将表面改性的软骨细胞衍生细胞外基质膜作为有效成分包含的组合物在防止粘连中的应用

摘要

本发明公开一种将表面改性的软骨细胞衍生细胞外基质膜作为有效成分包含的组合物在防止粘连中的应用，其中观察到纤维细胞针对软骨衍生细胞外基质材料的附着效率在体外较低，而在利用小鼠的皮下粘连动物模型和利用老鼠的肠粘连模型中，表现出优秀的粘连防止效果。并且，在利用多聚赖氨酸(poly‑L‑lysine；PLL)而将本素材的表面电荷改性成中性的情况下，确认到粘连防止效果显著增加，因此可以利用软骨细胞衍生细胞外基质材料而用作体内稳定性和粘连防止效果优秀的粘连抑制剂。

说明书

技术领域

本发明涉及一种将被表面改性的软骨细胞衍生细胞外基质膜作为有效成分包含的组合物在防止粘连中的应用。

背景技术

粘连指需要彼此分离的脏器的组织面由于外科手术或炎症而连接、融合成纤维性组织的现象，并且因此而产生小肠阻塞、后天性女性不孕、宫外孕、慢性腹痛、再手术等并发症。这种粘连在外科手术后50～90％发生，并且因为粘连而接受再手术的患者多达34.6％。粘连与产生创伤后表现出的治愈过程相似，因此在不妨碍治愈过程的情况下防止粘连的方法尤为重要。粘连是在手术部位的治愈过程中，正常沉积的纤维素在伤口的治愈过程结束后仍旧持续产生而与相邻的其他组织结合的现象。为了防止这样的粘连，可以使用防粘连剂而作为物理屏障或者使用纤维素分解药物。

现有的防粘连剂通常使用纤维素(cellulose)或者透明质酸而起到物理屏障的作用，除此之外，还较多地使用胶原(collagen)等天然素材。但是目前商业化的产品的粘连防止效果不明显。对于使用最多的防粘连剂Interceed而言，其使用所产生的粘连防止效果只有60％(www.ethicon.com)。并且，这种防粘连剂会被识别成外部物质而引发炎症反应或者反而妨碍伤口的治愈。并且，虽然粘连有可能在手术后的长时间内产生，然而目前使用的防粘连剂因为很快被分解而难以持续发挥效果。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供一种将表面电荷被表面改性成中性的软骨细胞衍生细胞外基质膜作为有效成分而包含的组合物在防止粘连中的应用。

技术方案

本发明提供一种组合物在粘连防止中的应用，所述组合物将通过利用乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(ethyl(dimethylaminopropyl)carbodiimide；EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide；NHS)和多聚赖氨酸(poly-L-lysine；PLL)而进行处理从而表面电荷被表面改性成中性的软骨细胞衍生细胞外基质膜作为有效成分而包含。

有益效果

本发明涉及一种将表面改性的软骨细胞衍生细胞外基质膜作为有效成分包含的组合物在防止粘连中的应用，其中观察到纤维细胞针对软骨衍生细胞外基质材料的附着效率在体外较低，而在利用小鼠的皮下粘连动物模型和肠粘连模型中，表现出优秀的粘连防止效果。并且，在利用多聚赖氨酸(poly-L-lysine；PLL)而将本材料的表面电荷改性成中性的情况下，确认了粘连防止效果显著增加，因此可以利用软骨细胞衍生细胞外基质材料而用作体内稳定性和粘连防止效果优秀的粘连抑制剂。

附图说明

图1示出软骨细胞衍生细胞外基质膜。

图2是将软骨衍生细胞基质膜的表面用多聚赖氨酸(poly-L-lysine；PLL)改性后，用ZETA电位(Zeta potential)测量其表面电荷的变化的结果。

