法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-03-27
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C07D471/10 授权公告日:20180921 终止日期:20190409 申请日:20120409
专利权的终止
2018-09-21
授权
授权
2016-12-14
实质审查的生效 IPC(主分类):C07D471/10 申请日:20120409
实质审查的生效
2016-11-16
公开
公开
本申请是中国专利申请号201280019621.3(PCT/IB2012/051732)，申请日2012年4月9日，发明名称为“用作乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类的吡唑并螺酮衍生物”的分案申请。
【发明所属的技术领域】
本发明涉及作用为乙酰辅酶A羧化酶(类)的抑制剂类的取代的吡唑并螺酮化合物类及它们在治疗通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(类)所调节的疾病、病症或障碍中的用途。
【背景技术】
乙酰辅酶A羧化酶类(ACC)为在大多数物种中发现的酶家族，且与经由催化从乙酰辅酶A产生丙二酰基-CoA的脂肪酸合成和代谢有关。在哺乳动物中，已确定二种ACC酶的同型异构体。ACC1，其在脂质合成组织(诸如脂肪和肝脏)中表现高含量，控制长链脂肪酸的生物合成中的第一关键步骤。如果乙酰辅酶A不被羧酸化以形成丙二酰基-CoA时，其经过柠檬酸循环(Krebs cycle)代谢。ACC2，肝脏ACC的次要组分但在心和骨骼肌肉中为主要同型异构体，催化在粒腺体的胞质表面产生丙二酰基-CoA，且通过抑制肉碱棕榈酰基转移酶调节多少脂肪酸被利用在β-氧化中。因此，通过增加脂肪酸利用和通过预防重生脂肪酸合成的增加，ACC抑制剂(ACC-I)的长期给予也可消耗肝脏和脂肪组织甘油三酯(TG)储存在食用高或低脂饮食的肥胖者体内，从而导致体脂肪选择性损耗。
Abu-Etheiga等人进行的研究提议ACC2发挥控制脂肪酸氧化的基本作用且如此其将提供治疗抗肥胖和肥胖相关的疾病(诸如II型糖尿病)的靶标。参见文献Abu-Etheiga,L.,et al.,“Acetyl-CoA carboxylase 2mutant mice are protected against obesityand diabetes induced by high-fat/high-carbohydrate diets”PNAS,100(18)10207-10212(2003)。还参见文献Choi,C.S.,et al.,“Continuous fat oxidation in acetyl-CoA carboxylase 2knockout mice increases total energy expenditure,reduces fatmass,and improves insulin sensitivity”PNAS,104(42)16480-16485(2007)。
逐步清楚：肝脂质累积引起肝脏胰岛素抗药性且促成II型糖尿病的致病性。Salvage等人证明ACC1和ACC2两者皆涉及调节肝细胞中脂肪氧化，而ACC1(大鼠肝脏中主要同型异构体)为脂肪酸合成的唯一调节剂。此外，在他们的模型中，需要二种同型异构体的组合减少以显着地降低肝脏的丙二酰基-CoA含量、增加喂食状态的脂肪氧化、减少脂质累聚和改良胰岛素体内作用。因此，显示肝脏ACC1和ACC2抑制剂类可用于治疗非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和肝脏胰岛素抗药性。参见文献Savage,D.B.,et al.,“Reversal of diet-induced hepatic steatosis and hepatic insulin resistance by antisenseoligonucleotide inhibitors of acetyl-CoA carboxylases 1and 2”J Clin Investdoi:10.1172/JCI27300。还参见文献Oh,W.,et al.,“Glucose and fat metabolism inadipose tissue of acetyl-CoA carboxylase 2knockout mice”PNAS,102(5)1384-1389(2005)。
因此，需要含有ACC1及/或ACC2抑制剂类的药物以通过抑制脂肪酸合成和增加脂肪酸氧化治疗肥胖和肥胖相关疾病(诸如NAFLD和II型糖尿病)。
【发明内容】
本发明的第一实施方式涉及具有式A结构的化合物，式I化合物
或其药学上可接受的盐；其中
G为
R1为(C1-C6)烷基或(C3-C7)环烷基；R2为吲哚基、吲唑基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、喹啉基或苯并咪唑基；其中每个R2为任选地经1至2个取代基取代，这些取代基独立地选自氰基、-L-C(O)NR4R5、-L-NR4R5、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基或卤素；R3为氢或(C1-C3)烷基；L为直接键或-X(C1-C3)亚烷基；X为直接键、O或S；R4和R5各自独立为氢、(C1-C3)烷基、(C3-C7)环烷基或4至7员杂环基，其中所述(C1-C3)烷基、(C3-C7)环烷基或4至7员杂环基为任选地经1至3个氟或(C1-C3)烷氧基取代。
本发明的第二实施方式为第一实施方式的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2是经氰基、-L-C(O)NR4R或-L-NR4R5取代的吲哚基、吲唑基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、喹啉基或苯并咪唑基。
本发明的第三实施方式为第二实施方式的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2是经-L-C(O)NR4R5或-L-NR4R5取代的吲哚基、吲唑基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、喹啉基或苯并咪唑基；且L为直接键。
本发明的第四实施方式为第一实施方式的化合物(其中R1为异丙基、叔丁基或双环[1.1.1]戊基)或其药学上可接受的盐。本发明的第五实施方式为任一上述实施方式的化合物(其中R3为氢)或其药学上可接受的盐。
本发明的另一实施方式为第一实施方式的化合物，其中G为
本发明的另一实施方式为第一实施方式的化合物，其中G为
本发明的另一实施方式为化合物，其中R2为
其中每个R2为经氰基、-L-C(O)NR4R5或-L-NR4R5取代；或其药学上可接受的盐。
再者，本发明的另一实施方式为上述实施方式的化合物，其中R2为经氰基、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)NHCH2CH3、-C(O)CH2CF3、-OCH2C(O)NH2、-NH2、-NHCH3或-NHC(CH3)3取代；或其药学上可接受的盐。
本发明的另一实施方式为化合物，其中G为
