一种花生DNA条形码标准检测基因以及花生物种的分子鉴定方法

摘要

本发明提供了一种花生DNA条形码标准检测基因序列及检测引物组合，所述条形码标准检测基因序列为下述的基因序列SEQ ID NO.1基因。通过聚合酶链式反应扩增出该基因，根据被测样品扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出165bp的条带，即可判断所检测样品中含有花生成分。本发明提供了一种特异地检测花生成分的方法，有助于花生成分的鉴定，防止搀假使杂，保障消费者的健康。与传统的形态学鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于实现花生的分子鉴定，能有效缩短花生的鉴定时间。

说明书

技术领域

本发明涉物种鉴定领域，具体地说是一种花生物种特异性的基因序列，以及基于该基因序列的特异性引物组合，用于特异地检测花生成分。

背景技术

花生(学名：Arachis hypogaea，英文名称：peanut)，原名落花生，为属蔷薇目，豆科一年生草本植物。花生(Arachis hypogaea)是花生属(Arachis)唯一的栽培种。花生是食用蛋白和高质量的食用油的重要来源，也是中国最重要的油料作物之一。花生仁含油量高、营养丰富(含油45～55％；蛋白质27～30％；碳水化合物6～23％；纤维素2％)，油粕蛋白质含量达50％，还含有丰富的维生素E和B，是良好饲料。花生仁还可进一步制成花生奶粉、酸奶酪、糕点和膨化食品等。花生茎叶是良好饲料，含蛋白10～20％，木质化程度低，并含丰富钙和磷。花生果壳含纤维素70～80％，经发酵后可作饲料，还可制成板材、胶粘剂、酱油、活性炭及化工原料。红皮花生的种皮是一种中药，有良好止血作用。

另一方面，花生是最容易感染黄曲霉的农作物之一，黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，具有很强的毒性和致癌性，而且黄曲霉毒素耐热，在一般烹调加工的温度下破坏很少。因此应避免食用霉变后的花生。此外，花生还是重要的食物过敏原，可能会引起极其严重的过敏症。花生过敏的症状包括：血压降低、面部和喉咙肿胀，这些都会阻碍呼吸，从而导致休克。因此，含有花生成分的食品应明确标识。

对于多组分的农产品，经过加工后，从外观通常难以辨别。市场上很多不法商贩为了获取高额利润，经常以低价值的产品混入或冒充高价值的产品，比如将大豆油掺入花生油中，将大豆粉掺入花生酱中。另一方面将花生酱掺入芝麻酱，而花生酱极易感染黄曲霉，从而对消费者的健康带来危害。因此建立一种可以特异地检测花生成分的方法，有助于花生成分的鉴定，防止搀假使杂，保护消费者利益和健康。

发明内容

本发明提供了一种花生DNA条形码标准检测基因及其检测方法，以该基因序列为检测靶标，筛选出可以特异地鉴定花生的引物组合，用于特异地检测花生成分。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种花生DNA条形码标准检测基因在检测花生物种中的用途，所述的花生DNA条形码标准检测基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

一种花生DNA条形码标准检测基因所使用的PCR引物对F1/R1，所述的PCR引物对F1/R1用于扩增权利要求1中的花生DNA条形码标准检测基因，引物F1的核苷酸序列如SEQID NO.2所示：gcgtggatga ggagatagcc；

引物R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：gtcttggtgg ttggcgttgt。

一种花生物种的分子鉴定方法，包括以下步骤：1)、从待测样品中提取目标DNA；

2)、以目标DNA为模板用权利要求2中所述的引物F1和R1进行PCR扩增；以无菌水为PCR空白对照，以花生基因组DNA为PCR阳性对照；

3)、将步骤2)中PCR扩增出的基因片段用琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后置于凝胶成像系统中观察，满足以下条件则说明PCR扩增结果可靠：空白对照扩增无任何带型，阳性对照有位于165bp的清晰、单一条带；

4)、判断目标DNA的扩增产物中是否特异性扩增出165bp的条带，若能扩增出，则说明目标DNA中含有花生DNA条形码标准检测基因，即可判断所检测样品中含有花生成分。

不同物种由于独立进化的结果，它们在遗传、生理和品质等方面各具特色。利用不同物种特有的DNA序列可以开发成能够识别和定量不同物种及其加工产品的标记。本发明是这样实现的：在GenBank中检索花生的基因序列，分析基因信息，优先选择具有完整序列和信息的基因组序列和cDNA序列。然后将选择的序列进行Blastn分析，选择特异性强、相似序列少的花生基因序列。以特异性强的基因序列为检测靶标，设计引物，进行PCR扩增分析。最终筛选出来的引物组合具有以下特征：1、扩增条带清晰、单一；2、在所有的花生品种中均有相同的扩增条带；3、在其他花生近缘种、常见的作物中均没有扩增。

