一种BBTV两个DNA2组分的鉴定方法和应用

摘要

本发明提供了一种BBTV两个DNA2组分的鉴定方法，包括：1)取感染BBTV的香蕉待测样品，提取总DNA，PCR扩增；2)将PCR产物连接至质粒载体，提取质粒并对质粒进行NdeI酶切；电泳检测，判定待测样品是否有2种DNA2组分；3)将步骤(2)中可被切成两条条带的质粒为模板进行PCR扩增，XhoII酶切；琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切条带，判定DNA2是否发生重组及重组率为多少。本发明提供的技术方案可鉴定香蕉束顶病毒(BBTV)分离物中是否含有两个DNA2组分、两个DNA2组分是否发生重组，以及发生重组后如何计算其重组率的方法，从而为对BBTV的进一步深入研究及病毒预防和控制奠定基础。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种BBTV两个DNA2组分的鉴定方法和应用。

背景技术

根据2014年国际病毒分类委员会公布的分类标准，矮缩病毒科(Nanoviridae)病毒是引起植物病害的三个DNA病毒科之一，其余两个分别为双生病毒科(Geminiviridae)和花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)。香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus，BBTV)是矮缩病毒科香蕉束顶病毒属(Babuvirus)的主要成员之一。作为该属的典型成员，香蕉束顶病毒可引起香蕉束顶病(Banana bunchy top disease，BBTD)，该病曾给我国香蕉产业带来巨大的经济损失，也是目前世界上香蕉产业发展的主要危害之一。电镜观察表明，香蕉束顶病毒的病毒颗粒为等轴多面体，大小为18～20nm，其基因组由6～8个大小约1000～1100bp的单链环状DNA所组成，分别命名为DNA1、DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6和卫星DNA。研究表明，DNA1编码复制起始相关蛋白(Rep)、DNA2编码功能未知小蛋白、DNA3编码外壳蛋白(CP)、DNA4编码运动蛋白(MP)、DNA5编码细胞周期调控蛋白(Clink)、DNA6编码核穿梭蛋白(NSP)和卫星DNA编码复制起始辅助相关蛋白(RepA)。

已有研究表明，DNA2组分为编码区和非编码区两部分，其中非编码区包括3个重要部分，即主要共同区(CR-M)、颈环共同区(CR-SL)和类似真核生物的启动子元件的TATA框。利用Race技术研究发现，DNA2可转录一个大小约240nt的mRNA，推测可编码一个32个氨基酸的未知功能蛋白。序列同源性分析表明，在6个组分中(DNA1～DNA6)，DNA1组分之间的同源性最高，而DNA2之间的同源性最低。利用PCR和测序的方法，对从海南、广西、福建等省采集的50个感染BBTV香蕉叶片的研究中发现，部分BBTV分离物存在两个DNA2组分，测序结果表明，两个DNA2组分之间序列差异较大，同源性仅在80％左右，且后代有重组DNA2产生。已有研究表明，不同BBTV分离物之间的DNA2发生重组，同一分离物不同组分之间也可发生重组，如DNA2与卫星DNA发生重组。虽然国内外报道了DNA2与DNA2之间、DNA2和BBTV其它组分均可发生重组，但是现有技术中尚无较好的鉴定这两个DNA2组分是否发生重组以及它们重组后产生的后代占多少比例的方法。

DNA重组(DNA recombination)指DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程，包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。DNA重组形式的广泛和普遍的存在对于维持生物多样性、增强生物体的环境适应性具有十分重要的意义。就BBTV的研究而言，两个DNA2组分的重组的发生显然对于维持BBTV的活性和适应性具有十分重要的意义。因而寻找一种便捷的能够同时鉴定两个DNA2组分、两个DNA2组分是否发生重组及简便计算其重组后两个DNA2组分各占多少比例的方法，对于BBTV DNA2组分的深入研究具有十分重要的应用价值。

本发明旨在提供一种鉴定香蕉束顶病毒(BBTV)分离物中是否含有两个DNA2组分、两个DNA2组分是否发生重组，以及发生重组后如何计算其重组率的方法，从而对BBTV的进一步深入研究及病毒预防和控制奠定基础。

发明内容

本发明提供了一种鉴定BBTV两个DNA2组分、两个DNA2组分是否发生重组，以及发生重组后如何计算其重组率的方法，该方法采用NdeI和XhoII限制性内切酶对BBTV分离物含有DNA2组分进行酶切，并根据酶切结果计算重组率，计算公式为：重组率＝DNA2-R克隆数/[DNA2-A克隆数+DNA2-B克隆数+DNA2-R克隆数]×100％。

