异喹啉生物碱防治高血脂症和非酒精性脂肪肝的用途

摘要

本发明涉及异喹啉生物碱防治高血脂症和非酒精性脂肪肝的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及天然药物领域，涉及一种异喹啉生物碱的治疗或预防高血脂症和非酒精性脂肪肝的用途，具体涉及黄柏碱的治疗或预防高血脂症和非酒精性脂肪肝的用途。

背景技术

糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷及(或)其生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢疾病，是在遗传基础上，有环境因素参与的遗传易感性疾病，是一种慢性全身性代谢疾病，严重危害人类健康，积极开展糖尿病的防治工作已成为主要的社会公共卫生问题。

I型糖尿病的发病原因主要是由于胰岛素分泌绝对缺少，II型糖尿病是从胰岛素抵抗为主伴胰岛素相对不足到胰岛素分泌不足为主伴胰岛素抵抗的病理过程。目前公认II型糖尿病是一种在环境因素、生活方式的改变的作用下由多个基因分别或相互作用所导致的复杂遗传病，但是II型糖尿病的病因尚未完全阐明。

西医目前常采用饮食、运动疗法磺酰脲类、双胍类、噻唑烷二酮类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、瑞格列奈、胰岛素等来治疗II型糖尿病，仅噻唑烷二酮类可改善胰岛素抵抗。病人在用西药治疗的同时，又不断地出现动脉硬化、冠心病和高血压等并发症，II型糖尿病的复杂机制及其导致的全身病变是西药治疗的薄弱环节。不论是磺脉类的促泌剂还是噻唑烷二酮类的增敏剂在实验和临床研究中都不具备明显的减肥功效，而肥胖是2型糖尿病乃至代谢综合征的重要病理基础。

II型糖尿病不仅是糖代谢紊乱疾病，还是脂肪代谢紊乱疾病。肥胖引起的II型糖尿病患者通常都有高糖和高脂饮食，并常伴有高脂血症。有研究表明提示血糖“正常”的肥胖患者已有β细胞分泌功能的异常。但是，大部分的肥胖者并不发展为糖尿病，说明机体的自身状况起重要作用。在同样的毒性作用下，易感人群很容易发展成II型糖尿病，而不敏感人群可能终身不发病，或者延迟发病。现代医学并不能够改变机体的易感性，但可以通过改变生活方式，减肥等手段来尽可能地减少早期的诱因，尽量的延长代偿期，从而延迟2型糖尿病的发生，甚至避免发病。

现代II型糖尿病的治疗观点已从已往的单纯控制血糖转为降糖、降脂、降压、改善胰岛素抵抗等多环节治疗。但是，对于II型糖尿病患者，药量需逐渐增加，投药种类也常由单一用药逐渐变为联合用药，这不可避免地要考虑药物代谢对肝肾的副作用。故从传统中药中寻找低毒、疗效肯定的天然药物来治疗是目前研糖尿病究热点之一。

卫生部制定颁布的《中药新药治疗消渴病(糖尿病)的临床研究指导原则》中所制定的分类标准是目前采用最广泛的分类方法，即阴虚热盛证、气阴两虚证、阴阳两虚证和血疲气滞证四型。

黄柏为我国常用的传统中药，始载于《神农本草经》，原名“檗木”，列为上品，其性味苦、寒，主归肾、膀胱经，具有清热燥湿，湾火除蒸，解毒疗疫之功效，用于湿热汚痢，黄疸尿赤，带下阴痒，热淋淫痛，脚气痿蹵，骨蒸劳热，盗汗，遗精，肿毒，湿疹。现代药理研究表明，黄柏具有抗菌、抗真菌、抗炎、抗肝炎、抗肾炎、抗溃病、抗氧化、抗痛风、降血压、降血糖、抗肿瘤、抗心力衰竭、抑制细胞免疫等作用。目前黄柏制剂在临床上已经广泛运用，如治疗鼻窦炎、急慢性脓耳、急慢性骨髓炎、慢性结肠炎、皮肤糜烂、脓拖性皮损、湿疫皮炎、溃窃性口腔炎、外痔肿痛、肛痛以及术后外洗、治疗软组织挫伤、消肿等病症。(《黄柏中黄柏碱的提取纯化工艺研究》，《西南交通大学硕士研究生学位论文》，罗鸿，2012年)。

黄柏碱(Phellodendrine)是从芸香科植物黄柏(Phelhdendron chinensisSchneid.)、威氏黄柏的茎皮中提取分离出来的一种异喹啉生物碱，其具有降血压、抗肾炎、抑制细胞免疫反应、中枢神经抑制等作用。

