一株具有增强的溶藻能力的解淀粉芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株具有溶藻能力的解淀粉芽孢杆菌及其应用。该菌种是在已知的解淀粉芽孢杆菌的基础上导入了具有溶藻能力的SZ多肽，导致解淀粉芽孢杆菌具有更加增强的溶藻效果和活性。发酵上清液能够有效的杀灭有害藻类。本发明的菌种应用方法简单，按照常规的方法将上清液制备成为制成粉剂或者片剂，根据需要随时投放于水体中即可。同时该菌液安全性较好，可以大面积的推广使用。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，尤其涉及一株具有溶藻能力的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

随着我国社会经济和城镇化的迅速发展，大量城市生活污水、工业废水和农业面源污染排入江河湖泊，加速了水体污染和富营养化进程。太湖、巢湖和滇池等湖泊有毒蓝藻(主要是微囊藻)水华频繁暴发，危及多个大中城市的自来水供应和饮用水安全。微囊藻水华可造成水体水质变坏、发臭，所释放的微囊藻毒素是一种七环肽，其性质非常稳定(煮沸不能使之失活)，毒性很强。研究显示微囊藻毒素可能与人群中肝癌发病率提高相关。另一方面，高密度精养造成湖泊和池塘水质恶化和微囊藻水华暴发，也造成水产动物的死亡和水产品的安全性降低。目前尚缺乏有效控藻手段，亟需开发有效的微囊藻水华控制措施。

目前国内外学者对如何治理蓝藻水华展开了一系列的研究，其处理方法主要包括三个方向:一是物理方法，包括以打捞的方式机械除藻，在水华区域覆盖板料或薄膜等遮光抑藻，以填料吸附藻类等，这种方法工作量大、耗时长、效率低；二是化学方法，如投加CuSO4等杀藻剂，这种方法的缺点是投加的化学药剂对水生生物有毒害作用；三是生物方法，种群竞争抑藻、鱼类吞噬除藻、微生物除藻和综合防治法都是针对湖泊富营养化的生物控制技术。如:《武汉植物学研究》2005年第23卷第I期53-57页报道了李修岭的发现:水龙可以漂浮于水面生长，去除氮磷的能力强，抑藻效果好且可操作性强。《环境科学学报》2002年第22卷第6期732-737页报道了陆开宏的研究成果:罗非鱼能够大量摄食并消化蓝藻。《中国给排水》2011年第27卷第13期63-66页报道了闵智的研究成果:草履虫对铜绿微囊藻具有吞噬能力。对于大面积水体来说，物理、化学方法均不利于实施。

目前，越来越多的研究人员在细菌的筛选与鉴定、溶藻特性、混合菌群构建等方面对溶藻细菌进行了研究，从不同环境中分离出了多种溶藻细菌。《中国环境与科学》2008年第28卷第5期461-465页报道汪辉等从青岛市黄岛边的某富营养化池塘中分离得到I株具有溶解铜绿微囊藻作用的无色杆菌属细菌；《微生物学通报》2012年第39卷第5期677-682页报道崔璐璐等从水库水体中筛选出I株溶藻细菌，经鉴定为黄单胞菌科的寡养单胞菌。分离的溶藻细菌应用于预防与控制蓝藻暴发依然存在一定的局限性。据统计，溶藻细菌的来源主要是富营养化水体。如:公开号CN101139140A的发明专利，公开了一种利用微生物降解铜绿微囊藻的方法，从深度富营养化城市湖泊水体中分离纯化得到Brevibacillus spp.FDK2,该细菌对铜绿微囊藻有较好的去除作用，去除率达到90％以上。公开号CN101955904A的发明专利，公开了一种自然水环境中的溶藻细菌分离方法，从富营养水体中分离出了高效溶藻细菌DC1，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌，该方法分离的溶藻细菌能够有效控制鱼腥藻的生长。由于蓝藻的暴发不仅限于城市湖泊，大面积的自然水体如太湖、滇池、巢湖等大面积的水域同样存在相似的问题，蓝藻水华污染的难题尚未有有效的解决方法。