本发明的另一实施方式为化合物，其中G为
本发明的另一实施方式为化合物，其中G为
，其中每个R2为被-L-C(O)NR4R5、-L-NR4R5或(C1-C3)烷氧基的一个取代基取代；R3为氢；L为直接键或-X(C1-C3)亚烷基；X为直接键、O或S；且R4和R5各自独立为氢或(C1-C3)烷基；或其药学上可接受的盐。
本发明的另一实施方式为化合物，其中G为
，其中每个R2为被-L-C(O)NR4R5、-L-NR4R5或(C1-C3)烷氧基的一个取代基取代；L为直接键；且R4和R5为氢；或其药学上可接受的盐。
本发明的另一实施方式为化合物，其中G为
本发明的另一实施方式为第一实施方式的化合物，其中G为
本发明的另一实施方式为第一实施方式的化合物，其中G为
本发明的另一实施方式为第一实施方式的化合物，其中G为
本发明的另一实施方式为第一实施方式的化合物，其中G为
本发明的另一实施方式为第一实施方式的化合物，其中G为
1至2个取代基取代的
本发明的另一实施方式为第一实施方式的化合物，其中G为
本发明的另一实施方式为下式结构的化合物
或其药学上可接受的盐。
本发明的另一实施方式为下式结构的化合物
或其药学上可接受的盐。
本发明的另一实施方式为下式结构的化合物
或其药学上可接受的盐。
本发明的另一实施方式为选自下述的化合物：6-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲哚-3-甲酰胺；5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲唑-3-甲酰胺；6-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-甲酰胺；6-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲唑-3-甲酰胺；5-[(1- 异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺；5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲哚-3-甲酰胺；1’-[(2-氨基-1H-苯并咪唑-5-基)羰基]-1-异丙基-1,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(6H)-酮；5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-甲基-1H-吲唑-3-甲酰胺；N-乙基-5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲唑-3-甲酰胺；5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吲唑-3-甲酰胺；6-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲酰胺；5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺；1-异丙基-1’-{[2-(甲基氨基)-1H-苯并咪唑-5-基]羰基}-1,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(6H)-酮；5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-苯并咪唑-2-甲酰胺；5-[(1-叔丁基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲唑-3-甲酰胺；5-[(1-叔丁基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺；6-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲哚-3-甲酰胺；6-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲唑-3-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲唑-3-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H- 螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲哚-3-甲酰胺；6-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；1’-[(2-氨基-1H-苯并咪唑-5-基)羰基]-2-叔丁基-2,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(6H)-酮；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-乙基-1H-吲唑-3-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-甲基-1H-吲唑-3-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吲唑-3-甲酰胺；2-叔丁基-1’-{[2-(甲基氨基)-1H-苯并咪唑-5-基]羰基}-2,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(6H)-酮；6-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-甲酰胺；6-[(2’-叔丁基-7’-氧代-6’,7’-二氢-1H,2’H-螺[哌啶-4,5’-吡喃并[3,2-c]吡唑]-1-基)羰基]-1H-吲唑-3-甲酰胺；6-[(2’-叔丁基-7’-氧代-6’,7’-二氢-1H,2’H-螺[哌啶-4,5’-吡喃并[3,2-c]吡唑]-1-基)羰基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；6-[(2’-叔丁基-7’-氧代-6’,7’-二氢-1H,2’H-螺[哌啶-4,5’-吡喃并[3,2-c]吡唑]-1-基)羰基]-1H-吲哚-3-甲酰胺；5-[(2’-叔丁基-7’-氧代-6’,7’-二氢-1H,2’H-螺[哌啶-4,5’-吡喃并[3,2-c]吡唑]-1-基)羰基]-1H-吲唑-3-甲酰胺；5-[(2’-叔丁基-7’-氧代-6’,7’-二氢-1H,2’H-螺[哌啶-4,5’-吡喃并[3,2-c]吡唑]-1-基)羰基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；5-[(2’-叔丁基-7’-氧代-6’,7’-二氢-1H,2’H-螺[哌啶-4,5’-吡喃并[3,2-c]吡唑]-1-基)羰基]-1H-吲哚-3-甲酰胺；5-[(2’-叔丁基-7’-氧代-6’,7’-二氢-1H,2’H-螺[哌啶-4,5’-吡喃并[3,2-c]吡唑]-1-基)羰基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺；1-[(2-氨基-1H-苯并咪唑-5-基)羰基]-2’-叔丁基-2’H-螺[哌啶-4,5’-吡喃并[3,2-c]吡唑]-7’(6’H)-酮；2’-叔丁基-1-{[2-(甲基氨基)-1H-苯并咪唑-5-基]羰基}-2’H-螺[哌 啶-4,5’-吡喃并[3,2-c]吡唑]-7’(6’H)-酮；6-[(2’-叔丁基-7’-氧代-6’,7’-二氢-1H,2’H-螺[哌啶-4,5’-吡喃并[3,2-c]吡唑]-1-基)羰基]-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-甲酰胺；及5-[(2’-叔丁基-7’-氧代-6’,7’-二氢-1H,2’H-螺[哌啶-4,5’-吡喃并[3,2-c]吡唑]-1-基)羰基]-1H-苯并咪唑-2-甲酰胺；或它们的药学上可接受的盐。