图3是对软骨细胞衍生生物膜的纤维细胞的粘附能力评价结果。

图4是在小鼠的皮下粘连模型中观察软骨衍生生物素材的粘连防止效果的结果(Gross image)。在使用生物膜的情况下，可以确认粘连部位有所减少。

图5是针对肠粘连模型中的软骨衍生生物素材的粘连防止效果的组织学观察结果。其中可以确认在处理生物膜时，炎症细胞的入侵有所减少。

图6示出利用软骨细胞衍生生物素材的多种形态(膜、海绵、粉末及凝胶的防粘连用生物材料)。

最优实施形态

因此，本发明中为了克服上述缺点而开发了一种体内稳定性和粘连防止效果出众的利用了软骨细胞衍生细胞外基质素材的防粘连剂。在之前的研究中，本研究小组开发了一种软骨衍生细胞外基质成分的生物膜，并且公开了这种生物膜可以在治疗软骨损伤的骨髓刺激术(bone marrow stimulation technique)中被用作防止血块的流失的用途。软骨衍生细胞外基质材料主要由第2型胶原和蛋白多糖构成，因此与其他天然生物素材不同，本研究小组在之前的研究中，观察到了血管内皮细胞对本素材的附着效率相对较低从而具有抑制血管形成的效果，但是之前没有公开过软骨衍生细胞外基质素材的粘连防止效果。在外科手术后组织的粘连中，参与有新生血管的形成，但是已知主要原因是纤维细胞的附着。本发明中，观察到了在体外(in vitro)，纤维细胞对软骨衍生细胞外基质素材的附着效率较低，并且在利用小鼠(mouse)的皮下粘连动物模型和利用大鼠(rat)的肠粘连模型中，表现出了优秀的粘连防止效果。并且，在利用多聚赖氨酸(poly-L-lysine；PLL)而将本素材的表面电荷改性成中性的情况下，观察到了粘连防止效果有显著的提高，据此完成了本发明。

本发明提供一种将表面电荷被表面改性成中性的软骨细胞衍生细胞外基质膜作为有效成分而包含的用于防止粘连的组合物。

优选地，所述表面改性可以利用乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(ethyl(dimethylaminopropyl)carbodiimide；EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide；NHS)和多聚赖氨酸(poly-L-lysine；PLL)而进行处理，但不限于此。

本发明的软骨细胞衍生细胞外基质膜包括在体外培养软骨细胞而分泌的基质膜以及利用在体外由软骨细胞自然生产的基质的基质膜。

优选地，所述软骨细胞衍生细胞外基质由胶原和蛋白多糖(glycosaminoglycan)形成。

优选地，所述软骨细胞衍生细胞外基质膜是从动物软骨细胞中分泌而形成的软骨细胞衍生细胞外基质，更优选地，可以是从动物的膝盖关节软骨细胞中分泌而形成的软骨细胞衍生细胞外基质。更优选地，可以是获得无菌猪的膝盖软骨组织的细胞并在高浓度下移植并培养，由此形成的膜形态。

具体地，所述软骨细胞衍生细胞外基质膜可以通过抑制手术部位的纤维化和炎症而防止粘连的形成。所述粘连可以是皮下粘连或者肠粘连，但不限于此。

并且，所述软骨细胞衍生细胞外基质膜可以以软膏、粉末、胶、薄膜、板、包裹膜(wrap)以及海绵形态的移植材料或者封阻剂的方式提供，从而可以防止在手术部位形成粘连。

具体实施方式

以下，根据不限制本发明的实施例而对本发明进行详细的说明。本发明的下述实施例仅用于具体化本发明，显然不应限制或限定本发明的权利范围。因此，本发明所属技术领域的专业人员能够从本发明的具体说明及实施例容易地类推的内容应属于本发明的权利范围内。

<实施例1>制作软骨细胞衍生细胞外基质膜

获得无菌猪膝盖软骨组织的细胞并在高浓度下移植而培养后而得到膜形态。将通过上述方法得到的膜利用脱氧核糖核酸酶I(DNase I)等酶进行脱细胞并进行清洗而得到软骨细胞衍生细胞外基质膜。其中的主要组成成分为胶原和蛋白多糖(参考韩国授权专利公报第10-0816395号)(图1)。

<实施例2>软骨细胞衍生细胞外基质膜的表面改性

将在实施例1中得到的膜放入将乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(ethyl(dimethylaminopropyl)carbodiimide；EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide；NHS)以50mM制备于蒸馏水的溶液，并在250rpm下摇晃12个小时且在常温下进行处理。然后，将多聚赖氨酸(poly-L-lysine；PLL)以10ug/ml制备于蒸馏水后，放入EDC/NHS处理后的膜而在250rpm下摇晃24小时且在常温下进行处理。在处理完毕后，在三蒸水中将薄膜清洗三次且每次清洗10分钟后进行干燥。为了测量完成表面改性后的膜的表面电势差而将其固定在玻璃板，并在10mM的氯化钠中放入能够因电力而移动的监视粒子后，用固定的膜覆盖并使电流流动，据此测量表面的电荷(ELS Zeta potential，Otsuka)。

在用ZETA电位测量改性前后的表面电荷时，改性前为-32.4±2mV，可以确认较强负电荷的存在，在测量利用PLL表面改性的膜的情况下，可以确认-3±2mV的接近中性的表面电荷值(图2)。

<实施例3>纤维细胞附着实验

本实施例中，利用在细胞培养皿、实施例1和实施例2中准备的软骨衍生细胞外基质膜而通过下述方法确认了在粘连机制中起作用的纤维细胞的附着率差异。

令实施例1中准备的软骨衍生细胞外基质膜和实施例2中准备的改性后的膜贴附到直径为5mm的不同的24孔皿(well dish)后进行干燥而固定，并进行了环氧乙烷气体(EOgas)灭菌。并且在涂覆有各个膜的皿和没有被涂覆的24孔板(well plate)中移植2×10⁴纤维细胞而使其贴附24小时。然后，用PBS缓冲液清洗没有被贴附的细胞并进行MTT法(MTTassay)而确认了贴附于各个表面的细胞(在460nm的吸光度下测量)。