黄柏碱的药理作用主要有：降压作用，主要表现为静注于猫和鼠和犬均可引起降压，并能增强肾上腺素和去甲肾上腺素的升压反应，抑制人工窒息及刺激迷走神经向中端的升压反应，抑制刺激节前纤维而起的猫瞬膜收缩。随剂量增大，降压作用强度及持续时间也增加；植物神经阻断作用，表现为黄柏碱对中枢神经有抑制作用，能抑制小鼠的自发活动和各种反射；肌肉松驰作用；对细胞免疫应答期的诱导期有抑制作用。

《黄柏中几种生物碱的分离、鉴定及促胰岛素分泌活性筛选》(《中国医药指南》，2011年3月，第9卷，第7期，第54-55页，周明伟、范明松、季宇斌、唐意红)记载了：从黄柏的生物碱部分分离得到3个化合物，分别为小檗碱、药根碱、黄柏碱。研究发现，在葡萄糖浓度为5.6mmol/L时，黄柏总碱中的3种生物碱对胰岛素的分泌均无明显的促进作用；而当葡萄糖浓度为16.7mmol/L时，小檗碱能够明显的促进细胞的胰岛素分泌。阳性药格列美脲在低糖浓度和高糖浓度时，都能够促进胰岛素分泌。

未见有关黄柏碱对于糖尿病有预防或治疗作用的报道。

未见有关黄柏碱对于高脂血症有预防或治疗作用的报道。

未见有关黄柏碱对于非酒精性脂肪肝有预防或治疗作用的报道。

发明内容

本发明公开一种异喹啉生物碱的预防或治疗高脂血症的用途；

本发明公开一种异喹啉生物碱的预防或治疗非酒精性脂肪肝的用途；

本发明公开的组合物，异喹啉生物碱为黄柏碱。

本发明公开的组合物，为市售或按已知方法制备的黄柏碱或其药用盐、水合物或无水物。

本发明公开的组合物，其中黄柏碱药用盐包括：无机酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐；有机酸盐例如乙酸盐，苯甲酸盐，马来酸盐，富马酸盐，苹果酸盐，柠檬酸盐，草酸盐，乳酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，烷基磺酸盐或芳基磺酸盐，半胱氨酸盐或其它氨基酸盐。还包括碱式盐如钠盐、钾盐和钙盐。

水合物包括含n个结晶水，n＝1-12。

本发明公开的组合物，为：药物、保健品、或功能性食品，赋形剂或载体为制药或食品领域中常用的赋形剂或载体，如稀释剂，崩解剂，润滑剂等。

本发明中所述黄柏碱的有效量可是目前黄柏碱应用领域中的常用量或剂量。

本发明的黄柏碱可通过口服或注射形式使用。

本发明所述的黄柏碱(Phellodendrine)，CAS号为6873-13-18，其分子式是C₂₀H₂₄NO₄，相对分子质量342，具有式如下的结构：

非酒精性脂肪肝是一种无过量饮酒史，由各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积，以肝细胞脂肪变性和脂质蓄积为主要特征的临床病理综合征，也是一种临床常见病症。

在黄柏碱的药理活性研究中，本发明意外地发现黄柏碱具有显著的减低血糖作用。本发明通过(1)STZ造模的糖尿病小鼠，通过(2)高脂诱导的2型糖尿病动物模型(DIO小鼠)，进行了禁食血糖检测(FBG)。

在黄柏碱的药理活性研究中，本发明意外地发现黄柏碱具有显著的减低血脂作用，意外地发现黄柏碱能降低胆固醇，甘油三酯和低密度脂蛋白的水平，出人意料地发现黄柏碱能提升高密度脂蛋白的水平，从而可用于预防和、或治疗与高血脂有关的疾病或症状。

在黄柏碱的药理活性研究中，本发明意外地发现黄柏碱具有显著的治疗或预防非酒精性脂肪肝作用，意外地发现黄柏碱有效缓解高脂饲料引起的非酒精性脂肪肝变性，改善因脂肪变性而导致的肝功能损害。

基于上述发现，本发明现已完成。为了便于理解，下面通过附图和具体实施例对本发明的黄柏碱在治疗糖尿病药物中的用途进行详细的描述。需要特别指出的是，具体实施例和附图仅是为了说明，显然本领域的技术人员可以根据本文说明，对本发明进行各种修正或改变，这些修正和改变也将纳入本发明范围之内。

