稳定表达粘蛋白Mgfp‑5的转基因烟草愈伤组织的培养方法

摘要

本发明公开了稳定表达粘蛋白Mgfp‑5的转基因烟草愈伤组织的培养方法，(1)选取转基因烟草种子，接种于MS固体培养基上培养，得到T1代转基因烟草无菌苗；(2)将步骤(1)中的T1代转基因烟草无菌苗继代培养20d，选取继代培养后的叶片在愈伤组织诱导培养基中诱导培养，得到愈伤组织；(3)切取步骤(2)中所得的愈伤组织在继代培养基中固体或者悬浮继代培养，得继代愈伤组织。本发明稳定表达粘蛋白Mgfp‑5的转基因烟草愈伤组织的培养方法，可以为获得重组蛋白Mgfp‑5的原材料提供新途径，可以拓宽基因工程解决重组蛋白的研究领域，为研究植物表达贻贝粘蛋白提供参考，促进以植物源的重组蛋白Mgfp‑5的生物转化进程。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及稳定表达粘蛋白Mgfp-5的转基因烟草愈伤组织的培养方法。

背景技术

随着生物技术的发展，植物组织培养生产次生代谢物，可以用于植物次生代谢产物的工厂化生产。自从Nickell(1956)第一次证明植物细胞可以象微生物一样进行培养而不断生长一来，以植物培养细胞或者组织为材料生产次生代谢物就迅速发展起来。植物组织培养具有细胞增殖快、培养周期短、材料均一、重复性好、不受季节与环境限制等优点，在烟草组织和细胞培养、基因转化和次生物质生产等已有不少成功报道。

贻贝粘蛋白(Mussel Adhesive Protein，MAP)是海洋软体动物贻贝(Mytilidae)足部的足丝腺分泌的一类具有粘性的蛋白质，也称贻贝足丝蛋白(Mussel Foot Protein,Mfp)，其粘性、防水性及耐腐蚀性强，而且无毒害、无免疫原性且生物相容性好，是一种优质的医学粘附材料。目前足丝盘中的6种贻贝粘蛋白类型中，Mfp-5粘性最强。

现用的贻贝粘蛋白主要是天然获取，但是其易固化且含量低，难获得、成本高，制约了其应用。已有用原核表达(大肠杆菌)及真核表达(巴斯德酵母)系统获得基因工程重组的贻贝粘蛋白，但是表达量或者粘附性能均不如意。前期我们将地中海贻贝蛋白Mgfp-5(Mytilus galloprovincialis foot protein type 5)基因在模式植物烟草中顺利表达，这为重组粘蛋白的研究准备了材料。然而未见到借助烟草组织研究重组蛋白Mgfp-5的报道，并以此为材料关注优质医用粘合剂的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种稳定表达粘蛋白Mgfp-5的转基因烟草愈伤组织的培养方法，为获得重组蛋白Mgfp-5的原材料提供了新途径，可以拓宽基因工程解决重组蛋白的研究领域，为研究植物表达贻贝粘蛋白提供参考，促进以植物源的重组蛋白Mgfp-5的生物转化进程。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，稳定表达粘蛋白Mgfp-5的转基因烟草愈伤组织的培养方法，该方法如下：(1)选取转基因烟草种子，接种于MS固体培养基上培养，得到T1代转基因烟草无菌苗；转基因烟草种子为转mgfp-5基因的烟草种子；

(2)将步骤(1)中所得的T1代转基因烟草无菌苗继代培养20d，选取继代培养后的叶片在愈伤组织诱导培养基中诱导培养，得到愈伤组织；

(3)切取步骤(2)中所得的愈伤组织在继代培养基中固体或者悬浮继代培养，得继代愈伤组织。

进一步地，步骤(1)中的MS固体培养基上附加有20mg/L Kan，且无激素；

该愈伤组织诱导培养基包括如下：20mg/L Kan、3％蔗糖(w/v)和0.7％琼脂(w/v)的MS固体培养基(pH 6.0)组成；

当固体继代培养愈伤组织时，所述继代培养基包括：固体培养基MS、2,4-D 0.5～1.5mg/L、6-BA 0.1～0.5mg/L、NAA 0.1～0.3mg/L、Kan 20mg/L 和蔗糖3％，pH5.8～6.2组成；当液体继代培养愈伤组织时，所述继代培养基包括：液体培养基MS、2,4-D 0.5～1.5mg/L、6-BA 0.1～0.5mg/L、NAA 0.1～0.3mg/L、Kan 20mg/L和蔗糖3％组成。