传统的治理方法如机械除藻，高频电磁脉冲以及利用除草剂等方法，常受到成本和环境安全性问题等诸多因素的限制。相比之下，生物控藻技术成本低、安全性好，其中溶藻细菌因其较高的除藻效力，成为防治水华和赤潮的一个新方向。为有效控制微囊藻水华暴发及在水华暴发后进行应急控制，筛选具有生物安全性、无毒副作用、不污染环境的杀藻剂已成为必然的趋势。

溶藻细菌(algae-lysing bacteria)是一类以直接或间接方式抑制藻类生长，或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌的统称，作为水生生态系统中生物种群结构和功能的一个重要组成部分，对水华和赤潮的控制、维持藻类生物量的平衡有非常重要的作用，它们对浮游植物的溶解作用也可能是调节水生生态系统中初级生产力的一个重要因素。水华和赤潮的突然消亡可能与溶藻细菌的感染有关。溶藻细菌作为水华和赤潮防治的生物，引起了国内外不少学者的关注，近年来国外不断分离出新的溶藻细菌。相对而言，国内报道较少，近十多年来几乎处于停滞状态。如郭吉等从太湖分离到对铜绿微囊藻有溶藻作用的芽孢杆菌；刘晶等也在广州富营养化的池塘中分离到对铜绿微囊藻和水华鱼腥藻具有溶藻功能的蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌等。

溶藻细菌抑制微藻的生长主要通过以下方式：直接接触溶藻、分泌溶藻物质、与微藻竞争营养物质、形成菌胶膜、进入藻细胞杀藻。直接接触溶藻是指溶藻细菌主动攻击接触微藻(藻细胞)后，侵入并破坏其细胞结构从而杀灭微藻。粘细菌与CFB菌群的细菌大多通过直接方式溶藻，如Imai报道噬胞菌(J18/M01)的培养物对硅藻有强烈的溶解作用，而无菌滤液则不起任何作用。KANG等发现一株恶臭假单胞菌通过直接溶藻方式杀死冠盘藻。其二，是通过释放特异性或非特异性的胞外活性物质溶藻。这类细菌有芽孢杆菌、假单胞菌、黄杆菌、交替单胞菌、假交替单胞菌等，目前已分离和鉴定的活性物质主要有蛋白质、多肽、氨基酸、抗生素、含氮化合物、生物碱、色素。Lee等报道海洋细菌假交替单胞菌A28分泌丝氨酸蛋白酶其上清液能杀灭骨条藻。Jeong等从一株可强烈杀灭多环旋沟藻的芽孢杆菌SY-I中分离得到一种溶藻物质Bacillamide，可抑制多环旋沟藻水华。Yoshikawa等报道溶藻细菌C-979(Vibriosp.)可产生β-氰基-L-丙氨酸(L-CNAla)，它对一些蓝藻有明显抑制作用。Kawamo从菌株ΡΚ654分离出抗生素Thiotropicin,可抑制中肋骨条藻及赤潮异弯藻。Volk等从Nodulariaharveyana和Nostocinsulare分离出卩引哚类生物喊，可溶解螺旋藻。Jeong等发现Hahellachejuensis细菌可合成一种具有由3个批咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构的灵菌红素，它具有强烈的细胞溶解酶活性，能杀死引起赤潮的微藻。Nokuyubi等发现芽孢杆菌N-14可分泌一种非蛋白类物质对微囊藻具有溶藻效应。此外，细菌还可通过与微藻竞争营养、形成菌胶膜等方式抑制微藻生长。

目前，国内外溶藻细菌一般分离自因富营养化而发生水华或赤潮的湖泊及海洋，大多为革兰氏阴性菌。由于溶藻细菌在自然水体中存在的比率比较低，故采用传统的方法需要浓缩大量水样，耗时长且很难获得理想溶藻细菌。因此，采用基因工程的方法对已知的溶藻细菌进行特异性的改造，从而获得溶藻效果更佳光谱，溶藻效果更好的菌是最好的研究方向。