再者，本发明的另一实施方式为选自下述的化合物：6-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-甲腈；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲腈；1’-[(2-氨基喹啉-6-基)羰基]-2-叔丁基-2,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(6H)-酮；5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺；6-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-环丙基-1H-吲唑-3-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-异丙基-1H-吲唑-3-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-丙基-1H-吲唑-3-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-(2-甲氧基乙基)-1H-吲唑-3-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-环丁基-1H-吲唑-3-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-氧杂环丁烷-3-基-1H-吲唑-3-甲酰胺；6-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-环丙基-1H-吲唑-3-甲酰胺；6-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-甲基-1H-吲唑-3-甲酰胺；6-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-乙基-1H-吲唑-3-甲酰胺；6-[(2-叔 丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-(2-甲氧基乙基)-1H-吲唑-3-甲酰胺；6-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-异丙基-1H-吲唑-3-甲酰胺；6-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-丙基-1H-吲唑-3-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-环丙基-1H-吲哚-3-甲酰胺；6-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-环丁基-1H-吲唑-3-甲酰胺；6-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-氧杂环丁烷-3-基-1H-吲唑-3-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-(2-甲氧基乙基)-1H-吲哚-3-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-甲基-1H-吲哚-3-甲酰胺；5-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-乙基-1H-吲哚-3-甲酰胺；及6-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-N-环丙基-1H-吲哚-3-甲酰胺；或它们的药学上可接受的盐。
本发明另一方面为药物组合物，其如实施方式的任一者所述的包含某量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。优选地，该组合物包含治疗有效量的本发明化合物。该组合物还可包含至少一种其他药剂。优选药剂包括抗糖尿病剂及/或抗肥胖剂。
本发明另一方面为治疗哺乳动物的通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(类)所调节的疾病、病症或障碍的方法，其包括将治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物给予至需要该治疗的哺乳动物(优选人)的步骤。
由乙酰辅酶A羧化酶类的抑制剂类所调节的疾病、障碍或病症包括II型糖尿病和糖尿病相关的疾病，诸如非酒精性脂肪肝疾病 (NAFLD)、肝脏胰岛素抗药性、高血糖、代谢综合征、葡萄糖耐量降低、糖尿病神经病变、糖尿病肾病变、糖尿病视网膜病变、肥胖、血脂异常、高血压、超高胰岛素血症和胰岛素抗药性综合征。优选的疾病、障碍或病症包括II型糖尿病、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、肝脏胰岛素抗药性、高血糖、葡萄糖耐量降低、肥胖及胰岛素抗药性综合征。更优选的为II型糖尿病、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、肝脏胰岛素抗药性、高血糖及肥胖。最优选为II型糖尿病。
一个优选实施方式为治疗(例如延迟病程或发作)动物的II型糖尿病和糖尿病相关的障碍的方法，其包含将治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或其组合物给予至需要该治疗的动物的步骤。
一个更优选实施方式为治疗人的II型糖尿病和糖尿病相关的障碍或延迟II型糖尿病和糖尿病相关的障碍的病程或发作的方法，其包含将治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或其组合物给予至需要该治疗的人的步骤。
一个最优选实施方式为治疗人的II型糖尿病或延迟II型糖尿病的病程或发作的方法，其包含将治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或其组合物给予至需要该治疗的人的步骤。
另一优选实施方式为治疗动物的肥胖和肥胖相关的障碍的方法，其包含将治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或其组合物给予至需要该治疗的动物的步骤。
另一优选实施方式为治疗人的肥胖和肥胖相关的障碍的方法，其包含将治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或其组合物给予至需要该治疗的人的步骤。