附图说明

图1.黄柏碱对I型糖尿病小鼠胰腺组织的影响

图2.黄柏碱对II型糖尿病小鼠口服糖耐量的影响

图3.黄柏碱对II型糖尿病小鼠胰岛素耐量的影响

图4.黄柏碱对非酒精性脂肪肝小鼠肝脏组织的影响

图1的详细说明

图1通过上中下三个部分展示黄柏碱对I型糖尿病小鼠胰腺组织的影响；

图1的上部展示正常组小鼠胰腺组织；

图1的中部展示STZ组小鼠胰腺组织；

图1的下部展示STZ+黄柏碱组小鼠胰腺组织。

图2的详细说明

图2展示黄柏碱对II型糖尿病小鼠口服糖耐量的影响；

图2中，control为正常饮食组，HFD为高脂饮食组，HFD+Phellodendrine为高脂+Phellodendrine组。图3的详细说明

图3展示黄柏碱对II型糖尿病小鼠胰岛素耐量的影响

图3中，control为正常饮食组，HFD为高脂饮食组，HFD+Phellodendrine为高脂+Phellodendrine组。

图4的详细说明

图4通过左上、右上、左下、右下四个部分展示黄柏碱对非酒精性脂肪肝小鼠肝脏组织的影响；

图4的左上部展示正常组小鼠肝脏组织；

图4的右上部展示高脂组小鼠肝脏组织；

图4的左下部展示洛伐他汀组小鼠肝脏组织；

图4的右下部展示黄柏碱小鼠肝脏组织。

本发明涉及如下表格

表1.黄柏碱对STZ造模的I型糖尿病小鼠的禁食血糖的影响。

表2.黄柏碱对STZ造模的小鼠胰岛数目的影响

表3.黄柏碱对高脂造模的II型糖尿病禁食血糖的影响

表4.正常组小鼠糖耐量原始数据及相应线下面积

表5.高脂组小鼠糖耐量原始数据及相应线下面积

表6.黄柏碱治疗高脂饮食小鼠糖耐量原始数据及线下面积

表7.黄柏碱对口服糖耐量线下面积数据分析

表8.正常组小鼠糖胰岛素耐量原始数据及线下面积

表9.高脂组小鼠糖胰岛素耐量原始数据及线下面积

表10.黄柏碱治疗高脂饮食小鼠糖胰岛素耐量原始数据

表11.黄柏碱对高脂饮食小鼠糖胰岛素耐量线下统计分析

表12.各组小鼠血脂指标的变化

表13.各组小鼠肝功能相关指标的变化

具体实施方式

实施例1

为了研究黄柏碱对I型糖尿病血糖影响，本实验采用经典的I型糖尿病模型，使用C57BL小鼠随机分为3组，正常对照组(10只)，STZ组(20只)。STZ组连续腹腔注射STZ(50mg/Kg)5天，两周后测定禁食血糖，血糖大于等于13.8mmol/L为造模成功，将STZ组随机分为模型组和黄柏碱治疗组，黄柏碱治疗组采用口服灌胃(15mg/kg)10周后，禁食4h后测定禁食血糖结果如图1所示，具有显著的统计学差异。

动物的一般情况：

胰岛组织病理学检查：石蜡切片、HE染色，观察病理变化

表1.黄柏碱对STZ造模的I型糖尿病血糖的影响.

注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与STZ组相比。

结果表明黄柏碱能够有效的降低STZ造成的I型糖尿病的血糖

表2.黄柏碱对STZ造模的小鼠胰岛数目的影响

注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与STZ组相比。

随机选取胰腺病理切片9个视野进行统计。附图1的结果显示STZ造模后胰腺萎缩，组织结构坏死，通过黄柏碱治疗后胰岛组织形态结构恢复明显。注：标尺为2μm，放大倍数400倍。

实施例2

为了研究黄柏碱对II型糖尿病的影响，本实验采用经典的II型糖尿病模型，使用C57BL小鼠随机分为3组，正常对照组(10只)，模型组(10只)，黄柏碱治疗组(10只)，其中模型组和黄柏碱治疗组采用高脂饮食(基础饲料加入20％猪油)造模8周，黄柏碱治疗组在高脂饮食同时采用口服灌胃(50mg/kg)方式给药，给药结束后测定禁食过夜测定、空腹血糖、葡萄糖耐量和胰岛素耐量。实验数据进行方差分析，结果以x±s表示。结果显示，黄柏碱治疗效果明显，具有显著统计学差异。