发明内容

针对上述现有技术，本发明采用基因工程的方法构建得到一株具有溶藻能力的解淀粉芽孢杆菌，验证了所述的解淀粉芽孢杆菌的溶藻效果。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株具有溶藻能力的SZ多肽，所述多肽的氨基酸序列如VVRSPPRMWVTYKHMMIPPNQ或YRCWLQSKCTMCRDGQWPA所示。

所述的多肽为从嗜麦芽寡养单胞菌，保藏号：CCTCCN0:M2013129中分离得到。

本发明另外提供一种具有溶藻能力的SZ多肽的分离鉴定方法，所述方法包括:

(1)培养嗜麦芽寡养单胞菌，30℃ 200r/min培养20小时得到培养液；离心去除菌体以及大颗粒杂质；

(2)将离心上清液，经过丙酮预处理以降低杂质含量；

(3)将处理过的样品在非变性条件下进行等电聚焦IEF，IEF之后从凝胶上切下两根宽度相同的IEF胶条，在缓冲液A中平衡后进行第二向的聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺制备非变性凝胶，上槽缓冲液的组分为Tris-base，Tricine和SDS，恒压电泳至溴酚蓝前缘到达底部；

(4)将PAGE所得的两块胶分别处理，一块胶用考马斯亮蓝CBB染色，脱色后用做备份，另一块胶则经电印迹，将蛋白质斑点转移到NC膜上，使用不含SDS的缓冲液A；

(5)经过0.01～0.2M Tris-Cl，pH＝7.5的缓冲液漂洗除去SDS，将NC膜真空干燥；

(6)在NC膜上均匀地分布蓝藻，使其密度达到1.5×10³～2×10⁵CFU/mm²后，将膜置于牛肉膏固体培养基上培养，该培养基含显色剂；同时含有蓝藻生长所需的底物，该底物经蓝藻代谢能产生酸性产物；在NC膜上正常生长的蓝藻由于其代谢产物呈酸性因而在其周围呈亮黄色，而有抗藻肽斑点的地方蓝藻生长受抑制，故而和周围呈现出色差，为暗色的斑点；

(7)将NC膜上的斑点与双向电泳所得到的凝胶上的斑点相对照，将凝胶上对应于NC膜上抗藻肽色斑的斑点切下，然后对这些斑点用质谱指纹图，N端序列分析，氨基酸组成分析进行微量鉴定。

(8)通过效果分析，发现了11个具有抑藻活性的多肽，其中有2个多肽抑藻活性特别显著，其序列分别为VVRSPPRMWVTYKHMMIPPNQ或YRCWLQSKCTMCRDGQWPA所示。

本发明另外提供一种将抗菌肽导入到枯草芽孢杆菌中从而提高杀藻的广谱性以及杀藻活性的方法，该方法包括：获得P43启动子与合成的编码VVRSPPRMWVTYKHMMIPPNQ或YRCWLQSKCTMCRDGQWPA的核苷酸序列(两端分别带有BamHI和SmaI酶切位点)，而后将二者通过酶切与PHCMC-P43载体相连，最后导入到解淀粉芽孢杆菌中获得。

其中解淀粉芽孢杆菌优选为保藏编号为CCTCC M2012184的菌株。

本发明另外提供一种菌剂，活性成分为导入了杀菌肽的枯草芽孢杆菌CCTCC M2012534,其中杀菌肽的氨基酸序列为VVRSPPRMWVTYKHMMIPPNQ或YRCWLQSKCTMCRDGQWPA所示；

本发明另外提供一种粉剂或片剂，由所述菌剂制备而成。

本发明另外提供一种所述菌株和/或所述菌剂和/或所述粉剂和/或所述片剂，在杀灭有害藻类中的应用，所述有害藻类为铜绿微囊藻、水华微囊藻，假丝微囊藻和赤潮导湾藻；在防治水华和赤潮中的应用；在水产养殖中治理水体环境中的应用。