第一方面，本发明提供了一种BBTV两个DNA2组分的鉴定方法，包括：

1)取感染BBTV的香蕉待测样品，提取总DNA，在环状DNA2的307～325bp和289～307bp分别设计上下游引物对，PCR扩增出DNA2；

2)将步骤(1)所扩增的PCR产物连接至质粒载体，提取质粒并对质粒进行NdeI酶切；琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切条带，判定待测样品是否有2种DNA2组分；

3)将步骤(2)中可被切成两条条带的质粒的稀释液(稀释1000倍)为模板，利用载体引物对M13-F和M13-R进行PCR扩增，并对扩增产物进行XhoII酶切；琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切条带，判定DNA2是否发生重组。

在本发明提供的技术方案中，将BBTV的两个DNA2组分分别命名为DNA2-A和DNA2-B，而重组产生的DNA2组分命名为DNA2-R。其中，DNA2-A包括NdeI限制性内切酶核苷酸序列识别位点：5′-CA↓TATG-3′，DNA2-B包括XhoII限制性内切酶核苷酸序列识别位点：5′-R↓GATCY-3′；其中，R＝A/G，Y＝C/T。

在本发明一些实施方式中，所述步骤(1)中，所述香蕉样本为香蕉植株任一可能感染BBTV的部位，常见地，如香蕉叶片。

在本发明一些实施方式中，所述步骤(1)中，所述在DNA2上下游设计引物对为在环状DNA2上游的307～325bp和289～307bp分别设计上游引物和下游引物，组成引物对。

在本发明一优选实施方式中，所述步骤(1)中，所述引物对的序列分别为SEQUENCENO.1和SEQUENCE NO.2所示。

在本发明一些实施方式中，所述步骤(2)中，所述质粒载体为pMD19-T载体。

在本发明一些实施方式中，所述步骤(2)中，所述判定待测样品是否有2个DNA2组分的具体步骤为：

若酶切条带只出现一条条带的单克隆质粒，则判定PCR产物仅具备1种DNA2组分；若酶切条带同时出现一条条带的单克隆质粒和两条条带的单克隆质粒，则判定PCR产物具备2种DNA2组分。

在本发明一些实施方式中，所述步骤(3)中，所述判定DNA2是否发生重组的具体步骤为：

若酶切条带出现两条条带的单克隆质粒，则判定DNA2发生重组。

在本发明一些实施方式中，可以同时对多组待测样品进行检测，则根据步骤(2)和(3)的结果，可以计算重组率，具体包括：

01)查看步骤(2)的酶切条带，计算酶切只获得一条条带的质粒数，计为DNA2-A克隆数；将获得两条条带的质粒数，计为非DNA2-A克隆数；

02)查看步骤(3)的酶切条带，计算酶切只获得一条条带的质粒数，计为DNA2-B克隆数；将获得两条条带的质粒数，计为DNA2-R克隆数；

03)计算重组率，所述重组率＝DNA2-R克隆数/[DNA2-A克隆数+DNA2-B克隆数+DNA2-R克隆数]×100％。如本发明所述的，“非DNA2-A克隆数”＝“DNA2-B克隆数”+“DNA2-R克隆数”。

第二方面，如第一方面所述的BBTV两个DNA2组分的鉴定方法在鉴定待测样品中是否含有两个DNA2组分，以及两个DNA2组分是否重组、及计算DNA2重组率中的应用。

在本发明一些实施方式中，所述的待测样品为香蕉束顶病毒分离物。

在前期研究基础上，发明人认为，两个DNA2组分在重组前，DNA2-A的组分(采用XhoII酶切)和DNA2-B的组分(采用NdeI酶切)在采用相应酶切时，具有较好稳定性，因而可作为典型性代表。而重组后代的DNA2-R组分序列一部分来自DNA2-A(含XhoII酶切位点)，另一部分来自DNA2-B(含NdeI酶切位点)，基于这一特点，发明人建立了一种利用XhoII和NdeI两次酶切的方法来鉴定香蕉束顶病毒分离物中是否含有两个DNA2组分，以及两个DNA2组分是否重组、及重组率的计算方法。总体而言，本发明通用性较好，制备技术较为成熟，鉴定成本较低，对于快速确定两个DNA2组分及其计算重组率具有较好的实用价值。

