一种分离番石榴叶中萹蓄苷和番石榴苷的方法

摘要

本发明公开了一种分离番石榴叶中番石榴苷和萹蓄苷的方法，属于生物医药技术领域。所述方法包括原料预处理、萹蓄苷的提取和番石榴苷的提取三个步骤，本发明利用萹蓄苷和番石榴苷在石油醚和水中溶解度的差异，并通过一系列参数的控制，实现番石榴苷和萹蓄苷这两种同分异构体几乎完全分离，使用本发明所述方法分离得到的萹蓄苷的纯度≥98.32%，番石榴苷的纯度≥98.68%，具有方法简单、高效、纯度高的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种番石榴叶中活性成分的提取方法，尤其涉及一种分离番石榴叶中萹蓄苷和番石榴苷的方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

番石榴叶位桃金娘科植物番石榴（Psidium guajava L.）的干燥叶及带叶嫩茎，其中含有多种化学成分，包括黄酮、三萜以及鞣质等化合物。现代医学研究认为番石榴叶具有降血糖、抗氧化、抗病毒、抗菌和抗伤害感受等药理学作用。研究表明番石榴叶中槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷(又名番石榴苷guaijaverin)、萹蓄苷（avicularin）是番石榴叶提取物中降糖活性的主要物质。此外，国外的体外实验表明：番石榴苷对二肽基肽酶Ⅳ活性具抑制作用，可用于治疗与二肽基肽酶Ⅳ或其类似酶的活性相关的病症或异常，糖代谢障碍，如糖尿病、肥胖症、动脉硬化等。然而，番石榴苷和萹蓄苷在结构上属于一种一对异构体，二者分子量相同，唯一的差异在于糖苷结构上的差异，式一为番石榴苷的结构式，式二为萹蓄苷的结构式，前者与苷元连接的是阿拉伯吡喃糖，后者连接的是阿拉伯呋喃糖。正是由于二者这种微小的差异，导致很难将这两种化合物分离。

式一：

式二：

国家知识产权局于2015年3月25日公开了一件公告号为CN104447915A，名称为“一种从番石榴叶中制备番石榴苷和广寄生苷的方法及用途”的发明专利，该专利主要利用乙酸乙酯萃取后，再进行采用不同比例的洗脱剂对硅胶柱进行梯度洗脱，然后加入低碳醇真空浓缩结晶，过滤干燥即得番石榴苷、广寄生苷。该工艺由于采用了柱层析的方法，其工艺复杂，效率低，周期长，成本高，不适合规模化制备高纯度的番石榴苷和广寄生苷。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中番石榴苷及其异构体萹蓄苷的分离、纯化技术中存在工艺复杂，效率低，周期长，成本高的问题，提出一种采用溶剂萃取分离、纯化番石榴叶中萹蓄苷和番石榴苷的方法，该方法简单、高效、纯度高。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种分离番石榴叶中萹蓄苷和番石榴苷的方法，其特征在于：包括以下步骤：

a.原料预处理

将烘干后的番石榴叶粉碎后，加入番石榴叶3～5倍重量的乙醇，回流提取2～4次，每次5～7h，过滤并将多次的滤液合并，减压浓缩至四分之一体积后，过滤，收集上清液备用；

b.萹蓄苷的提取

向步骤a得到的上清液加入上清液2～4倍体积量的水，0.5～2倍体积量的石油醚，连续加热回流提取36～48h后，上层为石油醚层，下层为水层，用倾析法分离石油醚层和水层，过滤石油醚层，得到黄绿色沉淀，将沉淀加入1.5～3倍体积量的乙醇，完全溶解后，加水稀释至质量浓度40～60%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到萹蓄苷；

c. 番石榴苷的提取

将步骤b收集到的水层过滤，并向过滤得到的沉淀中加入1.5～3倍体积量的乙醇，完全溶解后加水稀释至质量浓度为40～60%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到番石榴苷。

为了更好地实现本发明，上述步骤a，步骤b，步骤c中，所述的水优选为去离子水；乙醇的体积浓度优选为98%。

步骤a中，所述粉碎后的番石榴叶的细度为10～50目。

步骤b中，所述回流提取的温度为65～70℃，在该温度范围内提取，收率更高。

步骤b和/或步骤c中，所述结晶为常温下静置24h。

步骤b和/或步骤c中，所述干燥的温度为 55～65℃，在该温度范围内干燥，可保持产品的活性，防止其变性。

采用上述方法得到的萹蓄苷的纯度≥98.32%，番石榴苷的纯度≥98.68%，纯度的检测方法为HPLC。

本发明的有益效果：

（1）与背景技术中的专利文献CN104447915A相比，本发明利用萹蓄苷和番石榴苷在石油醚和水中溶解度的差异，并通过一系列参数的控制，实现番石榴苷和萹蓄苷这两种同分异构体几乎完全分离，使用本发明所述方法分离得到的萹蓄苷的纯度≥98.32%，番石榴苷的纯度≥98.68%。本发明的方法简单，易于实现，成本低，效率高，适合规模化制备高纯度萹蓄苷和番石榴苷。

