一种无血清成分的眼角膜中期保存液

摘要

本发明涉及一种无血清成分的眼角膜中期保存液，其成分为：复方电解质眼内冲洗液，氯化钠，硫酸镁，磷酸二氢钾，硫酸软骨素，玻璃酸钠，HEPES缓冲液，盐酸地塞米松，还原型谷胱苷肽，左氧氟沙星；是一种具有特定电解质离子浓度，pH值，晶体渗透压和胶体渗透压的微红色、透明液体。该角膜保存液所需原料易得，不含血清成分，避免了传染某些特殊病毒的风险，其以各种离子来平衡细胞内、外液的渗透压，保存效果显著。

说明书

技术领域

本发明属于化学组合物技术领域，具体为一种无血清成分的眼角膜中期保存液及其制备方法和应用。

背景技术

眼角膜的保存方法在临床应用方面多为活性保存。常见的角膜的活性保存(眼库的重要技术之一)根据角膜内皮细胞的活性的保存时间可分为短期、中期、长期3种。短期保存方法是将角膜组织无菌处理后湿房4℃保存，保存时间在24小时之内。中期保存一般采用保存液保存，使用目前世界范围内最常用的是角膜活性保存液，如Optisol，可保存角膜内皮细胞活性达14天。长期保存，如器官培养法，可保存角膜组织活性4周，以用于临床。

鉴于短期保存的保存时间过于短暂，长期保存法的方法复杂，所需设备昂贵，不易推广应用，所以用角膜保存液进行中期保存是当前最受认可的方法和研制的热点。然而很多中期保存液内用血清成分来维持组织的营养和细胞内外液的平衡，虽有一定效用，但存在传染某些特殊病毒的风险。因而应用不含生物成分(血清)的各种离子来平衡细胞内、外液的渗透压是开发新型角膜保存液的方向。

我国角膜活性保存液如今仍依赖于进口，如最常使用的Optisol保存液，虽然在保持角膜内皮细胞活性方面功能显著，但价格昂贵，且由于国内无此产品的经销，无法推广应用。因此，我国目前多应用短期方法保存角膜，这使得原本就严重匮乏的角膜供体材料来源因保存问题更添危机。由此可见，研制理想的，并符合我国国情的新型角膜中期保存液以最大限度的利用有限的供体材料是亟待解决的问题。

角膜保存液的研发，对我国眼库的建设将起到重要作用，将有利于角膜供体的保存，以及其在单位间、地区间合理流动，并对于充分合理的利用珍贵的角膜供体资源，救治更多的眼疾病患具有非常重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种不含血清成分、以特定电解质离子浓度来维持角膜细胞内外压平衡的眼角膜中期保存液的制备方案。

本发明所述的眼角膜保存液其成分为：

1、复方电解质眼内冲洗液作为保存液母液；

2、氯化钠2.34-2.92g/L、硫酸镁0.6-0.72g/L，磷酸二氢钾2.72-4.08g/L，使晶体渗透压维持在330-380mOsm/kgH2O之间；

3、硫酸软骨素25-30g/L，玻璃酸钠5-10g/L，来维持其液体的胶体渗透压为310-350mOsm/kg H₂O之间。由于硫酸软骨素、玻璃酸钠的协同作用，可以减少角膜保存液中的负电荷，同时保持一定的胶体渗透压，使被保存的眼角膜在保存期不发生水肿；

4、盐酸地塞米松1-2mg/L，还原型谷胱苷肽1.5-3g/L，以稳定角膜细胞溶酶体膜及生物膜，增强细胞对内毒素的抵御能力，更好地保持角膜细胞的形态和功能；

5、HEPES缓冲液20-25ml/L，用以调节pH值为7.2-7.5；

6、左氧氟沙星0.1-0.2g/L，用以杀灭供体携带的革蓝氏阳性和阴性的病原菌。

本发明所述的角膜保存液为微红色、透明液体；以20ml为一个瓶装单位，用于单片角膜的保存。

附图说明

图1人新鲜角膜放入角膜保存液0天，眼库用角膜内皮镜检测，内皮细胞数2300个/mm²

图2人新鲜角膜放入角膜保存液14天，眼库用角膜内皮镜检测，内皮细胞数2100个/mm²

图3人新鲜角膜放入角膜保存液0天，茜苏红染色，50％角膜内皮细胞为较典型的六边形，细胞数2350个/mm²

图4人新鲜角膜放入角膜保存液14天，茜苏红和胎盼蓝联合染色，45％角膜内皮细胞为较典型的六边形，约8-10％内皮细胞核着色，说明细胞已失去活性，细胞数2150个/mm²