如图3所示，其结果为，在没有涂覆薄膜的细胞培养皿中表现出了最高的细胞贴附率，且软骨衍生细胞外基质膜中的细胞贴附较低。尤其在涂覆改性后的表面电荷接近中性的膜的结果中，可以确认最低的细胞贴附。因此，可知软骨衍生细胞外基质膜本身阻碍纤维细胞的贴附，并且在改变表面电荷的情况下，可以确认其效果更好。

<实施例4>小鼠皮下粘连模型

利用8周龄的C57BL6小鼠而制作了粘连模型。分别切开小鼠腹部的皮肤层和肌肉层，并缝合肌肉层和皮肤层而制造了在损伤的组织之间产生粘连的模型，由此确认了粘连效果。粘连组织在1周后产生并形成了使肌肉和皮肤强力地贴附的粘连模型。

在通过上述方法制造的皮下粘连模型中，在肌肉层和皮肤层之间的形成粘连组织的部位移植seprafilm软骨衍生细胞外基质膜和改性的膜后，确认了1周结果(图4中的第一行)。在仅诱导粘连的组中，粘连组织在1周期间以围绕伤口的方式较厚地生成。在移植目前销售的产品seprafilm的情况下，薄膜被吸收而未被确认，并且可以确认肌肉层和皮肤层被分离。在移植软骨衍生细胞外基质膜的情况下，可以观察到肌肉层和皮肤层被分离，且没有形成粘连组织。但是可以确认围绕伤口部位的膜的形态。在移植改性的软骨衍生细胞外基质膜的情况下，可以确认在产生肌肉和皮肤层的分离的同时，以伤口为中心围绕膜的形态比改性前的组更小，因此粘连防止效果更优秀。

通过苏木精和曙红染色而对上文中获得的组织进行了细胞和细胞质染色(图4中的第二行)。其结果为，细胞集中于软骨衍生细胞外基质膜本身而在物理层面上防御肌肉层和皮肤层而起到防止在两个组织之间形成粘连组织的作用。并且在改性的膜中，可以确认起到阻碍细胞的贴附而仅使膜本身存在于皮肤层和肌肉层之间，并防止在两个组织之间形成粘连组织的的物理防御作用。

<实施例5>大鼠肠粘连模型

利用8周龄的SD大鼠而制造了粘连模型。在切开大鼠腹部后在盲肠的表面和腹壁形成伤口，之后对两个组织的伤口部位进行缝合而固定，从而制造了产生粘连的模型并确认了粘连效果。粘连组织在1周产生，并且在腹壁和盲肠之间强烈地形成粘连组织而确认了两个组织的贴合。在上文中制造的肠粘连模型中，在腹壁和盲肠之间的形成粘连组织的部位移植seprafilm软骨衍生细胞外基质膜和改性的膜后，通过缝合固定后确认了1周结果(图5的第一行)。在仅诱导粘连的组中，盲肠在1周期间强力地贴附在腹壁并在其之间形成了厚的粘连组织。在移植seprafilm的情况下，可以确认在固定薄膜的两个末端部位产生了粘连，但是在被薄膜覆盖的部分中，腹壁和盲肠被分离。在移植软骨衍生细胞外基质膜的情况下，观察到腹壁和肌肉层根据膜而被分离，但是膜和周围组织彼此贴合。相反，在移植改性的细胞外基质膜的情况下，可以确认在产生腹壁和盲肠的分离的同时，膜在切口部位的周围以区别明显的方式存在。

通过苏木精和曙红染色而对上述组织进行了细胞和细胞质染色(图5中的第二行)。其结果观察到，对于软骨衍生细胞外基质膜而言，移植的膜存在于腹壁和盲肠之间，但是细胞在膜的周围密集，且结合有周围组织。相反，对于改性的膜而言，可以确认通过阻碍细胞的贴附而使膜周围的腹壁和盲肠完全分离。

<实施例6>制造多种形态的软骨衍生细胞外基质材料

可以将软骨衍生细胞外基质的组织本身冻结破碎而制造成粉末形态；或者通过与混合氯化钠混合并压缩后使用乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(ethyl(dimethylaminopropyl)carbodiimide；EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide；NHS)而实施交联并融化氯化钠的方法或者与水一起冻结后交联(EDC/NHS)并进行冻结干燥而使水蒸发的方法制造海绵。并且，可以通过使粉末本身融化后交联(EDC/NHS)或者体内插入而制造成水凝胶形态。