附图说明

图1为利用CTAB法提取的感染BBTV香蕉叶片总DNA电泳图；其中，M：2000bp DNAmarker，1：感染BBTV香蕉的总DNA，2：健康香蕉总DNA；

图2为PCR扩增DNA2组分的电泳图谱；其中，M：2000bp DNA marker，1：感染BBTV香蕉的总DNA的PCR扩增结果，2：健康香蕉总DNA的PCR扩增结果；

图3为利用Nde I内切酶对部分单克隆质粒pMD19T-DNA2-X的酶切图谱；图中显示，52个单克隆质粒被切成两条带；

图4为将图3鉴定的52个单克隆质粒进行菌夜PCR，PCR片段进一步用XhoII内切酶酶切的结果。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

样品来源：感染BBTV香蕉叶片和健康香蕉叶片均采自海南省海口市城西热科院；

实验试剂：

2×Taq Master Mix，近岸蛋白质科技(上海)有限公司；

AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，劢瑞生物科技(上海)有限公司；

pMD19-T载体，宝生物工程(大连)有限公司；

DH5a大肠杆菌感受态细胞，艾德莱生物科技(北京)有限公司；

质粒提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；

其它未说明试剂均以本领域常用制备方法制备而成或从市场常规购得，不再重复介绍。

实施例

本发明实施例对随机所采集的感染BBTV香蕉叶片样品中的香蕉束顶病毒两个DNA2组分进行了检测，具体检测步骤包括：

1、提取感染BBTV香蕉叶片样品中的总DNA，采用CTAB法提取，具体为：

(1)取0.2g感染BBTV香蕉叶片于液氮中研磨成粉末；

(2)加入1mL预热的2×CTAB缓冲液，混匀，65℃温育10min；

(3)加入500uL氯仿/异戊醇(体积比，24:1)，混匀后4℃离心10min；

(4)取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀后4℃离心10min；

(5)取上清，加入预冷的2倍体积无水乙醇，-20℃放置30min；

(6)4℃离心15min，弃上清，沉淀用50uL的1×TE溶解沉淀，-20℃保存备用。

同上述步骤，同时提取健康香蕉叶片样品中的总DNA作为对照。

对所提取的DNA样品进行电泳分析，结果如图1所示。从图中可以看出，图中显示一条较完整的总DNA条带，质量较好，大小与预计相符。

2、设计引物，以步骤1中所提取感染BBTV香蕉叶片样品的总DNA为模板，进行PCR扩增，

在环状DNA2的307～325bp和289～307bp处分别设计上下游引物对，具体地，引物序列设计如下：

正向引物DNA2-F，5'-GATGTTGTGCTGAGGAGG-3'，SEQUENCE NO.1；

反向引物DNA2-R，5'-GACTTTGACAGAAGAGCGAG-3'，SEQUENCE NO.2；

PCR扩增时，25μL反应体系设计如下：

SinoBio 2×Master Mix，12.5μL；

正向引物F，5μM、1μL；

反向引物R，5μM、1μL；

步骤(1)中所提取的DNA，1μL；

ddH₂O，9.5μL；

PCR反应程序为：98℃，3min；94℃、30s，50℃、30s，72℃、1min，共35个循环；最后72℃，10min；

反应结束后，取样进行1％琼脂糖凝胶电泳(120V，20min)检测，并将PCR产物置于4℃冰箱保存。

同上述步骤，以步骤1中所提取的健康香蕉叶片总DNA为模板，利用上述正向引物DNA2-F和反向引物DNA2-R进行PCR扩增，同样进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，以此作为对照。

相关结果如图2所示。从图2中可以看出，感染BBTV香蕉样品的总DNA的PCR结果获得一条与目的基因大小相符片段，而健康香蕉对照无此条带。

3、进行NdeI酶切，将步骤2所扩增的PCR产物连接至pMD19-T载体(自带NdeI酶切位点)，并扩增验证大小，提取质粒并对质粒进行NdeI酶切，具体为：

(1)按照Gel Extraction Kit(AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒)说明书，对步骤2中的PCR扩增产物进行纯化并回收；

(2)按照pMD19-T载体说明书，将步骤(1)中目的基因(即所回收的PCR扩增产物)与pMD19-T载体连接构建重组质粒pMD19T-DNA2-X；

(3)将步骤(2)的连接产物(即所构建的重组质粒)转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，在37℃条件下，于LB培养基(Amp^r)中过夜培养；

