一种通过固体发酵镰孢菌Fusarium sp.产生新抗菌剂sambacide的方法

摘要

本发明公开一种通过固态发酵镰孢菌Fusarium sp.B10.1(CGMCC No.11819)产生新抗菌剂sambacide的方法。即：土豆培养基经Fusarium sp.B10.1(CGMCC No.11819)发酵，经过合适的溶剂超声提取，过滤，浓缩后，经硅胶和凝胶柱层析分离得到一个新的化合物sambacide。结合TLC薄层层析法以及高效液相色谱法，可检测到大量的sambacide的产生。Sambacide对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有显著的抗菌作用，是一个新的抗菌剂。该方法提供了一个新的抗菌化合物的生产方法。该方法是一种高效的，具有创新性的，反应条件温和的，绿色无污染的，易扩大化生产的，操作设备简单的大量产生抗菌化合物sambacide的方法，不仅满足了现代环境保护和低碳经济的需求，而且为后期工业化量产的进一步研究和开发奠定了坚实的基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过固态发酵镰孢菌Fusarium sp.B10.1(CGMCC No.11819)产生新抗菌剂sambacide的方法；具体来说是发现了一个新抗菌剂sambacide。属微生物代谢产物分离分析领域，

本发明使用的微生物：镰孢菌Fusarium sp.B10.1(保藏号：CGMCC No.11819)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏时间：2016年1月15日。

背景技术：

镰刀菌属(Fusarium)又称镰孢霉属，在分类学上，镰刀菌属无性时期原属于半知菌亚门，瘤座菌目。有性时期为子囊菌亚门，有性态常为赤霉属(Gibberella)。

镰刀菌属的各个种广泛地分布在土壤和有机体内，并且曾从北极的永久冻土中和撒哈拉大沙漠的砂土中分离到。它们在温带和热带地区的耕作土壤中生长良好，是经常被植物病理学家分离到的真菌之一。镰刀菌也可以造成人类和动物的疾病，大量的贮存物的腐烂，常常产生有毒物质，污染人们的食物和牲畜的饲料。正如其他许多土壤真菌一样，它们适应于在土壤中存活，其机能之一是能够在形态学和生理学上对于新的环境具有很快的变化和适应的能力。它们能够生活在广阔范围的深层底土之中，也可以从许多贮存的食物和化学物品中分离出来，甚至在飞机的油箱内，也曾同树脂芽枝霉一道被分离出来。

镰刀菌属广泛分布与自然界中，镰刀菌能产生植物刺激素(赤霉素)，可使农作物增产；有些种可产生纤维酶、脂肪酶、果胶酶等；还有些种可产生毒素，污染粮食、蔬菜和饲料，人畜误食会中毒；镰刀菌也能侵染多种经济作物，引起水稻、小麦、玉米、蚕豆、蔬菜等的赤霉病，棉花的枯萎病，香蕉枯萎病等。

Integracides是一类4,4-二甲基麦角甾烷化合物，是能够非常有效的选择HIV-1整合酶的抑制剂，具有各类生物活性包括抗菌抗真菌活性，和细胞毒活性。HIV-1整合酶抑制剂的构效关系研究表明，integracides的相关天然产物3-硫酸酯类比初始化合物有更强的活。

三萜类化合物(例如：integracides)已报道从Vesonder和Burmeister的Fusarium活性代谢产物分离Fusarium，寻找潜在的植物毒性的次级代谢产物。因此，从Fusarium spp.寻找integracides的相关化合物具有显著的意义。

发明内容

本发明目的旨在通过镰孢菌Fusarium sp.B10.1固体发酵产生新抗菌剂sambacide的方法。本发明提供一种转化率高，设备要求低，简便易操作，绿色无污染，适合产业化产生sambacide的方法。

本发明的目的是通过以下具体技术方案实现的：一种通过镰孢菌Fusarium sp.B10.1发酵产生新抗菌剂sambacide，其特征在于通过镰孢菌Fusarium sp.B10.1固体发酵产生一个新化合物为sambacide，其化学结构为：

本发明通过镰孢菌Fusarium sp.B10.1发酵产生新抗菌剂sambacide的方法，其特征在于按如下步骤进行固体发酵：

(1)将拟用微生物镰孢菌Fusarium sp.B10.1首先进行活化，即将Fusarium sp.B10.1接种到经过121℃高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3-7d后，置于4℃冰箱中；