另一优选实施方式为治疗动物的非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)或肝脏胰岛素抗药性的方法，其包含将治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或其组合物给予至需要该治疗的动物(特别是人)的步骤。
另一优选实施方式为治疗人的非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)或肝 脏胰岛素抗药性的方法，其包含将治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或其组合物给予至需要该治疗的人的步骤。
本发明的化合物类可与其他药剂类(特别是下文所述的抗肥胖剂类和抗糖尿病剂类)组合给予。组合治疗可给予(a)单一药物组合物，其包含本发明的化合物、至少一种本文所述的其他药剂和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂；或(b)二种分开药物组合物，其包含(i)第一组合物，其包含本发明化合物和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂、和(ii)第二组合物，其包含至少一种本文所述的其他药剂和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。药物组合物类可同时地或连续地且以任何顺序给予。
另一实施方式为本发明的化合物在制造用于治疗通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(类)所调节的疾病、病症或障碍的药物中的用途。
另一实施方式为本发明的化合物在制造用于治疗通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(类)所调节的疾病、病症或障碍的药物中的用途，其中该疾病、病症或障碍为II型糖尿病、糖尿病相关的障碍、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)或肝脏胰岛素抗药性。
另一实施方式为本发明的化合物在制造用于治疗通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(类)所调节的疾病、病症或障碍的药物中的用途，其中该疾病、病症或障碍为II型糖尿病。
另一实施方式为实施例6、14或25的化合物在制造用于治疗通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(类)所调节的疾病、病症或障碍的药物中的用途，其中该疾病、病症或障碍为II型糖尿病、糖尿病相关的障碍、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)或肝脏胰岛素抗药性。
另一实施方式为实施例6、14或25的化合物在制造用于治疗通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(类)所调节的疾病、病症或障碍的药物中的用途，其中该疾病、病症或障碍为II型糖尿病。
另一实施方式为实施例6的化合物在制造用于治疗通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(类)所调节的疾病、病症或障碍的药物中的用途，其中该疾病、病症或障碍为II型糖尿病。
另一实施方式为实施例14的化合物在制造用于治疗通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(类)所调节的疾病、病症或障碍的药物中的用途，其中该疾病、病症或障碍为II型糖尿病。
另一实施方式为实施例25的化合物在制造用于治疗通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(类)所调节的疾病、病症或障碍的药物中的用途，其中该疾病、病症或障碍为II型糖尿病。
发明详细说明
定义
“治疗有效量”表示本发明化合物或其药学上可接受的盐的量：其(i)治疗或预防特定疾病、病症或障碍、(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病症或障碍的一或多种症状、或(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病、病症或障碍的一或多种症状的发作。
术语“动物”是指人(男性或女性)、陪伴动物(例如狗、猫和马)、食物来源动物、动物园动物、水生动物、鸟类及其他类似的动物物种。“食用动物”是指食物来源动物，诸如牛、猪、羊及家禽。
词语“药学上可接受”指示物质或组合物必须与其他成分(包含调制剂)及/或所期望治疗的哺乳动物在化学及/或毒物学上可相容。
术语“治疗”包含预防性(即预防治疗性)及舒减性治疗。
如使用于本文中，除非另有指示，术语“调节”是指使用本发明化合物以抑制乙酰辅酶A羧化酶(ACC)(类)。
如使用于本文中，除非另有指示，术语“介导”是指通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(ACC)(类)而(i)治疗或预防特定疾病、病症或障碍、(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病症或障碍的一或多种症状、或(iii)预防或延迟本文中所述的特定疾病、病症或障碍的一或多种症状的发作。
术语“本发明化合物(类)”，除非另有其他特殊鉴定，是指式(I)化合物及该化合物的任何药学上可接受的盐类以及所有立体异构体(其包括非对映异构体和对映异构体)、互变异构体、构象异构体及同 位素标记的化合物。本发明化合物的水合物及溶剂合物被认为是本发明的一部分术语，其中化合物分别与水或溶剂结合。
术语“(C1-C6)烷基”和“(C1-C3)烷基”为指定碳数(分别为1至6个或1至3个碳原子)的烷基，其可为直链或支链。例如，术语“(C1-C3)烷基”具有1至3个碳且是由甲基、乙基、正丙基及异丙基组成。具有特定碳数的烷氧基是以类似的方式命名。
术语“(C1-C3)亚烷基”是指具有1至3个碳的二价(C1-C3)烷基，其可为直链或支链。术语(C1-C3)亚烷基的代表性实例包括但不限于-CH2-、-CH2CH2-、-CH(CH3)CH2-、-CH2CH2(CH3)-或-CH2CH2CH2-。
术语“(C3-C7)环烷基”表示具有3至7个碳原子的环烷基且是由环丙基、环丁基、环戊基、环己基及环庚基组成，或可为双环系统，诸如双环[1.1.1.]戊基。术语“卤素”表示氟、氯、溴或碘。
术语“4至7员杂环基”表示4至7员非芳香族杂环基。连接位置可经由碳原子或氮原子。该4至7员杂环基的非限制性实例包括氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、吗啉基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基及类似基。
术语吲哚基、吲唑基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、喹啉基或苯并咪唑基如下式所示的基且连接位置位于该基的碳原子。
在一个实施方式中，式(I)化合物是具有下述结构的N1ACC抑制剂化合物。