本发明提供了一种特异地检测花生成分的方法，有助于花生成分的鉴定，防止搀假使杂。与传统的形态学鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于实现花生的分子鉴定，能有效缩短花生的鉴定时间。

附图说明

图1是实施例中分别对16种不同花生品种的基因组DNA扩增结果图；

图2为实施例中分别对花生和16种非花生品种的基因组DNA扩增结果图；

图3为实施例中花生扩增的灵敏度检测图；

图4为实施例中检测不同样品的PCR扩增结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。

本实施例中所提供的花生DNA条形码标准检测基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

该基因能够用于花生物种的分子鉴定中。

本实施例中同时提供了用于PCR扩增上述花生DNA条形码标准检测基因的引物对F1/R1，引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：gcgtggatga ggagatagcc；引物R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：gtcttggtgg ttggcgttgt。

本实施例提供的花生物种的分子鉴定方法具体包括以下步骤：1)、从待测样品中提取目标DNA；

2)、以目标DNA为模板用权利要求2中所述的引物F1和R1进行PCR扩增；以无菌水为PCR空白对照，以花生基因组DNA为PCR阳性对照；

3)、将步骤2)中PCR扩增出的基因片段用琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后置于凝胶成像系统中观察，满足以下条件则说明PCR扩增结果可靠：空白对照扩增无任何带型，阳性对照有位于165bp的清晰、单一条带；

4)、判断目标DNA的扩增产物中是否特异性扩增出165bp的条带，若能扩增出，则说明目标DNA中含有花生DNA条形码标准检测基因，即可判断所检测样品中含有花生成分。

以下为本发明的具体检测实施例。

实施例1

1.实验材料

1.1植物材料

进行试验的16个不同花生品种(7596，7519，7602，7607，7613，21016，21399，21513，21134，21088，21282，21127，21020，21387，21065，中花5号)；

以及其他16种不同种属的材料分别有：油菜，大豆，芝麻，向日葵，油棕，棉花，水稻，玉米，豇豆，豌豆，马铃薯，萝卜，辣椒，茄子，拟南芥，烟草。

1.2酶与试剂

分子生物学试剂，TAKARA Taq DNA聚合酶，10×PCR缓冲液，dNTP Mixture(10mM)，MgCl₂购自大连宝生物公司。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3实验仪器

PCR扩增仪：DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler(Bio-Rad,USA)；

核酸电泳仪：DYYIII型YY0115-94(北京六一仪器厂)；

凝胶成像系统：Gel Doc XR System(Bio-Rad,USA)；

其它仪器包括：恒温水浴锅、电子天平、离心机、涡旋仪、纯水仪、恒温培养箱等。

2.实验方法

2.1植物基因组DNA的提取

植物基因组DNA采用QIANGEN公司的DNA小量提取试剂盒DNeasy Plant Mini Kit(货号69104)，具体操作如下：

2.1.1、粉碎样品，取样100mg。

2.1.2、加入400uL bufferAP1和4uLRNaseA。涡旋混匀。65℃水浴10分钟。期间混匀2-3次。

2.1.3、加入130uL buffer AP2。混匀。冰上放置5分钟。14000rpm离心5min。

2.1.4、将裂解液转入QIAshredder Mini spin coLumn，用自带的2mL离心管作为收集管。14000rpm离心2min。

2.1.5、将收集液转入一个新的自备的离心管，加1.5倍体积的BufferAP3/E。吹打混匀。

2.1.6、取650uL混合液到DNeasy Mini spin column(柱子最多承受650uL的体积，因此混合液需离心两次)，用自带的2mL离心管作为收集管。8000rpm离心1min，对剩余的样品同样操作。

2.1.7、将柱子置于新的2mL离心管，用500uL buffer AW洗脱，8000rpm离心1min，弃洗脱液。

2.1.8、再用500uL buffer AW洗脱，1400rpm离心2min，弃洗脱液。

2.1.9、将柱子置于新的1.5或2mL离心管中，加入100uL洗脱液Buffer AE。室温放置5min。14000rpm离心1min。重复步骤9。

2.2PCR扩增

以上述植物材料的基因组DNA为模板，以能特异性鉴定花生的引物组合F1/R1为引物，进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

PCR反应体系为：20ng/μL DNA模板1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25mM MgCl₂2.0μL，10mM>2O补足至25μL。

3.实验结果

PCR扩增均以无菌水为空白对照，以花生基因组DNA为阳性对照，只有当空白对照扩增无任何带型，阳性对照有与理论相符的清晰、单一条带(条带大小为165bp)则说明PCR结果可靠。

