一种超声波耦合膜分离分级制备不同分子量枸杞多糖的方法

摘要

本发明涉及一种超声波耦合膜分离分级制备不同分子量枸杞多糖的方法，该方法利用超声波提取枸杞渣获多糖液，静置过夜，用尼龙网固液分离后，离心，先用6.7万分子量膜超滤，然后再用10万分子量膜超滤，分别收集分子量小于6.7万、6.7‑10万和分子量大于10万的超滤液，得到三种不同分子量的枸杞多糖溶液，经过浓缩后冷冻干燥，得到不同用途的枸杞多糖粉。本发明的方法获得多糖，具有节能、省时、绿色、无污染、环保等优点，可用于工业放大生产，膜分离后分级化的各种分子量的枸杞多糖适用于不同的食品行业，拓宽了应用范围，效果明显。

说明书

技术领域

本发明涉及一种枸杞多糖的制备方法，具体涉及一种超声波耦合膜分离分级制备不同分子量枸杞多糖的方法。

技术背景

枸杞(Lycium bararumL ) 是我国传统药食同源中药材，有滋阴补肾、养肝明目等功效。近年来，青海柴达木盆地人工栽培枸杞发展迅速，至2015年总种植面积达30万亩，超过了宁夏。柴达木盆地独特的自然条件和洁净的生态环境，方圆百公里范围无任何污染，昼夜温差较大，病虫害轻，施药次数少，农残检出率低，使柴达木枸杞具有颗粒大而饱满，肉质肥厚而核少，色泽鲜艳而味甘等特性，被誉为青藏高原“红宝石”，业内有“中国枸杞在宁夏，精品枸杞在青海”之说。新鲜枸杞在生产过程中，将会出现大量的枸杞果渣，通常这部分果渣将会被当作废品弃去，造成了很大的浪费，同时增加了企业的生产成本。经检测枸杞果渣中多糖含量达10.09%，枸杞多糖含量丰富，功效明确，逐步得到国内外的认可，应用领域不断扩展，具备广阔的市场前景。

枸杞多糖(Lycium Bararum polysaccharide，LBP) 是枸杞的主要功效成分，具良好的抗氧化活性，其主要药理作用有抗衰老、降血糖、降血脂、增强免疫功能、抗疲劳及抗肿瘤等，因此LBP作为天然抗氧化剂具很高的开发利用价值。LBP组成较为复杂，分子量可从几千到几十万。黄琳娟等从制备枸杞多糖LBP经DEAE-cellulose，Sephadex柱层析得到均一组分LbGP3、LbGP4和LbGP5，分子量分别为 2.37×10⁴、9.25×10⁴、21.48×10⁴；其中LbGP4枸杞子糖缀合物LbGp4经U-消除、柱层析分离后得到一条分子量高达180800的分支多糖化合物LbGp4-OL。LbGp4-OL糖基组成为n(Rha)∶n(Ara)∶n(Gal)=>1HNMR、¹³CNMR分析，确定了其主要的结构，并对LbGp4和LbGp4-OL的免疫活性进行了研究。研究发现：纯化后的糖缀合物LbGp4及糖链LbGp4-OL不仅对正常小鼠脾细胞增殖反应有明显的促进作用，而且对快速老化模型小鼠SAMP8和SAMR1免疫功能低下也有明显的改善作用，表明枸杞多糖具有直接促脾细胞增殖的作用。从它们的化学性质和分子结构来看，枸杞子糖缀合物LbGp4及其糖链LbGp4-OL的分子量都较大,并且糖链具有密集的分支,这在一般的植物多糖中是罕见的。因此,它具有较强的免疫调节作用可能与这种结构有关（黄琳娟等，药学学报，1998.33（7）:512-516；高等学校化学学报，2001.3（22）：407-411）。彭雪梅等采用柱色谱法得到枸杞糖缀合物LbGp2，经HPLC,CE,GC,SE及糖含量分析、元素分析和氨基酸分析等研究其理化性质，并用半体内法、形态学计数法和比色法等研究Lbp2对腹腔巨噬细胞吞噬功能、淋巴细胞的转化以及对小鼠血清半数溶血等的影响。结果发现LbGp2是均一组份，其分子量为6.8×10⁴，糖含量为90.7%，糖组成为Ara-Gal>