（2）本发明分离过程中使用的水为去离子水，避免自来水中的钙镁离子与活性成分结合，带来产物得率降低的问题。

（3）本发明步骤a，步骤b和步骤c中，所述的乙醇的体积浓度为98%，目标产物在高浓度的乙醇溶液中溶解度大，使用高浓度的乙醇可增加产品的收率。

（4）本发明步骤a中，粉碎后的番石榴叶的细度为10～50目，过细会直接增加粉碎成本，影响效率，过粗又会导致后期有效成分的提取不充分或提取时间长，带来产品得率不高、效率低下的问题，番石榴叶粉碎至10～50目较佳。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种分离番石榴叶中萹蓄苷和番石榴苷的方法，包括以下步骤：

a.原料预处理

将烘干后的番石榴叶粉碎后，加入番石榴叶3倍重量的乙醇，回流提取2次，每次5h，过滤并将多次的滤液合并，减压浓缩至四分之一体积后，过滤，收集上清液备用；

b.萹蓄苷的提取

向步骤a得到的上清液加入上清液2倍体积量的水，0.5倍体积量的石油醚，连续加热回流提取36后，上层为石油醚层，下层为水层，用倾析法分离石油醚层和水层，过滤石油醚层，得到黄绿色沉淀，将沉淀加入1.5倍体积量的乙醇，完全溶解后，加水稀释至质量浓度40%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到萹蓄苷；

c. 番石榴苷的提取

将步骤b收集到的水层过滤，并向过滤得到的沉淀中加入1.5倍体积量的乙醇，完全溶解后加水稀释至质量浓度为40%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到番石榴苷。

实施例2

一种分离番石榴叶中萹蓄苷和番石榴苷的方法，包括以下步骤：

a.原料预处理

将烘干后的番石榴叶粉碎后，加入番石榴叶5倍重量的乙醇，回流提取4次，每次5～7h，过滤并将多次的滤液合并，减压浓缩至四分之一体积后，过滤，收集上清液备用；

b.萹蓄苷的提取

向步骤a得到的上清液加入上清液4倍体积量的水， 2倍体积量的石油醚，连续加热回流提取48h后，上层为石油醚层，下层为水层，用倾析法分离石油醚层和水层，过滤石油醚层，得到黄绿色沉淀，将沉淀加入3倍体积量的乙醇，完全溶解后，加水稀释至质量浓度60%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到萹蓄苷；

c. 番石榴苷的提取

将步骤b收集到的水层过滤，并向过滤得到的沉淀中加入3倍体积量的乙醇，完全溶解后加水稀释至质量浓度为60%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到番石榴苷。

本实施例中，步骤a,b,c中，水为去离子水，干扰性更小。

实施例3

一种分离番石榴叶中萹蓄苷和番石榴苷的方法，包括以下步骤：

a.原料预处理

将烘干后的番石榴叶粉碎后，加入番石榴叶4倍重量的乙醇，回流提取3次，每次6h，过滤并将多次的滤液合并，减压浓缩至四分之一体积后，过滤，收集上清液备用；

b.萹蓄苷的提取

向步骤a得到的上清液加入上清液3倍体积量的水，1.5倍体积量的石油醚，连续加热回流提取40h后，上层为石油醚层，下层为水层，用倾析法分离石油醚层和水层，过滤石油醚层，得到黄绿色沉淀，将沉淀加入2倍体积量的乙醇，完全溶解后，加水稀释至质量浓度50%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到萹蓄苷；

c. 番石榴苷的提取

将步骤b收集到的水层过滤，并向过滤得到的沉淀中加入2倍体积量的乙醇，完全溶解后加水稀释至质量浓度为50%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到番石榴苷。

本实施例中，步骤a,b,c中，水为去离子水；乙醇的体积浓度为98%。

实施例4

一种分离番石榴叶中萹蓄苷和番石榴苷的方法，包括以下步骤：

a.原料预处理

将烘干后的番石榴叶粉碎后，加入番石榴叶3倍重量的乙醇，回流提取2次，每次6h，过滤并将多次的滤液合并，减压浓缩至四分之一体积后，过滤，收集上清液备用；

b.萹蓄苷的提取

向步骤a得到的上清液加入上清液2倍体积量的水，0.5倍体积量的石油醚，连续加热回流提取42h后，上层为石油醚层，下层为水层，用倾析法分离石油醚层和水层，过滤石油醚层，得到黄绿色沉淀，将沉淀加入3倍体积量的乙醇，完全溶解后，加水稀释至质量浓度40%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到萹蓄苷；

c. 番石榴苷的提取

将步骤b收集到的水层过滤，并向过滤得到的沉淀中加入3倍体积量的乙醇，完全溶解后加水稀释至质量浓度为60%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到番石榴苷。