进一步地，当固体继代培养愈伤组织时，继代培养基包括：固体培养基MS、2,4-D1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.1mg/L、20mg/L kan和蔗糖3％，pH5.8～6.2组成；当液体继代培养愈伤组织时，该继代培养基包括：液体培养基MS、2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、NAA0.1mg/L、kan 20mg/L和蔗糖3％组成。

进一步地，该烟草种子培养的条件为25±2℃，光照强度为30～50mol·m^-2·s^-1，每天16h/8h光/暗培养；

该诱导培养的条件为在25±2℃的温度下，黑暗培养20d。

该继代培养的条件为：当固体继代培养愈伤组织时，切取疏松愈伤组织，在固体继代培养基中培养30～33d；当悬浮继代培养愈伤组织时，选取疏松愈伤组织，以接种量5％(m/v)于液体培养基中，25±2℃，100rpm振荡培养20～21d。

进一步地，该转基因烟草种子接种前需预处理，预处理过程如下：用75％酒精浸泡转基因烟草种子30s，然后用0.1％升汞(含吐温-80)灭菌8min，无菌水冲洗5次。

本发明稳定表达粘蛋白Mgfp-5的转基因烟草愈伤组织的培养方法具有如下优点：本发明所提供的转mgfp-5基因烟草愈伤组织诱导及培养方法，可以稳定表达粘蛋白Mgfp-5，并且具有细胞增殖快、培养周期短、材料均一、重复性好、不受季节与环境限制等优点，可以为获得重组蛋Mgfp-5的原材料提供新途径，含有Mgfp-5蛋白的愈伤组织的研究可以为植物中的贻 贝粘蛋白表达提供参考，促进以植物源的重组蛋白Mgfp-5的生物转化进程，助力突破重组蛋白Mgfp-5的临床应用的瓶颈。

附图说明

图1是本发明稳定表达粘蛋白Mgfp-5的转基因烟草愈伤组织的培养方法流程示意图；

图2是本发明中转mgfp-5基因的烟草T1代图；

a-b.抗性无菌小苗；

c-d.愈伤组织；

图3是本发明中烟草愈伤组织固体培养生长曲线；

图4是本发明中烟草愈伤组织悬浮培养倍增曲线；

图5是本发明中mgfp-5的PCR(A)与RT-PCR(B)分析；

图6是本发明中mgfp-5蛋白Western blot分析；

CK：野生烟草；1-3依次为转基因烟草T1幼叶、固体培养组织和液体培养组织。

具体实施方式

本发明中使用的质粒提取、纯化与胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，cDNA反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司DNA聚合酶、引物由上海生工生物工程有限公司提供和合成，卡那霉素(kanamycin，Kan)购自Sigma公司(美国)，其他试剂均为分析纯。

本发明中使用的MS基本培养基按手册通用方法配制，组成与含量为：NH₄NO₃1650mg/L，KNO₃>2·2H₂O>4·7H₂O>2PO₄>3BO₃>4·4H₂O>4·7H₂O>2MnO₄·2H₂O0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O>2·6H₂O>4·7H₂O>2-EDTA·2H₂O>

在本发明中，实验材料转mgfp-5基因烟草T1代种子为西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室和西北大学生物技术省级重点实验室鉴定并保存。

实施例1

本发明稳定表达粘蛋白Mgfp-5的转基因烟草愈伤组织的培养方法，如图1所示：

(1)选取转mgfp-5基因的烟草种子，用75％酒精浸泡30s，用0.1％升汞(含吐温-80)灭菌8min，无菌水冲洗5次，在附加20g/L Kan(kanamycin，Kan，卡那霉素)无激素的MS固体培养基，25±2℃，光照强度为30～50mol·m^-2·s^-1，每天16h/8h光/暗培养，萌发T1代转基因烟草无菌苗；

(2)将步骤(1)中所述的T1代转基因烟草无菌苗继代培养20d，选取叶片为外植体，在愈伤组织诱导培养基中诱导培养，得到愈伤组织；愈伤组织诱导培养基包括如下：20mg/LKan、3％蔗糖(w/v)和0.7％琼脂(w/v)的MS固体培养基(Ph 6.0)组成；诱导培养的条件为在25±2℃的温度下，黑暗培养20d；