植物多糖的提取多种多样，但是提取活性多糖的方法却基本相似，都是利用多糖易溶于水、酸、碱而不溶于醇等有机溶剂的特点，但符合绿色、环保、无毒、具备较高提取效率的活性多糖的工业化提取、纯化的方法很少。

水溶性枸杞多糖的纯化方法一般有乙醇沉淀法、柱层析法和Sevage去除蛋白质法。乙醇沉淀法利用多数糖类物质不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂这一性质通过添加有机溶剂把不溶于溶剂的多糖类物质沉淀出来，从而达到和可溶性小分子物质（比如色素小分子、盐类小分子等）分离的目的得到多糖粗品；柱层析具有较高的分离效能，但凝胶柱价格昂贵，通常应用在实验室中制备少量的纯品，不适合在工业上大规模使用；Sevage去除蛋白质法存在有机试剂消耗大，操作复杂，多糖损失严重等缺点。超滤法提取纯化多糖具有工艺流程简单、产品纯度高等特点。膜分离技术由于具有无相变过程、无污染等优点，逐步在工业化生产中使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种超声波耦合膜分离分级制备不同分子量枸杞多糖的方法，该方法具有节能、绿色、环保、无污染的特点。本发明的方法使枸杞渣多糖下游分级提取制备，能够根据枸杞粗多糖的特点，充分利用无机尼龙网和有机超滤膜的特点，选择性的截留纯化浓缩枸杞多糖，满足大规模制备高纯度、不同应用效果的枸杞多糖的工业化生产需求。

本发明的技术方案是：一种超声波耦合膜分离分级制备不同分子量枸杞多糖的方法，其特征在于包括步骤：

步骤1，将枸杞渣晾干，用粉碎机粉碎，获得枸杞渣粉末；

步骤2，对步骤1枸杞渣粉末按质量体积比为1:20-30加入溶剂，室温浸泡3h，得料液；料液在超声功率为200-300w，超声波提取枸杞渣3次，每次20-30min，合并滤液，获得枸杞多糖提取液；

步骤3，对步骤2的枸杞多糖提取液，经60-75目8层尼龙网过滤，除去枸杞籽及不溶物；

步骤4，对步骤3除去枸杞籽及不溶物后的枸杞多糖提取液静置24小时，收集上清液，弃渣；

步骤5，对步骤4收集的上清液在离心分离机上，以7000-9000转、离心15-25min进行固液分离，收集上清液，弃渣，获得枸杞多糖清液；

步骤6，对步骤5所得的枸杞多糖清液再经过不同分子量的膜分离分级纯化，得到不同分子量的枸杞多糖溶液；所述的不同分子量的膜分离分级纯化是指先用6.7万分子量的超滤膜超滤，获得透过液和截留液，截留液再用10万分子量的超滤膜超滤，获得透过液和截留液，即分别收集到分子量小于6.7万、6.7万-10万和大于10万的超滤液；

步骤7，对步骤6所得的超滤液经浓缩后干燥，分别制得分子量小于6.7万的水溶性枸杞多糖粉、分子量为6.7-10万之间的水溶性枸杞多糖粉和分子量大于10万的水溶性枸杞多糖粉。

所述步骤1中的枸杞渣是枸杞生产企业制备枸杞系列产品过程中的残渣。

所述步骤2中的溶剂为水。

所述步骤2中的超声波提取所用的提取设备为超声波清洗器。

所述步骤6中的膜分离采用中空纤维膜小试设备。

所述步骤7中的超滤液的浓缩时，浓缩采用的设备是真空浓缩设备。

所述步骤7中的干燥为喷雾干燥或真空冷冻干燥。

本发明的优点是：本发明采用膜分离技术进行分离，根据枸杞多糖分子量的大小，选择分子截流量不同的膜进行分离，可以得到分子量大小不同的枸杞多糖，突出每种枸杞多糖的应用效果，拓宽了枸杞多糖的应用范围。同时协同超声波提取提高了枸杞多糖提取效果，而且省时、高效、节能、绿色和环保。