本实施例中，步骤a,b,c中，水为去离子水；乙醇的体积浓度为98%。

步骤a中，所述粉碎后的番石榴叶的细度为10目。

实施例5

一种分离番石榴叶中萹蓄苷和番石榴苷的方法，包括以下步骤：

a.原料预处理

将烘干后的番石榴叶粉碎后，加入番石榴叶4倍重量的乙醇，回流提取2次，每次5.5h，过滤并将多次的滤液合并，减压浓缩至四分之一体积后，过滤，收集上清液备用；

b.萹蓄苷的提取

向步骤a得到的上清液加入上清液2倍体积量的水，0.5倍体积量的石油醚，连续加热回流提取40h后，上层为石油醚层，下层为水层，用倾析法分离石油醚层和水层，过滤石油醚层，得到黄绿色沉淀，将沉淀加入2.5倍体积量的乙醇，完全溶解后，加水稀释至质量浓度45%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到萹蓄苷；

c. 番石榴苷的提取

将步骤b收集到的水层过滤，并向过滤得到的沉淀中加入2.5倍体积量的乙醇，完全溶解后加水稀释至质量浓度为60%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到番石榴苷。

本实施例中，步骤a,b,c中，水为去离子水；乙醇的体积浓度为98%。

步骤a中，所述粉碎后的番石榴叶的细度为50目。

步骤b中，所述回流提取的温度为65℃。

步骤b，步骤c中，所述结晶为常温下静置24h。

步骤b，步骤c中，所述干燥的温度为 55℃。

实施例6

本实施例与实施例5的区别在于：

步骤a中，所述粉碎后的番石榴叶的细度为40目。

步骤b中，所述回流提取的温度为55℃。

步骤b，步骤c中，所述结晶为常温下静置24h。

步骤b，步骤c中，所述干燥的温度为 65℃。

实施例7

一种分离番石榴叶中萹蓄苷和番石榴苷的方法，包括以下步骤：

a.原料预处理

将烘干后的番石榴叶粉碎后，加入番石榴叶4倍重量的乙醇，回流提取3次，每次6h，过滤并将多次的滤液合并，减压浓缩至四分之一体积后，过滤，收集上清液备用；

b.萹蓄苷的提取

向步骤a得到的上清液加入上清液2倍体积量的水，1.5倍体积量的石油醚，连续加热回流提取40h后，上层为石油醚层，下层为水层，用倾析法分离石油醚层和水层，过滤石油醚层，得到黄绿色沉淀，将沉淀加入2倍体积量的乙醇，完全溶解后，加水稀释至质量浓度45%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到萹蓄苷；

c. 番石榴苷的提取

将步骤b收集到的水层过滤，并向过滤得到的沉淀中加入1.5倍体积量的乙醇，完全溶解后加水稀释至质量浓度为50%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到番石榴苷。

本实施例中，步骤a,b,c中，水为去离子水；乙醇的体积浓度为98%。

步骤a中，所述粉碎后的番石榴叶的细度为50目。

步骤b中，所述回流提取的温度为60℃。

步骤b，步骤c中，所述结晶为常温下静置24h。

步骤b，步骤c中，所述干燥的温度为60℃。

经检测，本实施例得到的萹蓄苷的纯度为98.41%，番石榴苷的纯度为98.75%，纯度的检测方法为HPLC。

实施例8

一种分离番石榴叶中萹蓄苷和番石榴苷的方法，包括以下步骤：

a.原料预处理

将烘干后的番石榴叶粉碎后，加入番石榴叶4倍重量的乙醇，回流提取3次，每次6h，过滤并将多次的滤液合并，减压浓缩至四分之一体积后，过滤，收集上清液备用；

b.萹蓄苷的提取

向步骤a得到的上清液加入上清液2倍体积量的水，0.5倍体积量的石油醚，连续加热回流提取48h后，上层为石油醚层，下层为水层，用倾析法分离石油醚层和水层，过滤石油醚层，得到黄绿色沉淀，将沉淀加入2倍体积量的乙醇，完全溶解后，加水稀释至质量浓度50%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到萹蓄苷；

c. 番石榴苷的提取

将步骤b收集到的水层过滤，并向过滤得到的沉淀中加入2倍体积量的乙醇，完全溶解后加水稀释至质量浓度为50%，结晶后，过滤，将结晶物干燥，得到番石榴苷。

本实施例中，步骤a,b,c中，水为去离子水；乙醇的体积浓度为98%。

步骤a中，所述粉碎后的番石榴叶的细度为50目。

步骤b中，所述回流提取的温度为60℃。

步骤b，步骤c中，所述结晶为常温下静置24h。

步骤b，步骤c中，所述干燥的温度为60℃。

经检测，本实施例得到的萹蓄苷的纯度为98.32%，番石榴苷的纯度为98.68%，纯度的检测方法为HPLC。