本发明的化合物类可经包括类似于化学技术所公知的方法的合成途径合成，特别是根据本文所说明的。起始材料通常可购得，诸如Aldrich Chemicals(Milwaukee,WI)，或使用本领域技术人员所公知的方法容易制得(例如经一般描述于Louis F.Fieser andMary Fieser,Reagents for Organic Synthesis,v.1-19,Wiley,New York(1967-1999版)或Beilsteins Handbuch der organischen Chemie,4,Aufl.ed.Springer-Verlag,Berlin；其包括附录(还可经Beilstein在线数据库取得))的方法制得)。
为说明的目的，下述反应图提供用于合成本发明的化合物类及关键中间体类的可能途径。关于各自反应步骤的更详细说明，参见下述实施例。本领域技术人员当能理解可使用其他合成途径以合成本发明的化合物类。虽然特定起始材料及试剂描述于反应图且讨论于下文中，但是可容易地经其他起始材料及试剂取代，以提供各种衍生物类及/或反应条件。此外，许多通过下述方法所制得的化合物类可参照本揭露内容且使用本领域技术人员所公知的一般化学方法进行进一步修正。
在制备本发明的化合物类时，保护中间体类的远程官能性(例如伯或仲胺)可能是必要的。该保护的需求将依赖于远程官能性的性质及制备方法的条件而改变。适当的氨基保护基(NH-Pg)包括乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧羰基(BOC)、苯甲氧羰基(CBz)及9-氟基亚甲氧羰基(Fmoc)。同样地，“羟基保护基”是指阻断或保护羟基官能性的羟基的取代基。适当的羟基保护基(O-Pg)包括例如烯丙基、乙酰基、甲硅烷基、苯甲基、对甲氧基苯甲基、三苯甲基及类似基。该保护作用的 需求是由本领域技术人员容易决定。保护基及其用途的一般说明可参见文献T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons,New York,1991。
下述反应图(反应图I至III)提供制备式(I)化合物类的代表性步骤。应了解这些反应图是以非限制性的方式被解释且所述方法的合理变化可用于制备式(I)化合物类。
反应图I说明可用于提供本发明的式Ia的N1 ACC抑制剂化合物类的一般方法，该式Ia化合物是式(I)化合物，其中R1为(C1-C6)烷基或(C3-C7)环烷基且R2为吲哚基、吲唑基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、喹啉基或苯并咪唑基，其中每个R2为任选地经1至2个取代基取代，这些取代基独立选自氰基、-L-C(O)NR4R5、-L-NR4R5、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基和卤素；R3为氢；L为直接键或-X(C1-C3)亚烷基；X为直接键、O或S；且R4和R5各自独立为氢、(C1-C3)烷基、(C3-C7)环烷基或4至7员杂环基，其中该(C1-C3)烷基、(C3-C7)环烷基或4至7员杂环基为任选地经1至3个氟或(C1-C3)烷氧基取代。
反应图I
依据反应图I，通过使式VIIIa化合物(其中Pg表示适当的胺保护基)于适当的溶剂中与三(二甲氨基)甲烷反应，可生成式VIIa化合物。该反应可于适当的溶剂(诸如甲苯)中和升高的温度(诸如回流)下进行1至24小时以生成式VIIa化合物。通过于适当的溶剂(诸如乙醇)中使式VIIa化合物与适当的烷基或环烷基肼(R1NHNH2，诸如叔丁基肼、>2CO3”))的存在下、于回流乙醇中且于约20℃至约80℃的温度下，使式VIIa化合物与适当的烷基肼(R1NHNH2)反应约2至24小时以提供所期望的环化化合物，可生成式VIa化合物。
通过于适当的溶剂中与适当的溴化剂和水反应，将式VIa化合物转化为对应的羟基溴化物衍生物，可生成式Va化合物。例如，通过于室温下且于四氢呋喃中，使式VIa化合物与N-溴琥珀酰亚胺(NBS)和水反应1小时以提供对应的式Va羟基溴衍生物，可生成式Va化合物。于适当的溶剂中通过适当的氧化剂使式Va化合物氧化，可生成式IVa化合物。例如，于0℃至室温下且于丙酮中通过与Jones氏试剂反应15分钟至4小时并随后经萃取处理，可使式Va化合物氧化。随后，一般于室温下且于适当的溶剂(诸如四氢呋喃)中，通过与氯化铵水溶液和金属锌反应15分钟至4小时，可使式IVa化合物脱溴。
随后可使用标准方法(其取决于所使用的保护基Pg)将式IIIa化合物去保护以提供式IIa的游离螺哌啶衍生物。例如，当Pg为BOC时，可使用标准强酸去保护条件(诸如在二
随后式IIa的螺哌啶衍生物可通过标准方法经酰化以提供式Ia化合物。例如，随后可使用与所期望羧酸(R2CO2H)的标准肽偶合反应以形成化合物(Ia)。例如，螺哌啶中间体IIa和羧酸(R2CO2H)可通过形成活化羧酸酯而偶合，诸如通过使羧酸(R2CO2H)与肽偶合试剂(诸如O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲
反应图II说明可用于提供本发明的式Ib的N2 ACC抑制剂化合物类的一般方法，其中R1为(C1-C6)烷基或(C3-C7)环烷基且R2为吲哚基、吲唑基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、喹啉基或苯并咪唑基，其中每个R2为任选地经1至2个取代基取代，这些取代基独立选自氰基、-L-C(O)NR4R5、-L-NR4R5、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基或卤素；R3为氢；L为直接键或-X(C1-C3)亚烷基；X为直接键、O或S；且R4和R5各自独立为氢、(C1-C3)烷基、(C3-C7)环烷基或4至7员杂环基，其中该(C1-C3)烷基、(C3-C7)环烷基或4至7员杂环基为任选地经1至3个氟或(C1-C3)烷氧基取代。
反应图II
依据反应图II，使式VIIb化合物与适当的肼衍生物R1-NHNH2反应以生成式VIb化合物。典型上该反应于适当的溶剂(诸如乙醇)中且于升高的温度(诸如60℃至回流)下进行约1至48小时以生成式VIb化合物。当所使用的肼衍生物R1-NHNH2是呈其对应酸加成盐(诸如盐酸盐)的形式时，应当能了解所生成的式VIb化合物还可呈盐的形式存在。当式VIb化合物是呈盐形式存在时，于转化为式Vb化合物之前，典型上使式VIb化合物于周围温度下且于适当的溶剂(诸如二氯甲烷)中经适当的碱(诸如碳酸氢钠)处理15分钟至4小时。首先通过于0℃下使氧氯化磷与二甲基甲酰胺反应并随后加入式VIb化合物且于升高的温度(诸如80℃)下使式VIb化合物进行环化反应达1至24小时以形成式Vb化合物。随后通过于适当的溶剂(诸如四氢呋喃)中与适当的溴化剂和甲醇反应，使式Vb化合物转化为对应的式IVb甲氧基溴衍生物。例如，使式Vb化合物于周围温度下与N-溴琥珀酰亚胺的20％甲醇/四氢呋喃溶液反应30分钟至4小时，可生成式IVb化合物。使式IVb化合物于适当的溶剂(诸如四氢呋喃)中经适当的碱(诸如叔丁醇钾)处理15分钟至2小时并随后经适当的酸(诸如2N氢氯酸)酸化，可生成式IIIb化合物。使式IIIb化合物去保护并随后如前反应图I所描述的方法与酸R2CO2H偶合以生成式Ib化合物。
反应图III说明可用于提供本发明的式Ic的N2 ACC抑制剂化合物类的一般方法，其中R1和R2如上述且R3是烷基。
反应图III