本发明的技术效果：通过针对嗜麦芽寡养单胞菌的发酵液进行特异的分析，筛选得到了二个具有杀藻活性的多肽，该多肽导入到枯草芽孢杆菌中后得到的发酵液具有较好的杀死藻类的效果。

具体实施方式

实施例1 杀藻多肽的获得

(9)培养嗜麦芽寡养单胞菌，30℃ 200r/min培养20小时得到培养液；离心去除菌体以及大颗粒杂质；

(10)将离心上清液，经过丙酮预处理以降低杂质含量；

(11)将处理过的样品在非变性条件下进行等电聚焦IEF，IEF之后从凝胶上切下两根宽度相同的IEF胶条，在缓冲液A中平衡后进行第二向的聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺制备非变性凝胶，上槽缓冲液的组分为Tris-base，Tricine和SDS，恒压电泳至溴酚蓝前缘到达底部；

(12)将PAGE所得的两块胶分别处理，一块胶用考马斯亮蓝CBB染色，脱色后用做备份，另一块胶则经电印迹，将蛋白质斑点转移到NC膜上，使用不含SDS的缓冲液A；

(13)经过0.01～0.2M Tris-Cl，pH＝7.5的缓冲液漂洗除去SDS，将NC膜真空干燥；

(14)在NC膜上均匀地分布蓝藻，使其密度达到1.5×10³～2×10⁵CFU/mm²后，将膜置于牛肉膏固体培养基上培养，该培养基含显色剂；同时含有蓝藻生长所需的底物，该底物经蓝藻代谢能产生酸性产物；在NC膜上正常生长的蓝藻由于其代谢产物呈酸性因而在其周围呈亮黄色，而有抗藻肽斑点的地方蓝藻生长受抑制，故而和周围呈现出色差，为暗色的斑点；

(15)将NC膜上的斑点与双向电泳所得到的凝胶上的斑点相对照，将凝胶上对应于NC膜上抗藻肽色斑的斑点切下，然后对这些斑点用质谱指纹图，N端序列分析，氨基酸组成分析进行微量鉴定。

(16)通过效果分析，发现了11个具有抑藻活性的多肽，其中有2个多肽抑藻活性特别显著，其序列分别为VVRSPPRMWVTYKHMMIPPNQ或YRCWLQSKCTMCRDGQWPA所示。

实施例2 基因工程菌解淀粉芽孢杆菌的构建

以枯草芽孢杆菌{Bacillus subtilis)ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增P43启动子基因，获得300bp基因片段；扩增引物为P43-F～5’GCGAGCTCTGATAGGTGGTATGTTTTCGC3’-SacI；P43-R 5'GCGGGATCCCATGTGTACATTCCTCTCTT3’-BamHI。

用BernHI/SeicI双酶切后获得P43启动子基因片段，与经过相同双酶切处理的PHCMC04载体(购自Bacillus genetic stock center，ECE189P)，用T4DNA连接酶连接，构建pHCMC-P43载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；

VVRSPPRMWVTYKHMMIPPNQ或YRCWLQSKCTMCRDGQWPA在上海生工合成其分别对应的核苷酸序列，两端分别带有BamH/SmaI酶切位点。用BamH/SmaI双酶切后获得SJT片段，与经过相同双酶切处理的PHCMC-P43载体，用T4DNA连接酶连接，构建pHCMC-SJT载体，酶切验证正确后，转化大肠杆菌DH5α，用于下一步转化；

以保藏编号为CCTCC M2012184的解淀粉芽孢杆菌制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的pHCMC-SJT载体转化入解淀粉芽孢杆菌，氯霉素平板上筛选得到氯霉素抗性菌株12株，命名为解淀粉芽孢杆菌SJT；质粒pHCMC-SJT可以在杆菌中过量表达所述的多肽，成为超量表达多肽的菌株，即为所希望得到的菌株。

菌株的分子验证

对杆菌进行分子验证。由于菌株内含有pHCMC-SJT质粒，所以我们从转化菌株中提取质粒pHCMC_SJT来验证其是否被成功转化入杆菌中。经过提取质粒，电泳检测后，发现杆菌中确实含有pHCMC-SJT质粒。经过分子生物学验证，我们确实得到了超量表达SJT的解淀粉芽孢杆菌。