动物的一般情况

实验结果：

表3.黄柏碱对高脂造模的II型糖尿病禁食血糖的影响

注：***P＜0.001，与正常组相比；*P＜0.05，***P＜0.001，与高脂组相比

糖耐量试验是一种口服葡萄糖负荷试验，用以了解机体对进食葡萄糖后的血糖调节能力。通过糖耐量试验，可以早期发现糖代谢异常，是目前公认的诊断糖尿病的金标准，在血糖增高但尚未达到糖尿病诊断标准时，为明确是否患糖尿病，可以采用OGTT进行鉴别诊断。正常情况下，机体有一套维持血糖的机制，口服葡萄糖，血糖短暂升高后迅速恢复正常，即糖耐量正常，相应的口服糖耐量曲线线下面积较小，糖尿病患者糖的利用障碍，口服葡萄糖后血糖迅速升高，血糖下降速度较慢，即糖耐量减退相应的线下面积较大，该实验中糖耐量减退，

如图2所示黄柏碱治疗组和正常组的糖耐量曲线均在模型组曲线下，相应的线下面积也均低于模型组，且具有统计意义。

糖耐量实验方法：小鼠禁食过夜，小鼠口服血糖2g/kg后分别在0，15，30，60，90，120min时，尾尖采血测定相应血糖，使用GraphPad Prism软件计算相应线下面积(AUC)

胰岛素耐受实验方法：小鼠禁食过夜，小鼠腹腔注射胰岛素0.75IU/kg后分别在0，30，60，90，120，150min时，尾尖采血测定相应血糖，使用GraphPad Prism软件计算相应线下面积(AUC)

糖耐量原始数据如下：

表4.正常组小鼠糖耐量原始数据

表5.高脂组小鼠糖耐量原始数及相应线下面积

表6.黄柏碱治疗高脂饮食小鼠糖耐量原始数及线下面积

图2.黄柏碱对II型糖尿病小鼠口服糖耐量的影响

注：control为正常饮食组，HFD为高脂饮食组，HFD+Phellodendrine组为高脂

表7.黄柏碱对口服糖耐量线下面积数据分析

胰岛素耐量试验是反映机体对胰岛素敏感性的实验，II型糖尿病的主要特征为胰岛素抵抗，对胰岛素敏感性降低，即注射相同胰岛素相同时间内血糖高于正常机体，如图3所示，高脂造模后对胰岛素敏感性降低，注射相同量的胰岛素后各个点的血糖值均高于正常组，其相应的线下面积也高于正常组，给予黄柏碱治疗后各个时间点的血糖数值低于模型组，相应线下面积低于高脂诱导的模型组。结果表明黄柏碱能够有效的增加胰岛素敏感性改善糖尿病。

表8.正常组小鼠糖胰岛素耐量原始数据

表9.高脂组小鼠糖胰岛素耐量原始数据

表10.黄柏碱治疗组小鼠糖胰岛素耐量原始数据

图3.黄柏碱对II型糖尿病小鼠胰岛素耐量的影响

表11.黄柏碱对II型糖尿病小鼠糖胰岛素耐量线下统计分析

注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与高脂组比较

可见：与正常组相比，模型组小鼠空腹血糖值显著升高，说明II型糖尿病模型造模成功。同时，与模型组相比，黄柏碱有显著的降低空腹血糖的作用和增加葡萄糖耐受、增强胰岛素敏感性。

实施例3

黄柏碱对高脂血症和非酒精性脂肪肝的治疗作用，

1、实验动物及方法：

C57BL小鼠，SPF级，雄性，体重(20±2)g，随机分成两组，第一组12只，为正常组，给与正常饲料，其余小鼠(44只)分为第二组，给与高脂饲料(基础饲料加入20％猪油，1.25％胆固醇，0.5％的胆酸钠)自由摄食、饮水。连续喂养8周后，从正常对照组和脂肪肝模型组分别处死4只小鼠，比较两组小鼠的血清和肝脏生化指标，以及肝脏组织病理切片，判断非酒精性脂肪肝模型小鼠是否建立成功。

将造模成功小鼠32只随机分为4组，分别为正常对照组(8只)，模型组(8只)，黄柏碱治疗组(8只)，阳性对照组(洛伐他汀组8只)，连续灌胃给药8周。给药期间，除正常对照组标准饲料饲养外，其余各组继续给予高脂饮食，直到实验结束。黄柏碱治疗组在高脂饮食同时采用口服灌胃(50mg/kg)方式给药，阳性对照组在高脂饮食同时采用口服灌胃洛伐他汀(60mg/kg)方式给药)