在质子溶剂(诸如乙醇或叔戊醇)或非质子溶剂(诸如四氢呋喃或二甲基甲酰胺)中，在钯(Pd)催化剂(诸如四(三苯膦)钯(0)或前催化剂与配体的组合(诸如乙酸钯(II)和2-二环己基膦基-2’,6’-二甲氧基联苯(“SPhos”)))的存在下且于碱(诸如碳酸钾)的存在或不存在下，通过使式IVc溴化物与烷基或烯基三丁基锡烷(诸如甲基三(正丁基)锡烷、乙烯基三(正丁基)锡烷或烯丙基三(正丁基)锡烷)或三烷基环硼氧烷(诸如三甲基环硼氧烷或三乙烯基环硼氧烷)于约20℃至约100℃ 的温度下进行经钯催化的交叉偶合反应约2至约18小时或于微波加热下于约100℃至约150℃的温度下进行经钯催化的交叉偶合反应约5至约60分钟，可生成式IIIc化合物。若使用烯基三烷基锡烷或烯基环硼氧烷以建立R3基，则通过于乙醇中进行Pd/C催化的氢化反应或通过于乙醇或乙酸乙酯中且于Pd/C的存在下用氢来源(诸如甲酸铵或1-甲基-1,4-环己二烯)处理，可使所生成的烯烃还原。
随后可使用标准方法(其取决于所使用的保护基Pg)将式IIIc化合物去保护以提供式IIc的游离螺哌啶衍生物。例如，当Pg为BOC时，可使用标准强酸去保护条件(诸如在二
随后式IIc的螺哌啶衍生物可通过标准方法经酰化以提供式Ic化合物。例如，随后可使用与所期望羧酸(R2CO2H)的标准肽偶合反应以形成化合物Ic。例如，螺哌啶中间体IIc和羧酸(R2CO2H)可通过形成活化羧酸酯而偶合，诸如通过使羧酸(R2CO2H)与肽偶合试剂(诸如HATU或EDC·HCl)且在活化剂(诸如HOBt)存在或不存在下和适当碱(诸如DIEA、三乙胺或NMM)存在下及在适当溶剂(诸如THF及/或DMF、DMA或二氯甲烷)中接触且随后使经活化的羧酸酯与螺哌啶衍生物IIc接触而形成式Ic化合物。可使用类似方法以制备对应的N1类似物(其中如显示于反应图III，R1位于吡唑环的N1位置而非N2位置上)。
本发明的化合物类可以本身或以其药学可接受的盐类的形式经分离和使用。依据本发明，具有多个碱性氮原子的化合物类可与改变当量数的酸形成盐类。从业者应了解所有这些盐类属于本发明的范畴。
本发明所使用的本发明化合物类的药学上可接受的盐类包括该化合物的药学上可接受的无机和有机盐类。这些盐类可在化合物的最后分离和纯化期间原位制得，或可分别地使该化合物与适当有机或无机酸反应并分离所形成的盐而制得。代表性盐类包括但不限于氢溴酸盐、 盐酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、草酸盐、苯磺酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、丙二酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、六氟磷酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、甲酸盐、柠檬酸盐、顺丁烯二酸盐、反丁烯二酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐(lactobionate)、月桂基磺酸盐及类似物。此等盐还可包括基于碱金属和碱土金属的阳离子(诸如钠、锂、钾、钙、镁及类似物)及无毒性的铵、季铵和胺阳离子，其包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺及类似物。对于其他实例可参阅文献例如Berge et al.,J.Pharm.Sci.,66,1-19(1977)。
本发明化合物类可以一种以上的晶形存在。式I化合物类及其盐类(包括溶剂合物和水合物)的多形体形成本发明的部份且可通过在不同条件下结晶本发明化合物而制得。例如，使用重结晶用的不同溶剂或不同溶剂的混合物；在不同温度下结晶；各种冷却的模式；在结晶期间范围从非常快到非常慢的冷却。多形体也可通过加热或熔化本发明的化合物，接着逐渐或快速的冷却而获得。多形体的存在可以固体探针核磁共振(NMR)光谱法、红外线(IR)光谱法、示差扫描热量法、粉末X-射线衍射或这些其他技术测定。
本发明还包括经同位素标记的化合物类，其是与式(I)化合物相同但其中一或多个原子是由原子量或质量数与通常天然所发现的原子量或质量数不同的原子置换。可并入本发明化合物类的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、硫及氟的同位素，分别诸如2H、3H、13C、14C、>15N、18O、17O、35S、36Cl、125I、129I及18F。某些经同位素标记的本发明化合物类(例如其中并入放射性同位素(诸如3H和14C)者)可用于药物及/或底物组织分布分析。氚(即3H)及碳-14(即14C)同位素为特别优选，因为它们容易制备及可探测性。再者，经较重的同位素(诸如氘(即2H))取代可供给由较大的代谢稳定性所产生的某些治疗优势(例如增加体内半衰期或减少剂量需求)，因而在某些状况下优选。经同位素标记的>
本发明化合物类可含有手性中心。这些化合物类可以对映异构体的混合物类或以纯对映异构体存在。当化合物包括立构中心时，该化合物可通过本领域技术人员所公知的方法拆分成纯对映异构体，例如通过形成可被分离的非对映异构体盐类，例如通过结晶；形成可被分离的立体异构体衍生物或络合物，例如通过结晶，气液或液相层析；一种对映异构体与对映异构体特异性反应剂的选择性反应，例如酶催化酯化作用；或在手性环境的气液或液相层析，例如在手性载体(例如具有结合手性配位基的硅石)上或在手性溶剂存在下。应了解在所期望立体异构体通过上述分离步骤的一种转化成另一化学实体的情形下，需要进一步步骤以释出所期望的镜像异构形式。或者，特定立体异构体可通过使用光学活性起始材料、通过使用光学活性试剂、反应物、催化剂或溶剂的不对称合成法、或通过不对称转变法将一立体异构体转化成另一立体异构体而合成。
本发明化合物类可以可被分离的不同稳定构形存在。由于不对称单键的受限旋转的扭转不对称性，例如因位阻或环张力，可允许不同构象异构体的分离。本发明化合物类进一步包括式(I)化合物类的各自构象异构体及其混合物类。
本发明化合物类可用于治疗通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(类)(特别是ACC1和ACC2)所调节的疾病、病症及/或障碍。本发明的另一实施方式为药物组合物，其包含治疗上有效量的本发明化合物及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。本发明的化合物类(其包括本发明所使用的组合物及方法)还可用于制造用于本发明所描述的治疗应用的药物。
典型的调制剂为通过使本发明化合物与载剂、稀释剂或赋形剂混合而制得。适当载剂、稀释剂及赋形剂是为本领域技术人员所公知且包括诸如碳水化合物、蜡、水溶性及/或泡胀性聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水及类似物。所使用的特定载剂、稀释剂 或赋形剂将取决于给予本发明化合物的方式及目的。溶剂通常是基于本领域技术人员所认为安全给予哺乳动物的溶剂(GRAS)而选择。通常，安全溶剂为无毒水性溶剂(诸如水)及其他可溶于水或与水可混溶的无毒溶剂。适当水性溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如PEG400或PEG300)等及其混合物。调制剂还可包括一或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、湿润剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、不透明剂、助滑剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、香料、调味剂及其他提供药物(即本发明化合物或其医学组合物)精美外观或有助于制造药物产品(即用于制备药剂)的已知添加剂。