(3)切取步骤(2)中所得的愈伤组织在继代培养基中固体或者悬浮继代培养，得继代愈伤组织；固体培养基MS、2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.1mg/L、20mg/L kan和蔗糖3％，pH5.8～6.2组成；当液体继代培养愈伤组织时，继代培养基包括：液体培养基MS、2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5 mg/L、NAA0.1mg/L、Kan20mg/L和蔗糖3％组成。继代培养的条件为：当固体继代培养愈伤组织时，切取疏松愈伤组织，在固体继代培养基中培养30～33d；当悬浮继代培养愈伤组织时，选取疏松愈伤组织，以接种量5％(m/v)于液体培养基中，25±2℃，100rpm振荡培养20d或21d。

实施例2—9与实施例1的不同之处在于步骤(3)，步骤(3)中的2,4-D、6-BA和NAA的浓度不同，各实施例如表1所示，

表1不同生长调节剂水平对愈伤组织诱导的影响

注：“+”为少量出愈；“++”为重量出愈；“+++”为大量出愈。

取继代培养20d后的无菌苗叶片外植体()，在附加20mg/L Kan，3％蔗糖(w/v)、0.7％琼脂(w/v)和不同激素的MS基本培养基上，25±2℃，暗培养20d后诱导产生愈伤组织(图2b)。40d后统计不同生长调节剂水平对愈伤组织诱导的影响(表1)，2,4-D、6-BA和NAA的存在可以顺利诱导得到胚性愈伤，3种激素对愈伤组织诱导的影响程度依次为2,4-D、6-BA、NAA。较高浓度的2,4-D和6-BA更易形成胚性愈伤组织，颜色黄绿为主，相反高浓度的NAA可以愈伤化程度增高，诱导形成黄绿色的愈伤组织呈现致密型， 随着培养时间的延长，生长缓慢，组织块易褐化。综合愈伤诱导率以及组织形态和生长状况，在附加2,4-D1.0mg/L、6-BA0.5mg/L、NAA0.1mg/L和20mg/L Kan的MS固体培养基上，出愈率100％，浅黄绿色的胚性愈伤组织疏松，组织活性高易存活，状态最好。

1.固体培养愈伤组织生长曲线的绘制：

取长势较好的疏松愈伤组织，切成0.5cm²均匀小块于MS、2,4-D1.0mg/L、6-BA0.5mg/L、NAA0.1mg/L和20mg/L>

2.悬浮培养愈伤组织生长曲线：

碾碎长势较好的疏松愈伤组织，按照接种量5％(m/v)在附加2,4-D1.0mg/L、6-BA0.5mg/L、NAA0.1mg/L和20mg/L Kan的MS液体培养基中，25±2℃，100rpm，可以迅速生长成小组织团，如图2c所示。选取一致的胚性悬浮组织团碾碎，5％(m/v)接种于30mL液体培养基继代培养，每3d收获3瓶细胞，统计鲜重(平均值)与干重(总值)的倍增值，对应培养时间，呈现绘制“S”型，如图4所示生长曲线。悬浮培养胚性组织的需要6d的培养延迟期适应新鲜培养液环境；之后进入对数长期，迅速生长呈现愈伤组织团，9天内可以增加鲜质量8.56-8.63倍，干重增加7.94-8.10倍，持续到15d进入生长减缓期，提示需要更替培养液。

3.愈伤组织中外源基因mgfp-5鉴定：

用改良的CTAB法和Trizol法分别提取新鲜固/液培养愈伤组织及野生对照(CK)植株幼叶基因组DNA和RNA，用特异性PCR引物(5’-CCAGGCAATACTTACCACTA-3’，

5’-CAGGAAACAGCTATGACCATGATTA CG-3’)和RT-PCR引物(5’-GGAATTCCATATGAGTTCTGAAGAA-3’，

5’-GG GGTACCCTAATGGTGATGGTG-3’)，在20μL反应体系(含Taq酶0.5μL，PCRBuffer 2μL，引物10μmol/L，1和2各1.0μL，模板1.0μL，ddH₂O>

4.愈伤组织中重组蛋白Mgfp-5鉴定：

取新鲜固/液培养愈伤组织、转基因烟草幼叶及野生对照(CK)植株幼叶，提取植物总蛋白，以牛血清白蛋白(BSA)为标准，Bradford方法分析总可溶性蛋白的含量，再根据目的基因上游位点串联的6个His-tag，用Ni-NTA柱(Qiagen)纯化Mgfp-5融合蛋白，SDS-PAGE电泳，电转印至PVDF膜，以抗His一抗(1:2000，鼠单抗)及二抗(1:5000)进行Western blot图6检测，显色条带的位置与转基因烟草幼叶中Mgfp-5蛋白预期的大小一致，显示重组蛋白Mgfp-5可以在稳定表达在转基因烟草的固/液培养愈伤组织里。