析的结果与实施例1的类似。

对比测试例2

按照测试例2的方法将对比例1中制备的不带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒用于鸡卵清白蛋白的N糖链的检测分析。所得质谱图如图3所示。

图3的结果说明所制备的不带保护基团的磁性纳米颗粒不能分离纯化出鸡卵清白蛋白的N糖链，其在吸附N糖链的同时会有非特异性蛋白的吸附，影响到糖类物质的检测。

测试例3

本测试例用于说明本发明提供的磁性纳米颗粒对人乳中的寡糖链进行分析。

按照测试例2的方法将实施例1-6中制备的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒用于人乳中的寡糖链进行富集纯化，并用质谱进行检测，实施例1制备的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒结果如图4所示。图4的结果说明所制备的磁性纳米颗粒可以很好的将人乳中寡糖链分离纯化，并能够结合质谱进行分析。实施例2-6所制备的带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒对人乳中的寡糖链进行分析的结果与实施例1的类似。

对比测试例3

按照测试例2的方法将实施例1中制备的不带有保护基团的苯硼酸功能化磁性纳米颗粒用于人乳中的寡糖链进行富集纯化，并用质谱进行检测，结果如图5所示。图5的结果说明所制备的不带有保护基团的磁性纳米颗粒可不能有效的纯化出人乳中的寡糖类物质。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。