(2)将活化的菌种接到PDB种子培养基中，于恒温摇床中培养3-7d；

(3)取洗净的土豆切成丁后，取适量的土豆丁置于组织培养瓶中；将装有土豆的组织培养瓶加盖包装后置于121℃高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将组织培养瓶冷却；

(4)将步骤(2)的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤(3)前处理的土豆上，加盖后置于培养箱中培养5-40d后取出；

(5)经微生物镰孢菌Fusarium sp.B10.1发酵后的土豆培养基经过甲醇超声提取、过滤和浓缩得到粗提物；分离粗提物得到的sambacide的结构式如下：

(6)经TLC薄层层析法检测，然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿和甲醇混合物，其中氯仿：甲醇按20:1—5:1混合，然后经分离得到的化合物上凝胶柱纯化，通过1D/2D NMR以及HRESIMS鉴定得到新化合物结构；

(7)采用如下HPLC色谱条件测定sambacide的产量。

所述发酵方法为固态发酵。

所述发酵时间为5-40d。

所述发酵温度为20-30℃。

所述提取溶剂为甲醇。

按如下HPLC条件进行含量测定：

(1)色谱柱：ODS高效液相色谱柱；

(2)梯度洗脱程序：0–10min,30–60％乙腈；10–20min,60％乙腈；20–25,60–30％乙腈；

(3)检测波长：247nm；

(4)流速：1.5mL/min；

(5)柱温：25℃。

本发明土豆培养基经镰刀霉菌Fusarium sp.B10.1发酵，经过合适的溶剂超声提取，过滤，浓缩后，经硅胶和凝胶柱层析分离得到一个新的化合物sambacide。结合TLC薄层层析法以及高效液相色谱法，可检测到大量的sambacide的产生。Sambacide对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有显著的抗菌作用，是一个新抗菌剂。

本发明方法是一种高效的，具有创新性的，反应条件温和的，绿色无污染的，易扩大化生产的，操作设备简单的大量产生抗菌化合物sambacide的方法，不仅满足了现代环境保护和低碳经济的需求，而且为后期工业化量产的进一步研究和开发奠定了坚实的基础。

附图说明

图1为本发明中新化合物sambacide的¹H-NMR；

图2为本发明中新化合物sambacide的¹³C-NMR；

图3为本发明中新化合物sambacide的HPLC色谱图；

图4为本发明中Fusarium sp.B10.1甲醇浸膏的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明，但本发明不局限于该具体实施例，本领域技术人员应该认识到，本发明涵盖了权利要求范围内的所有可能的备选方案、改进方案和等效方案。

本发明具体技术方案是：

(1)将拟用微生物Fusarium sp.B10.1首先进行活化，即将Fusarium sp.B10.1接种到经过121℃高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3-7d后，置于4℃冰箱中；

(2)将活化的菌种接到PDB种子培养基中，于恒温摇床中培养3-7d；

(3)取洗净的土豆切成丁后，取适量的土豆丁置于组织培养瓶中；将装有土豆的组织培养瓶加盖包装后置于121℃高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将组织培养瓶冷却；

(4)将步骤(2)的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤(3)前处理的土豆上，加盖后置于培养箱中培养5-40d后取出。

(5)经微生物Fusarium sp.B10.1发酵后的土豆培养基经过甲醇超声提取、过滤和浓缩得到粗提物；分别分离粗提物得到的sambacide的结构式如下：

(6)经TLC薄层层析法检测，然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇(20:1—5:1)，然后经分离得到的化合物上凝胶柱纯化，通过1D/2D NMR以及HRESIMS鉴定得到新化合物结构。

(7)采用二倍梯度稀释法对化合物sambacide进行抗菌活性测试。结果显示：sambacide金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有显著的抑菌作用(MIC≤16μg/mL)。

(8)采用如下HPLC色谱条件测定sambacide的产量。

a、色谱柱：ODS高效液相色谱柱；

b、梯度洗脱程序：0–10min,30–60％乙腈；10–20min,60％乙腈；20–25,60–30％乙腈；

c、检测波长：247nm；

d、流速：1.5mL/min；

e、柱温：25℃。

实施例1

(1)将拟用微生物镰刀霉菌Fusarium sp.B10.1首先进行活化，即将Fusarium sp.B10.1接种到经过121℃高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3d后，置于4℃冰箱中；