如图1所示，利用本发明的引物组合对16个花生品种基因组DNA进行PCR扩增(泳道M是NEB#M3233V DNA ladder，泳道1为水的空白对照，2-17分别为花生7596，7519，7602，7607，7613，21016，21399，21513，21134，21088，21282，21127，21020，21387，21065，中花5号)，均扩增出清晰、单一条的165bp条带。表明本发明公布的基因片段及检测方法在花生品种中具有较好的物种内稳定性。如图2所示，选取16个花生近缘种和常见作物，利用本发明的引物组合对这16种基因组DNA进行PCR扩增(泳道M是NEB#M3233V DNA ladder，泳道1为阳性对照，泳道2-17分别为油菜，大豆，芝麻，向日葵，油棕，棉花，水稻，玉米，豇豆，豌豆，马铃薯，萝卜，辣椒，茄子，拟南芥，烟草)，结果只有以花生基因组DNA为阳性对照的泳道有清晰、单一条带。其他泳道均无任何带型，表明本发明公布的基因片段及检测方法在花生品种中具有较好的物种间特异性。如图3所示，将花生基因组DNA用水梯度稀释至100ng/uL，10ng/uL，1ng/uL，0.1ng/uL，0.05ng/uL和0.01ng/uL，利用本发明的引物组合进行PCR扩增，结果当DNA浓度低至0.05ng/uL时仍有清晰可见的条带(泳道M是NEB#M3233V DNA ladder，泳道1-6分别为100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.05ng，和0.01ng花生基因组DNA，泳道7为空白对照)，表明本发明公布检测方法可检测基因组DNA含量低至0.05ng/uL的样品，灵敏度较高。

实施例2

1.实验材料

1.1植物材料

花生酱(四季宝牌)，混合芝麻酱(六必居牌)，芝麻酱(市售)，花生糖(大白兔牌)，炒芝麻(市售)。

1.2酶与试剂

分子生物学试剂，TAKARA Taq DNA聚合酶，10×PCR缓冲液，dNTP Mixture(10mM)，MgCl₂购自大连宝生物公司。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3实验仪器

PCR扩增仪：DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler(Bio-Rad,USA)；

核酸电泳仪：DYYIII型YY0115-94(北京六一仪器厂)；

凝胶成像系统：Gel Doc XR System(Bio-Rad,USA)；

其它仪器包括：恒温水浴锅、电子天平、离心机、涡旋仪、纯水仪、恒温培养箱等。

2.实验方法

2.1植物基因组DNA的提取

植物基因组DNA采用QIANGEN公司的DNA小量提取试剂盒DNeasy Plant Mini Kit(货号69104)，具体操作如下：

2.1.1、粉碎样品，取样100mg。

2.1.2、加入400uL bufferAP1和4uLRNaseA。涡旋混匀。65℃水浴10分钟。期间混匀2-3次。

2.1.3、加入130uL buffer AP2。混匀。冰上放置5分钟。14000rpm离心5min

2.1.4、将裂解液转入QIAshredder Mini spin coLumn，用自带的2mL离心管作为收集管。14000rpm离心2min

2.1.5、将收集液转入一个新的自备的离心管，加1.5倍体积的BufferAP3/E。吹打混匀。

2.1.6、取650uL混合液到DNeasy Mini spin column(柱子最多承受650uL的体积，因此混合液需离心两次)，用自带的2mL离心管作为收集管。8000rpm离心1min，对剩余的样品同样操作。

2.1.7、将柱子置于新的2mL离心管，用500uL buffer AW洗脱，8000rpm离心1min，弃洗脱液。

2.1.8、再用500uL buffer AW洗脱，1400rpm离心2min，弃洗脱液。

2.1.9、将柱子置于新的1.5或2mL离心管中，加入100uL洗脱液Buffer AE。室温放置5min。14000rpm离心1min。重复步骤9。

2.2PCR扩增

以1.1中植物材料的基因组DNA为模板，以能特异性鉴定花生的引物组合F1/R1为引物，进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

PCR反应体系为：20ng/μL DNA模板1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25mM MgCl₂2.0μL，10mM>2O补足至25μL。

3.实验结果

PCR扩增均以无菌水为空白对照，以花生基因组DNA为阳性对照，只有当空白对照扩增无任何带型，阳性对照有与理论相符的清晰、单一条带(条带大小为165bp)则说明PCR结果可靠。

实验结果如图4所示，泳道M是NEB#M3233V DNA ladder，泳道1为空白对照，泳道2为阳性对照，泳道3-7分别为花生酱(四季宝牌)、混合芝麻酱(六必居牌)、芝麻酱(市售)、花生糖(大白兔牌)、炒芝麻(市售)。含有花生成分的样品包括：花生酱(四季宝牌)、混合芝麻酱(六必居牌)、芝麻酱(市售)、花生糖(大白兔牌)均检测到与阳性对照相同的条带，不含有花生成分的样品均无扩增。实验结果表明，本发明的基于花生特异性序列的引物组合能够准确鉴定出样品中的花生成分。

以上所述仅为本发明的具体实施方案的详细描述，并不以此限制本发明，凡在本发明的设计思路上所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。