可使用公知溶解和混合步骤以制备调制剂。例如在一或多种上述赋形剂的存在下，将大量药物(即本发明化合物或该化合物的稳定形式(即与环糊精衍生物或其他已知络合剂形成的络合物))溶于适当溶剂中。不良水溶性化合物类的溶解率可通过使用喷雾干燥分散液提高，诸如文献Takeuchi,H.at el.,“Enhancement of the dissolution rate ofa poorly water-soluble drug(tolbutamide)by a spray-drying solvent depositionmethod and disintegrants”J.Pharm.Pharmacol.,39,769-773(1987)和EP 0 901 786 B1(US2002/009494)所描述者，其全文以引用方式并入本文。通常将本发明化合物调配成药物剂型以提供易于控制的药物剂量并为患者提供精美且易于处理的产品。
药物组合物还包括本发明化合物类的溶剂合物及水合物。“溶剂合物”是指式(I)化合物(包括其药学上可接受的盐类)与一或多个溶剂分子的分子复合物。这些溶剂分子为药物技术所惯用者，已知其对接受者无害，例如水、乙醇、乙二醇及类似物。“水合物”是指其中溶剂分子为水的复合物。溶剂合物类及/或水合物类优选地是以结晶形式存在。其他溶剂可作为供制备更为所期望的溶剂合物类的中间溶剂合物类，诸如甲醇、甲基叔丁醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、(S)-丙二醇、(R)-丙二醇、1,4-丁炔二醇及类似物。
用于施予的药物组合物(或调制剂)可视给予药物所使用的方法而 以各种方式包装。通常，用于配给的对象包括药物调制剂以适当形式存放于容器。适当容器为本领域技术人员所熟知者且包括诸如瓶(塑料和玻璃)、药囊、安瓿、塑料袋、金属筒及类似物的材料。容器还可包括防伪组件以防止轻率地接近包装内容物。另外，说明容器内容物的标签存放在容器上。标签还可包括适当警语。
本发明进一步提供治疗动物通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(类)所调节的疾病、病症及/或障碍的方法，其包括对需要该治疗的动物给予治疗有效量的本发明化合物或包含有效量的本发明化合物及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂的药物组合物。该方法特别可用于治疗因抑制乙酰辅酶A羧化酶(类)而获益的疾病、病症及/或障碍。
本发明的一方面是肥胖症及肥胖症相关的障碍(例如过重、体重增加或体重维持)的治疗。
肥胖及过重通常是由身体质量指数(BMI)定义，其是与总体脂肪量有关且能估计疾病的相关风险。BMI是以体重(千克)除以身高(米)的平方(kg/m2)计算。过重典型地定义为BMI为25-29.9kg/m2，而肥胖典型地定义为BMI为30kg/m2。参见例如National>
本发明的另一方面是用于治疗(例如延迟病程或发作)糖尿病或糖尿病相关的障碍，其包括I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病，还称为“IDDM”)和II型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病，还称为“NIDDM”)、葡萄糖耐量降低、胰岛素抗药性、高血糖症及糖尿病并发症(诸如动脉粥样硬化症、冠状动脉心脏病、中风、末梢血管病、肾病变、高血压、神经病变及视网膜病变)。
本发明的另一方面是治疗肥胖合并性糖尿病，诸如代谢综合征。代谢综合征包括诸如血脂异常、高血压、胰岛素抗药性、糖尿病(例如II型糖尿病)、冠状动脉疾病及心脏衰竭的疾病、病症或障碍。关于 代谢综合征的更详细资料，参见例如Zimmet,P.Z.et al.,“The Metabolic Syndrome:Perhaps an Etiologic Mystery but Far From a Myth-Where Does the International Diabetes Federation Stand？,”Diabetes&Endocrinology,7(2),(2005)及Alberti,K.G.et al.,“The Metabolic Syndrome-A NewWorldwide Definition”,Lancet,366,1059-62(2005)。优选地，相较于不含药物的载剂对照组，给予本发明化合物类提供统计学上显着(p<0.05)减低的至少一种心血管疾病风险因子，诸如降低血浆瘦素、C-反应性蛋白质(CRP)及/或胆固醇。给予本发明化合物类还可提供统计学上显着(p<0.05)减低的葡萄糖血清水平。
本发明的另一方面为非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和肝脏胰岛素抗药性的治疗。
对约100千克体重的正常成人，每千克体重约0.001毫克至约10毫克的剂量典型上足够，优选地约0.01毫克/千克至约5.0毫克/千克，更优选地约0.01毫克/千克至约1毫克/千克。然而，视被治疗病患的年龄与体重、所预期的给予路径、被给予的特定化合物及类似物而可能需要在一般剂量范围内做某些变动。对特定病患的剂量范围与最适宜剂量的测定是在熟知本申请揭示内容的本领域的普通技术人员的能力范围内。本发明化合物类还可被用于持续释放、控制释放及延迟释放调制剂中，这些形式也为本领域的普通技术人员所公知。
本发明化合物也可与其他药剂结合使用以治疗本文所述的疾病、病症及/或障碍。因此，还提供治疗方法，其包括给予与其他药剂组合的本发明化合物类。可与本发明化合物组合使用的适当药剂包括抗肥胖剂(包括食欲抑制剂)、抗糖尿病剂、抗高血糖剂、降脂剂及抗高血压剂。
可与本发明化合物类组合的适当降脂剂包括例如WO 2011005611的第30页第20行至第31页第30行所描述者。这些降脂剂包括胆汁酸多价螯合剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HMG-辅酶A合成酶抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、酰基辅酶A-胆固醇酰基转化酶(ACAT)抑制剂、 CETP抑制剂、角鲨烯合成酶抑制剂、PPARα激动剂、FXR受体调节剂、LXR受体调节剂、脂蛋白合成抑制剂、肾素血管收缩素(angiotensisn)系统抑制剂、PPARδ部分激动剂、胆汁酸再吸收抑制剂、PPARγ激动剂、三酸甘油酯合成抑制剂、微粒体三酸甘油酯输送抑制剂、转录调节剂、角鲨烯环氧酶抑制剂、低密度脂蛋白受体诱发剂、血小板聚集抑制剂、5-LO或FLAP抑制剂、烟碱酸铬(niacin bound chromium)及其他影响脂质组成的药剂。