下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明，但不作为本发明的限定。

具体实施方式

实施例1

一种超声波耦合膜分离分级制备不同分子量枸杞多糖的方法，其特征在于包括步骤：

步骤1，将枸杞渣晾干，用粉碎机粉碎，获得枸杞渣粉末；

步骤2，对步骤1枸杞渣粉末按质量体积比为1:20加入溶剂，室温浸泡3h得料液；料液在超声功率为200w，超声波提取枸杞渣3次，每次20min，合并滤液，获得枸杞多糖提取液；所述溶剂为水；

步骤3，对步骤2的枸杞多糖提取液，经60目8层尼龙网过滤，除去枸杞籽及不溶物；

步骤4，对步骤3除去枸杞籽及不溶物后的枸杞多糖提取液静置24小时，收集上清液，弃渣；

步骤5，对步骤4收集的上清液在离心分离机上，以7000转、离心15min进行固液分离，收集上清液，弃渣，获得枸杞多糖清液；

步骤6，对步骤5所得的枸杞多糖清液再经过不同分子量的膜分离分级纯化，得到不同分子量的枸杞多糖溶液；所述的不同分子量的膜分离分级纯化是指先用6.7万分子量的超滤膜超滤，获得透过液（分子量小于6.7万的超滤液）和截留液（分子量大于6.7万的超滤液），截留液再用10万分子量的超滤膜超滤，获得透过液（分子量在6.7-10万的超滤液）和截留液（分子量大于10万的超滤液），即分别收集到分子量小于6.7万、分子量6.7万-10万和分子量大于10万的超滤液；

步骤7，对步骤6所得的超滤液经浓缩后干燥，分别制得分子量小于6.7万的水溶性枸杞多糖粉、分子量为6.7-10万之间的水溶性枸杞多糖粉和分子量大于10万的水溶性枸杞多糖粉。以葡萄糖为标品，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量；以牛血清蛋白为标样，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；以半乳糖醛酸为标样，采用咔唑-硫酸法测定样品中的半乳糠醛酸含量，结果见表1。

表1不同分子量枸杞多糖的多糖、蛋白质、半乳糠醛酸的含量

实施例2

一种超声波耦合膜分离分级制备不同分子量枸杞多糖的方法，其特征在于包括步骤：

步骤1，将枸杞渣晾干，用粉碎机粉碎，获得枸杞渣粉末；

步骤2，对步骤1枸杞渣粉末按质量体积比为1:25加入溶剂，室温浸泡4h，得料液；料液在超声功率为250w，超声波提取枸杞渣3次，每次25min，合并滤液，获得枸杞多糖提取液；所述溶剂为水；

步骤3，对步骤2的枸杞多糖提取液，经65目8层尼龙网过滤，除去枸杞籽及不溶物；

步骤4，对步骤3除去枸杞籽及不溶物后的枸杞多糖提取液静置24小时，收集上清液，弃渣；

步骤5，对步骤4收集的上清液在离心分离机上，以8000转、离心20min进行固液分离，收集上清液，弃渣，获得枸杞多糖清液；

步骤6，对步骤5所得的枸杞多糖清液再经过不同分子量的膜分离分级纯化，得到不同分子量的枸杞多糖溶液；所述的不同分子量的膜分离分级纯化是指先用6.7万分子量的超滤膜超滤，获得透过液（分子量小于6.7万的超滤液）和截留液（分子量大于6.7万的超滤液），截留液再用10万分子量的超滤膜超滤，获得透过液（分子量在6.7万-10万的超滤液）和截留液（分子量大于10万的超滤液），即分别收集到分子量小于6.7万、分子量6.7万-10万和大于10万分子量的超滤液；

