一株高效降解吡啶甲酸的丛毛单胞菌及其应用

摘要

本发明提供了一株高效降解吡啶甲酸的丛毛单胞菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明分离筛选出一株吡啶甲酸降解菌，丛毛单胞菌，其分类命名为Comamonas sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.10700。本发明的优点是该丛毛单胞菌能够在较宽范围的pH值，特别是碱度较高的情况下有效降解吡啶甲酸；该丛毛单胞菌能够作为生物强化制剂应用于弱碱至弱酸环境中吡啶甲酸废水的好氧生物治理，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株高效降解吡啶甲酸的丛毛单胞菌及其应用。

背景技术

吡啶甲酸及其衍生物广泛用于医药、农药以及日用化学品的生产中，吡啶甲酸的广泛应用导致其污染环境。吡啶甲酸废水可通过好氧生物法进行处理。目前，好氧降解吡啶甲酸的微生物资源主要有节杆菌、分枝杆菌和链霉菌等。关于其它属种的菌株报道尚不多见。此外，文献所报道的吡啶甲酸降解菌都在比较温和的pH范围内生长，基本在6.0到7.0的范围内，而实际吡啶甲酸工业废水pH变化范围较宽，因此文献所报道的吡啶甲酸降解菌实际应用受到限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一株高效降解吡啶甲酸的丛毛单胞菌及其应用，能够在较宽pH值范围内高效去除吡啶甲酸。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一株高效降解吡啶甲酸的丛毛单胞菌，其分类命名为Comamonas sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.10700。

所述的高效降解吡啶甲酸的丛毛单胞菌在降解吡啶甲酸方面的应用。

所述的高效降解吡啶甲酸的丛毛单胞菌在制备生物菌制剂或生物强化制剂方面的应用。

所述的高效降解吡啶甲酸的丛毛单胞菌作为生物菌制剂或生物强化制剂在吡啶甲酸废水处理中的应用。

在吡啶甲酸为唯一碳源、氮源及能源、pH为7、温度为30℃的条件下，丛毛单胞菌能够对吡啶甲酸浓度≤800mg/L的废水进行降解。

在吡啶甲酸为唯一碳源、氮源及能源、温度为30℃、pH为5～9的条件下，丛毛单胞菌能够对吡啶甲酸浓度≤200mg/L的废水进行降解。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明针对以往文献报道的吡啶甲酸降解菌存在的问题，通过科学方法驯化、筛选出一株新的吡啶甲酸降解菌—丛毛单胞菌，其分类命名为Comamonas sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.10700。该丛毛单胞菌可在较宽pH值范围内高效去除吡啶甲酸，从而适用于实际吡啶甲酸工业废水中降解处理吡啶甲酸。本发明提供的丛毛单胞菌可作为生物菌制剂投加到现有的吡啶甲酸废水处理系统中，增强原处理系统的处理能力；本发明提供的丛毛单胞菌能够作为生物强化制剂应用于弱碱至弱酸环境中吡啶甲酸废水的好氧生物治理，在吡啶甲酸废水的处理中有着广阔的应用潜力。

进一步的，通过实验发现，本发明提供的丛毛单胞菌在pH＝7、温度30℃、吡啶甲酸初始浓度≤800mg/L的条件下，能够完全降解吡啶甲酸；另外，在pH为5～9，吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源，温度30℃，且吡啶甲酸初始浓度≤200mg/L的条件下，该丛毛单胞菌能够完全降解吡啶甲酸。

保藏说明

本发明所述的高效降解吡啶甲酸的丛毛单胞菌进行了下述保藏：

保藏时间：2015年4月9日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC；保藏号为CGMCC NO.10700。

附图说明

图1是本发明提供的丛毛单胞菌在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源且吡啶甲酸初始浓度为100mg/L的琼脂固体培养基中的菌落形态特征：30℃下培养3天后，菌落为米白色、边缘不整齐、表面粗糙不光滑、表面没有隆起而是紧密结合在培养基表面上，并且在接种时难以挑起。

图2是本发明提供的丛毛单胞菌在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源(初始浓度100mg/L)的液体培养基、30℃下培养10h后的扫描电镜图，细胞为短杆状，长度尺寸为1～2μm。

图3是本发明提供的丛毛单胞菌在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源，pH为7、温度30℃、吡啶甲酸质量浓度为800mg/L的液体培养基中生长与吡啶甲酸降解曲线图。

图4是本发明提供的丛毛单胞菌在不同pH值下、温度30℃、吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源且吡啶甲酸初始浓度为200mg/L时，吡啶甲酸的降解曲线图。

具体实施方式

下面结合技术方案和附图对本发明进行进一步详细说明。

1、本发明提供的丛毛单胞菌，其筛选步骤如下：

从西安某医药厂的曝气池中采集好氧活性污泥样品，作为菌源进行驯化、培养。将50mL活性污泥，加入0.2％的焦磷酸钠作为解絮凝剂，在振荡器上振荡5～10min打碎活性污泥絮体后，取5mL活性污泥，加入含95mL无机盐培养基的摇瓶中，再加入吡啶甲酸作为唯一碳、氮、能源，其中吡啶甲酸的浓度为100mg/L，进行摇床培养，温度30℃、转速180r/min。无机盐培养基成分：Na₂HPO₄·12H₂O，7g/L；KH₂PO₄，1g/L；CaCl₂·2H₂O，10mg/L；FeCl₃，2mg/L；MgSO₄·7H₂O，20mg/L。当菌液变得混浊，吡啶甲酸检测不到，进行下一次转接；经过不断地驯化培养，最终得到以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的稳定菌液。将稳定菌液稀释，在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的固体培养基上进行涂布。固体培养基成分：Na₂HPO₄·12H₂O，7g/L；KH₂PO₄，1g/L；CaCl₂·2H₂O，10mg/L；FeCl₃，2mg/L；MgSO₄·7H₂O，20mg/L；吡啶甲酸，100mg/L；琼脂2％。将该固体培养基放入光照培养箱中，30℃、培养4～5天，挑单菌落；分离筛选出一株以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的丛毛单胞菌；该菌株通过16S>