(4)按照质粒提取试剂盒说明书，对200个重组质粒pMD19T-DNA2-X进行提取；

(5)对所获得的重组质粒pMD19T-DNA2-X进行NdeI酶切，酶切时，10μL酶切体系设计如下：

NdeI，10U/uL，0.5μL；

10×H buffer，1μL；

所提取重组质粒pMD19T-DNA2-X，2μL；

ddH₂O，6.5μL；

37℃酶切1h；

酶切结束后，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(120V，20min)检测；

根据酶切条带，可判定BBTV城西分离物有2个DNA2组分；利用NdeI内切酶酶切200个单克隆质粒pMD19T-DNA2-X，结果显示106个单克隆质粒被切成两条带，说明DNA2-A组分与非DNA2-A组分的比例关系为94:106。图3为100个单克隆质粒NdeI酶切结果。

4、XhoII酶切，以步骤(3)中被NdeI酶切为两条带的106个重组质粒pMD19T-DNA2-X稀释1000倍为模板，进行PCR扩增，并对扩增产物进行XhoII酶切分析；

PCR扩增时，引物序列设计如下：

正向引物M13-F，5'-CCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'，SEQUENCE NO.3；

反向引物M13-R，5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'，SEQUENCE NO.4；

PCR扩增时，25μL反应体系设计如下：

SinoBio 2×Master Mix，12.5μL；

正向引物M13F，5μM、1μL；

反向引物M13R，5μM、1μL；

质粒稀释液，1μL；

ddH₂O，9.5μL；

PCR反应程序为：98℃，3min；94℃、30s，50℃、30s，72℃、1min，共35个循环；最后72℃，10min；

反应结束后，取样进行1％琼脂糖凝胶电泳(120V，20min)检测；

同时取PCR扩增产物进行XhoII酶切，酶切时，10μL酶切体系设计如下：

XhoII，10U/uL，0.5μL；

10×L buffer，1μL；

PCR产物，2μL；

ddH₂O，6.5μL；

37℃酶切1h；

酶切结束后，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(120V，20min)检测；

根据酶切条带，判定BBTV城西分离物2个DNA2组分发生重组；利用XhoII内切酶酶切106个非DNA2-A质粒稀释液PCR产物，结果显示35个PCR产物被切成两条带，说明DNA2-B组分与DNA2-R组分的比例关系为71:35。图4为52个非DNA2-A单克隆质粒XhoII酶切结果。

最后根据步骤(3)、(4)的结果，计算重组率，

重组率＝DNA2-R克隆数/[DNA2-A克隆数+DNA2-B克隆数+DNA2-R克隆数]×100％。如本发明所述的，“非DNA2-A克隆数”＝“DNA2-B克隆数”+“DNA2-R克隆数”。

BBTV城西分离物DNA2重组率＝DNA2-R克隆数/[DNA2-A克隆数+DNA2-B克隆数+DNA2-R克隆数]×100％＝35个/(94个+71个+35个)×100％＝17.5％

结果表明：

根据步骤(3)的结果，在鉴定的200个pMD19T-DNA2-X单克隆质粒中，有106个能被NdeI酶切为两条带，说明BBTV城西分离物中含有2个DNA2组分，其中DNA2-A克隆数为94个，非DNA2-A克隆数为106个；

根据步骤(4)的结果，106个非DNA2-A质粒稀释液进行PCR，PCR产物进一步用XhoII内切酶酶切后，结果显示106个PCR产物中有35个被切成两条带，说明BBTV城西分离物中的2个DNA2组分发生重组，其中DNA2-B克隆数为71个，DNA2-R克隆数为35个；

根据步骤(3)、(4)的结果，计算BBTV城西分离物DNA2重组率为17.5％。

综上可见，本发明方法利用NdeI和XhoII限制性内切酶两次酶切就能快速、准确的鉴定香蕉束顶病毒两个DNA2组分、产生重组及计算其重组率。

附注：

两个不同DNA2组分，即DNA2-A和DNA2-B，以及重组后的DNA2组分DNA2-R(DNA2-R1和DNA2-R2)相关序列示意：

>DNA2-A(阴影部分为XhoII限制性内切酶的酶切位点)-SEQUENCE NO.5所示

>DNA2-B(阴影部分为NdeI限制性内切酶的酶切位点)-SEQUENCE NO.6所示

重组的DNA2子代序列(说明：为Xho II酶切位点序列；为Nde I酶切位点序列，代表来自DNA2-A序列)：

>DNA2-R1-SEQUENCE NO.7所示

>DNA2-R2-SEQUENCE NO.8所示

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。