图5猫鲜角膜放入角膜保存液14天，茜苏红染色，65％角膜内皮细胞为较典型的五边形，细胞数4150个/mm²

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，这些实施例只用于进一步详述说明本发明，不能理解为对本发明保护范围的限定，在本发明保护范围之内做出非本质的调整需本发明方授权。

本发明的实施例1

角膜保存液的制备：

1、复方电解质眼内冲洗液500ml作为母液待用；

2、取硫酸软骨素25g加入去离子水275ml加热溶解高压灭菌，制成硫酸软骨素溶液；氯化钠2.93g、硫酸镁0.6g，磷酸二氢钾2.72g加入注射用水100ml溶解高压灭菌，制成钠镁钾盐溶液；玻璃酸钠5g，加入注射用水100ml溶解高压灭菌，制成玻璃酸钠溶液；

3、取无菌容器加入复方电解质眼内冲洗液500ml，高压灭菌硫酸软骨素275ml，钠镁钾盐溶液100ml，玻璃酸钠溶液100ml；加入还原型谷胱苷肽3g，地塞米松注射液1.5mg，左氧氟沙星注射液0.2g混匀；

4、Hepes缓冲液调节PH值至7.2

5、调节晶体渗透压为340mOsm/kgH₂O；

6、调节胶体渗透压为350mOsm/kgH₂O；

7、分装为每20ml的保存瓶中，4度冷藏备用。

本发明的实施例2

对角膜保存液的效果检测：

1、取新鲜(宰后2小时内取得)猪眼球，无菌处理，并剪取带1-2mm巩膜缘的全角膜，分别置于20ml实施例1制备的角膜保存液和20ml作为对照的Optisol角膜活性保存液中；

2、于4℃条件下保存3天、7天和14天，以备对保存效果检测。

3、于保存3天取出角膜片，行锥兰染色，结果发现角膜活性保存液保存的角膜内皮细胞的数量、六边形态及角膜的透明度与对照的Optisol角膜活性保存液之间没有差别；

4、于保存1周时取出角膜片，行锥兰染色，结果发现角膜活性保存液保存的角膜内皮细胞的数量、六边形态及角膜的透明度与对照的Optisol角膜活性保存液之间没有差别；

5、于保存至2周时取出角膜片，行锥兰染色，结果发现角膜活性保存液保存的角膜内皮细胞的数量、六边形态及角膜的透明度在与对照的Optisol角膜活性保存液之间没有差别，角膜活性保存液组内皮细胞的数量下降，但角膜片内皮细胞数在1800个/mm²以上，角膜透明度良好。

本发明的实施例3

角膜中期保存液保存猫角膜用穿透性角膜移植：

1、取新鲜(宰后2小时内取得)猫角膜植片于实施例1所配角膜保存液中，4℃冷藏保存2周，待移植；

2、健康家猫6只，行麻醉后，常规应用直径7.0mm环钻，钻切中央角膜；切下角膜后，取保存2周的猫角膜植片置于切割枕上，用7.25mm直径的环钻从内皮面钻取植片，覆盖在猫角膜植孔上，10/0尼龙缝线间断缝合，水密形成前房；

3、术后1天、3天、5天、7天及14天用裂隙灯观察角膜植片透明度，14天用角膜内皮镜检测角膜植片内皮数；结果发现，术后1-3天，植片透明，轻度水肿，术后5天，植片透明度一直保持良好，术后14天，角膜内皮镜检查内皮细胞数均在1800个/mm²以上。

本发明的实施例4

人新鲜角膜保存后的角膜内皮细胞密度及角膜内皮细胞形态的检查：

1、人角膜组织(各种原因死亡的捐献者，6小时内取材)共40例，放置于眼库用角膜保存瓶内，每个角膜材料均使用20ml保存液，其中20片角膜放入实施例1所配保存液中，另20片放入进口的Optisol角膜中期保存液，封口膜封好瓶口，放于4℃冰箱保存。

2、使用眼库专用内皮显微镜对角膜材料进行监测，进行内皮细胞计数和形体分析，检测时间点分别为0天、1天、3天、7天和14天。

3、结果发现，保存时间7天，角膜内皮细胞密度与0天无统计学差异。在保存14天后，角膜内皮细胞计数为2252±32(个/mm²)；内皮细胞六边行比率从0天的45％，到14天的32％；角膜内皮细胞死亡率为(9.10±4.4)％。本发明的保存液和Optisol角膜中期保存液的效用没有差别。使用该实施例1所配角膜中期保存液存放角膜期间，角膜内皮细胞活性稳定，变化较小。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。