实施例3 溶藻活性检测

1、发酵上清液的制备

将解淀粉芽孢杆菌发酵培养，所述芽孢杆菌发酵液4℃ 12000rpm离心10min，收集上清液，所得上清液即发酵上清液。离心后的菌体加灭菌水还原到原来的体积，即菌体悬液。

2、藻类的培养

将购买的铜绿微囊藻、水华微囊藻、假丝微囊藻和赤潮导湾藻藻种于2000LX、25℃条件下的光照培养箱中静置培养，每隔3h人工摇动一次(均在无菌条件下进行)，持续预培养一周，并镜检有无杂藻和藻类生长情况，如达到同步良好生长，就可作为试验的藻种液。

铜绿微囊藻、水华微囊藻、假丝微囊藻和赤潮导湾藻分别按照本领域常规的藻类培养方法，培养得到藻液。

3、抑藻活性检测

分别将150μL菌体悬液、发酵上清液接种于30mL四种藻液中，对照Control为Landy培养基,进行溶藻实验，7d后测定叶绿素a含量，计算抑藻率，比较发酵液不同处理方式对铜绿微囊藻的影响。结果:发酵上清液的抑藻率远远大于菌体悬浮液的抑藻率。表明本发明的解淀粉芽孢杆菌主要是通过分泌胞外物质的间接方式起到溶藻作用。所述结果如下：

同时采用常规的观测指标进行检验也可以发现，发酵上清液针对四种藻类的显微镜镜检藻细胞几乎没有完整细胞存在；肉眼观察藻液颜色出现明显的黄化现象，说明叶绿素被破坏严重。

实施例4.溶藻活性成分的热稳定性和pH稳定性检测

为了研究发酵上清液中溶藻活性成分在不同的地理环境气候和水质中使用时的稳定性，我们将发酵上清液分别在0℃、10℃、25℃、37℃、100℃温度下处理30min；将发酵上清液通过添加HCl或NaOH调节其pH为4、5、6、7、8、9，分别接种150μL各pH发酵上清液于30mL铜绿微囊藻藻液中，来检测这些处理对铜绿微囊藻生长繁殖的抑制作用。结果:发酵上清液100℃处理后，溶藻率仍然高达89.56％，其他温度处理后溶藻率仍在98％以上。发酵上清液调为各pH值处理后，均不影响溶藻活性成分，溶藻率分别为96.7％、96.8％、97.2％、99.20％、98.56％、98.43％都在95％以上。表明起到有效抑藻作用的胞外分泌物具有热稳定性且在偏酸或偏碱的条件下均不影响其活性。溶藻活性成分具有很好的热稳定性和PH稳定性。

实施例5动物安全性检测

(1)人工感染试验：

取健康鲫鱼30尾，分为2组，每组15尾，其中一组为试验组，一组为对照组。在试验组水体中加入本发明的芽孢杆菌，使水体的含菌量达10 9cfu/mL，进行人工感染试验。观察感染过程中鲫鱼的活动状况、发病及死亡情况。

(2)人工注射试验：

离心收集培养24h的菌体，经质量分数为0.75％无菌生理盐水洗涤并配制成109cfu/mL的菌悬液，取健康鲫鱼30尾，分为2组，每组15尾，其中一组为试验组，一组为对照组。试验组鲫鱼每尾腹腔接种0.1mL经上述处理的菌悬液，对照组注射0.1mL无菌生理盐水。观察注射后鲫鱼的活动状况、发病及死亡情况。于注射后第15d剖解鲫鱼，观察内脏器官有无病理变化。

结果如下：

死亡率(％)活力摄食情况内脏情况人工感染实验0无不良反应正常健康人工注射实验0无不良反应正常健康

从以上结果可以看出，所述的菌对养殖动物是安全的，在试验周期内无死亡现象，摄食正常，在人工注射实验中同样没有出现不良现象。

上述对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。