2、观察指标：

a动物的一般情况

实验动物在SPF动物房中饲养，12h光照12h黑夜，自由饮食饮水，实验期间动物状态正常。

b肝功能相关指标：血清ALT、AST，

c血脂相关指标：TC、TG、HDL、LDL

d病理学检查：HE染色

3、实验结果：

结果表明：黄柏碱均可明显降低血浆中的总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)，升高高密度脂蛋白(HDL)，降低低密度脂蛋白(LDL)，降低血浆中天门冬氨酸转氨酶(AST)，丙氨酸转氨酶(ALT)，病理切片结果显示有效缓解高脂饲料引起的非酒精性脂肪肝变性，改善因脂肪变性而导致的肝功能损害。

给药结束后测定小鼠、而脂水平。实验数据进行方差分析，结果以x±s表示。结果显示，黄柏碱对降低高脂效果明显，具有显著统计学差异。

表12.各组小鼠血脂指标的变化

表13各组小鼠肝功能相关指标的变化

实施例4

黄柏碱的制剂

黄柏碱片剂

黄柏碱10mg，淀粉88g，硬脂酸镁3g

制备工艺：取黄柏碱过100目筛，加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，压片，即得。

黄柏碱胶囊

黄柏碱10mg，淀粉88g，硬脂酸镁3g

制备工艺：取黄柏碱过100目筛，加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，装胶囊，即得。

黄柏碱注射液

黄柏碱47mg，注射用氯化钠7mg

制备工艺：取黄柏碱过100目筛，加1.9mL注射用水溶解，加入注射用氯化钠至等渗，调节pH值至7～7.1，滤过，冷藏24小时，加注射用水至规定量，滤过，灌封，灭菌，即得。

实施例4

黄柏碱的食品制剂

干酵母5g、温水90ml、水少许、面粉150g、黄柏碱5mg，植物油10g、低钠盐少许

饼干做法：把酵母撒在温水里搅拌倒溶化，加入黄柏碱。加入面粉搅拌，再加入植物油，揉成光滑的面团；面团制成0.2cm厚的薄片；压出造型，刺洞，表面撒上水，撒上一点低钠盐，室温发酵10分钟；烤箱预热120度，放在上层，烤约10分钟，得到含黄柏碱的食品。

实施例5

黄柏碱单体(纯度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10mL0.1M HCL氯仿溶液，析出沉淀，过滤干燥，得到盐酸黄柏碱单体，用1ml乙醇溶解，置冰箱4℃条件下放置24h，析晶，过滤干燥，得到盐酸黄柏碱单体。

黄柏碱单体(纯度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10mL0.1M H₂SO₄氯仿溶液，析出沉淀，过滤干燥，得到硫酸黄柏碱单体，用1ml乙醇溶解，过滤，滤液置冰箱4℃条件下放置24h，析晶，过滤干燥，得到硫酸黄柏碱单体。

黄柏碱单体(纯度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10mL0.1M磷酸氯仿溶液，析出沉淀，过滤干燥，得到磷酸黄柏碱单体，用1ml乙醇溶解，过滤，滤液置冰箱4℃条件下放置24h，析晶，过滤干燥，得到磷酸黄柏碱单体。

黄柏碱单体(纯度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10mL0.1M果酸氯仿溶液，析出沉淀，过滤干燥，得到果酸黄柏碱单体，用1ml乙醇溶解，过滤，滤液置冰箱4℃条件下放置24h，析晶，过滤干燥，得到果酸黄柏碱单体。

黄柏碱单体(纯度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10mL0.1M草酸氯仿溶液，析出沉淀，过滤干燥，得到草酸黄柏碱单体，用1ml乙醇溶解，过滤，滤液置冰箱4℃条件下放置24h，析晶，过滤干燥，得到草酸黄柏碱单体。

黄柏碱单体(纯度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10mL0.1M琥珀酸氯仿溶液，析出沉淀，过滤干燥，得到琥珀酸黄柏碱单体，用1ml乙醇溶解，过滤，滤液置冰箱4℃条件下放置24h，析晶，过滤干燥，得到琥珀酸黄柏碱单体。

黄柏碱单体(纯度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10mL0.1M醋酸氯仿溶液，析出沉淀，过滤干燥，得到醋酸黄柏碱单体，用1ml乙醇溶解，过滤，滤液置冰箱4℃条件下放置24h，析晶，过滤干燥，得到醋酸黄柏碱单体。

黄柏碱单体(纯度在91％～92％)100mg，先用10ml氯仿溶解，加入10mL0.1M丙酸氯仿溶液，析出沉淀，过滤干燥，得到丙酸黄柏碱单体，用1ml乙醇溶解，过滤，滤液置冰箱4℃条件下放置24h，析晶，过滤干燥，得到丙酸黄柏碱单体。