步骤7，对步骤6所得的超滤液经浓缩后干燥，分别制得分子量小于6.7万的水溶性枸杞多糖粉、分子量为6.7万-10万之间的水溶性枸杞多糖粉和分子量大于10万的水溶性枸杞多糖粉。以葡萄糖为标品，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量；以牛血清蛋白为标样，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；以半乳糖醛酸为标样，采用咔唑-硫酸法测定样品中的半乳糠醛酸含量，结果见表2。

表2不同分子量枸杞多糖的多糖、蛋白质、半乳糠醛酸的含量

实施例3

一种超声波耦合膜分离分级制备不同分子量枸杞多糖的方法，其特征在于包括步骤：

步骤1，将枸杞渣晾干，用粉碎机粉碎，获得枸杞渣粉末；

步骤2，对步骤1枸杞渣粉末按质量体积比为1:30加入溶剂，室温浸泡5h，得料液；料液在超声功率为300w，超声波提取枸杞渣3次，每次30min，合并滤液，获得枸杞多糖提取液；所述溶剂为水；

步骤3，对步骤2的枸杞多糖提取液，经70目8层尼龙网过滤，除去枸杞籽及不溶物；

步骤4，对步骤3除去枸杞籽及不溶物后的枸杞多糖提取液静置24小时，收集上清液，弃渣；

步骤5，对步骤4收集的上清液在离心分离机上，以9000转、离心30min进行固液分离，收集上清液，弃渣，获得枸杞多糖清液；

步骤6，对步骤5所得的枸杞多糖清液再经过不同分子量的膜分离分级纯化，得到不同分子量的枸杞多糖溶液；所述的不同分子量的膜分离分级纯化是指先用6.7万分子量的超滤膜超滤，获得透过液（分子量小于6.7万的超滤液）和截留液（分子量大于6.7万的超滤液），截留液再用10万分子量的超滤膜超滤，获得透过液（分子量在6.7万-10万的超滤液）和截留液（分子量大于10万的超滤液），即分别收集到分子量小于6.7万、分子量6.7万-10万和大于10万的超滤液；

步骤7，对步骤6所得的超滤液经浓缩后干燥，分别制得分子量小于6.7万的水溶性枸杞多糖粉、分子量为6.7万-10万之间的水溶性枸杞多糖粉和分子量大于10万的水溶性枸杞多糖粉。以葡萄糖为标品，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量；以牛血清蛋白为标样，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；以半乳糖醛酸为标样，采用咔唑-硫酸法测定样品中的半乳糠醛酸含量，结果见表3。

表3.不同分子量枸杞多糖的多糖、蛋白质、半乳糠醛酸的含量

实施例4

比较例：方法1是以实施例3制备不同分子量枸杞多糖；方法2与实施例3制备枸杞多糖的步骤基本相同，不同的是方法2醇沉代替了膜分离；方法3与实施例3制备枸杞多糖的步骤基本相同，不同的是方法3没有醇沉或膜分离。

对比试验表4

对比试验表4显示，从多糖含量来看，醇沉>膜分离>不醇沉，通过化学试剂制备的多糖和膜分离制备的多糖相差不太大；从蛋白质含量来看，不醇沉>醇沉和膜分离，膜分离制备的多糖和化学试剂制备的多糖蛋白质含量接近；从半乳糖醛酸含量来看，不醇沉>醇沉和膜分离，膜分离制备的多糖和化学试剂制备的多糖半乳糖醛酸含量接近。表明没有任何化学试剂的膜分离制备工艺可行。

从上述对比试验表4说明，采用本发明的一种超声波耦合膜分离分级制备不同分子量枸杞多糖的方法效果好。

本发明方法获得的多糖，具有节能、省时、无污染、绿色、环保等优点，可用用于工业化生产，膜分离后分级纯化的各种分子量的枸杞多糖适用于不同的食品行业，拓宽了应用范围，效果明显。

本实施例没有详细叙述的工艺步骤或部件属本行业的常用手段或公知结构，这里不一一叙述。