(2)将活化的菌种接到PDB种子培养基中，于恒温摇床中培养3d；

(3)取洗净的土豆切成丁后，取适量的土豆丁置于组织培养瓶中；将装有土豆的组织培养瓶加盖包装后置于121℃高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将组织培养瓶冷却；

(4)将步骤(2)的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤(3)前处理的土豆上，加盖后置于培养箱中培养30d后取出；

(5)经微生物镰孢菌Fusarium sp.B10.1发酵后的土豆培养基经过甲醇超声提取、过滤和浓缩得到粗提物；分别分离粗提物得到的sambacide的结构式如下：

(6)经TLC薄层层析法检测，然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇(20:1—5:1)，然后经分离得到的化合物上凝胶柱纯化，通过1D/2D NMR以及HRESIMS鉴定得到化合物结构；

(7)采用如下HPLC色谱条件测定sambacide的产量为17.27±0.52g/Kg

a、色谱柱：ODS高效液相色谱柱；

b、梯度洗脱程序：0–10min,30–60％乙腈；10–20min,60％乙腈；20–25,60–30％乙腈；

c、检测波长：247nm；

d、流速：1.5mL/min；

e、柱温：25℃。

实施例2

(1)将拟用微生物镰刀霉菌Fusarium sp.B10.1首先进行活化，即将Fusarium sp.B10.1接种到经过121℃高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3d后，置于4℃冰箱中；

(2)将活化的菌种接到PDB种子培养基中，于恒温摇床中培养3d；

(3)取洗净的土豆切成丁后，取适量的土豆丁置于组织培养瓶中；将装有土豆的组织培养瓶加盖包装后置于121℃高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将组织培养瓶冷却；

(4)将步骤(2)的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤(3)前处理的土豆上，加盖后置于培养箱中培养20d后取出。

(5)经微生物镰刀霉菌Fusarium sp.B10.1发酵后的土豆培养基经过甲醇超声提取、过滤和浓缩得到粗提物；分别分离粗提物得到的sambacide的结构式如下：

(6)经TLC薄层层析法检测，然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇(20:1—5:1)，然后经分离得到的化合物上凝胶柱纯化，通过1D/2D NMR以及HRESIMS鉴定得到化合物结构。

(7)采用如下HPLC色谱条件测定sambacide的产量为19.045±0.819g/Kg

a、色谱柱：ODS高效液相色谱柱；

b、梯度洗脱程序：0–10min,30–60％乙腈；10–20min,60％乙腈；20–25,60–30％乙腈.；

c、检测波长：247nm；

d、流速：1.5mL/min；

e、柱温：25℃。

实施例3

(1)将拟用微生物镰刀霉菌Fusarium sp.B10.1首先进行活化，即将Fusarium sp.B10.1接种到经过121℃高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3d后，置于4℃冰箱中；

(2)将活化的菌种接到PDB种子培养基中，于恒温摇床中培养3d；

(3)取洗净的土豆切成丁后，取适量的土豆丁置于组织培养瓶中；将装有土豆的组织培养瓶加盖包装后置于121℃高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将组织培养瓶冷却；

(4)将步骤(2)的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤(3)前处理的土豆上，加盖后置于培养箱中培养40d后取出。

(5)经微生物镰刀霉菌Fusarium sp.B10.1发酵后的土豆培养基经过甲醇超声提取、过滤和浓缩得到粗提物；分别分离粗提物得到的sambacide的结构式如下：

(6)经TLC薄层层析法检测，然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇(20:1—5:1)，然后经分离得到的化合物上凝胶柱纯化，通过1D/2D NMR以及HRESIMS鉴定得到化合物结构。

(7)采用如下HPLC色谱条件测定sambacide的产量为13.265±13.265g/Kg

a、色谱柱：ODS高效液相色谱柱；

b、梯度洗脱程序：0–10min,30–60％乙腈；10–20min,60％乙腈；20–25,60–30％乙腈；

c、检测波长：247nm；

d、流速：1.5mL/min；

e、柱温：25℃。