该丛毛单胞菌的生长pH范围较宽，在5.0～9.0的pH范围内均有较好的生长，最适pH值为7.0；其形态特征：在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的液体培养基，30℃下培养10h后，如图2所示，细胞为短杆状，长度尺寸为1～2μm；在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的琼脂固体培养基上，30℃下培养3天后，如图1所示，菌落为米白色、边缘不整齐、表面粗糙不光滑、表面没有隆起而是紧密结合在培养基表面上，并且在接种时难以挑起。该丛毛单胞菌既可在富营养培养基LB中生长，也可在葡萄糖、蔗糖、淀粉等小分子有机物为唯一碳源的无机盐培养基中生长。

本发明提供的丛毛单胞菌的16S rDNA扩增：通过扩增该菌株的16S rDNA，得到了长度为1428bp的16S rDNA序列。PCR引物采用16S rDNA的通用引物27F(5’-AGT TTG ATCMTG GCT CAG-3’)和1492R(5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)。用PCR仪(AppliedBiosystems，2720thermal cycler)进行扩增反应。表1和2分别显示了PCR反应体系以及反应条件。

表1PCR反应体系

表2反应条件

取PCR产物1μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，用DNA回收试剂盒(SK8131胶回收试剂盒)回收目的片段，将PCR产物克隆到pGEM-T载体上，转化大肠杆菌感受态细胞。在Genbank中进行BLAST比对。用MEGA 5.1软件构建系统发育树，采用Neighbo-Joining法分析菌株亲缘关系(Bootstrap value＝1000)。在Genbank中登录的序列号为KP900021，与Comamonassp.JC13同源性达99％，推断该菌株属于丛毛单胞菌属(Comamonas)。

2、制备丛毛单胞菌的细胞液体培养物：

挑取在吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的固体培养基上的丛毛单胞菌单菌落，装入灭菌的以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的液体培养基中，其中吡啶甲酸的浓度为100mg/L，于30℃、pH＝7.0、180r/min，进行好氧培养12～30小时，取培养好的菌液1mL接种在100mL含吡啶甲酸(200mg/L)的无机盐培养基中，30℃、pH＝7.0、180r/min、进行好氧培养20小时，得到丛毛单胞菌的细胞液体培养物。

3、关于丛毛单胞菌对吡啶甲酸好氧降解的研究，其步骤如下：

[1]在250mL锥形瓶中加入90mL无机盐培养基，再加入800mg/L的吡啶甲酸作为唯一碳、氮、能源，121℃下灭菌；

[2]将制备好的10mL丛毛单胞菌的细胞液体培养物加入上述90mL培养基中，30℃、pH＝7、180r/min，好氧培养，结果如图3所示。

图3是本发明提供的丛毛单胞菌在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源，pH为7、温度30℃、吡啶甲酸质量浓度为800mg/L的液体培养基中生长与吡啶甲酸降解曲线图，表明了丛毛单胞菌的生长与吡啶甲酸降解情况，图3中横坐标h表示时间，单位为小时，左侧纵坐标表示吡啶甲酸的浓度，单位为mg/L，右侧纵坐标表示菌体干重，单位为mg/L；—■—代表吡啶甲酸浓度，—□—代表菌体生长量。从图3中可以看出，丛毛单胞菌在pH为7、温度30℃、吡啶甲酸质量浓度≤800mg/L的条件下能够完全降解吡啶甲酸，因此能够作为生物强化制剂对吡啶甲酸浓度≤800mg/L的吡啶甲酸废水进行处理。

4、关于丛毛单胞菌在不同pH值下对吡啶甲酸好氧降解的研究，其步骤如下：

[1]分别配制pH值为3、4、5、6、7、9、10、12的无机盐培养基，加入200mg/L的吡啶甲酸作为唯一碳、氮、能源，121℃下灭菌；

[2]将制备好的10mL丛毛单胞菌的细胞液体培养物分别加入上述不同pH值的90mL培养基中，30℃、180r/min，好氧培养，结果如图4所示。

图4是本发明提供的丛毛单胞菌在不同pH值下，温度30℃，吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源且吡啶甲酸初始浓度为200mg/L时，吡啶甲酸的降解曲线图，表明了丛毛单胞菌在不同pH值下的生长与吡啶甲酸降解情况，图4中横坐标h表示时间，单位为小时，纵坐标表示吡啶甲酸的降解率，单位为％。从图4中可以看出：丛毛单胞菌在pH值为5～9，温度30℃，吡啶甲酸浓度≤200mg/L的条件下能够完全降解吡啶甲酸，因此能够作为生物强化制剂对较宽范围的pH值，特别是碱度较高的吡啶甲酸废水进行降解处理。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。