可与本发明化合物类组合的适当抗高血压剂包括例如WO2011005611的第31页第31行至第32页第18行所描述者。抗高血压剂包括利尿剂、β-肾上腺素阻断剂、钙通道阻断剂、血管收缩素转化酶(ACE)抑制剂、中性肽链内切酶抑制剂、内皮素拮抗剂、血管舒张剂、血管收缩素II受体拮抗剂、α/β肾上腺素阻断剂、α1阻断剂、α2激动剂、醛固酮抑制剂、盐皮质激素受体抑制剂、肾素抑制剂及血管生成素-2-结合剂。
适当抗糖尿病剂包括乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抑制剂，诸如WO2009144554、WO2003072197、WO 2009144555及WO 2008065508所描述者、二酰基甘油O-酰基转移酶1(DGAT-1)抑制剂，诸如WO 09016462或WO 2010086820所描述者、AZD7687或LCQ908、二酰基甘油O-酰基转移酶2(DGAT-2)抑制剂、单酰基甘油O-酰基转移酶抑制剂类、磷酸二酯酶(PDE)-10抑制剂、AMPK活化剂、磺酰脲(例如醋酸己脲、氯磺丙脲、特泌胰(diabinese)、格列本脲(glibenclamide)、格列吡嗪(glipizide)、格列本脲(glyburide)、格列美脲(glimepiride)、格列齐特(gliclazide)、格列戊脲(glipentide)、格列喹酮(gliquidone)、格列索脲(glisolamide)、妥拉磺脲(tolazamide)及甲苯磺丁脲(tolbutamide))、美格列奈(meglitinide)、α-淀粉酶抑制剂(例如淀粉酶抑肽(tendamistat)、萃他丁(trestatin)及AL-3688)、α-葡萄糖苷水解酶抑制剂(例如阿卡波糖(acarbose))、α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如脂解素(adiposine)、卡格列波糖(camiglibose)、乙格列酯(emiglitate)、米格列醇(miglitol)、伏 格列波糖(voglibose)、普拉米星-Q(pradimicin-Q)及沙司他丁(salbostatin))、PPARγ激动剂(例如巴格列酮(balaglitazone)、环格列酮(ciglitazone)、达格列酮(darglitazone)、恩格列酮(englitazone)、伊格列酮(isaglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone)及曲格列酮(troglitazone))、PPARα/γ激动剂(例如CLX-0940、GW-1536、GW-1929、GW-2433、KRP-297、L-796449、LR-90、MK-0767及SB-219994)、双胍(例如二甲双胍(metformin))、胰高血糖素样肽1(GLP-1)调节剂，诸如激动剂(例如艾生丁(exendin)-3和艾生丁-4)、利拉糖肽(liraglutide)、阿必鲁肽(albiglutide)、艾塞那肽(exenatide)
适当抗肥胖剂类(其某些还可作为抗糖尿病药剂)包括11β-羟基类固醇去氢酶-1(11β-HSD型1)抑制剂、硬脂酰基-辅酶A去饱和酶-1(SCD-1)抑制剂、MCR-4激动剂、胆囊收缩素-A(CCK-A)激动剂、单胺再摄取抑制剂类(诸如西布曲明(sibutramine))、拟交感剂、β3肾上腺素激动剂、多巴胺激动剂(诸如溴隐亭(bromocriptine))、促黑激素类似物、5HT2c激动剂、黑色素聚集激素拮抗剂、瘦素(OB蛋白质)、瘦素类似物、瘦素激动剂、甘丙胺素拮抗剂、脂肪酶抑制剂类(诸如四氢利泼斯汀(tetrahydrolipstatin)，即奥利司他(orlistat))、减食欲剂(诸如铃蟾素(bombesin)激动剂)、神经肽-Y拮抗剂(例如NPY>3-36(包括其类似物)、BRS3调节剂、类鸦片受体亚型的混合拮抗剂、拟甲状腺剂、脱氢表雄甾酮或其类似物、糖皮质激素激动剂或拮抗剂、食欲素拮抗剂(orexinantagonists)、胰高血糖素样肽-1激动剂、睫状神经营养因子(诸如AxokineTM，可得自Regeneron医药公司，Tarrytown,NY与Procter&Gamble公司，Cincinnati,OH)、人类刺鼠相关蛋白质(AGRP)抑制剂类、组织胺3拮抗剂或逆激动剂、神经激素U激动剂、MTP/ApoB抑制剂类(例如肠选择性MTP抑制剂，诸如地洛他派(dirlotapide))、JTT130、优斯他派(Usistapide)、SLx4090)、阿片类拮抗剂、mu类鸦片受体调节剂，其包括但不限于GSK1521498、MetAp2抑制剂类，其包括但不限于ZGN-433、在胰高血糖素、GIP及GLP1受体的2或多个具有混合调节活性的药剂(诸如MAR-701或ZP2929)、去甲肾上腺素转运子抑制剂类、大麻素-1-受体拮抗剂/逆激动剂、胃促生长素激动剂/拮抗剂、胃泌酸调节素(oxyntomodulin)和类似物、单胺吸收抑制剂类(诸如但不限于特索芬辛(tesofensine))、食欲素拮抗剂、组合剂(诸如安非他酮(bupropion)加唑尼沙胺(zonisamide)、普兰林肽(pramlintide)加美曲普汀(metreleptin)、安非他酮加纳曲酮(naltrexone)、芬特明(phentermine)加托吡酯(topiramate))及类似物。
用于本发明组合方面的优选抗肥胖剂包括肠选择性MTP抑制剂 (例如地洛他派、米瑞他派(mitratapide)和英普他派(implitapide)、R56918(CAS号403987)和CAS号913541-47-6)、CCKa激动剂(例如PCT WO 2005/116034或US 2005-0267100A1所描述的N-苯甲基-2-[4-(1H-吲哚-3-基甲基)-5-氧代-1-苯基-4,5-二氢-2,3,6,10b-四氮杂-苯并[e]薁-6-基]-N-异丙基-乙酰胺)、5HT2c激动剂(例如洛卡色林(lorcaserin))、MCR4激动剂(例如US 6,818,658所描述的化合物类)、脂肪酶抑制剂(例如西替利司他(Cetilistat))、PYY3-36(如使用在本文中“PYY3-36”包括类似物(诸如聚乙二醇化(peglated)PYY3-36，例如US2006/0178501所描述者)、类鸦片拮抗剂(例如纳曲酮)、油酰雌酮(oleoy1-estrone)(CAS号180003-17-2)、奥尼匹肽(obinepitide)(TM30338)、普兰林肽
所有列举的美国专利和文献(包括所有实施例所参考的技术通报)是以全文引用的方式合并于本文中。
本文下述的实施例仅用于说明。本文所反映的组合物、方法及各种参数仅想例示说明本发明的各种方面和实施方式，且不想以任何方式限制本发明所请的申请专利范围。
【实施例】
下述的化合物类和中间体类是使用Chemdraw Ultra所提供的命名规则11.0.1版(CambridgeSoft Corp.,Cambridge Massachusetts)命名。Chemdraw Ultra所提供的命名规则11.0.1版为本领域技术人员所公知且据信Chemdraw Ultra所提供的命名规则11.0.1版通常与IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)推荐的有机化学的命名法和CAS索引规则命名相称。除非另有说明，所有反应剂为商业购得。下文中所有列举的参考数据是以引用的方式并入。
急骤层析是根据Still et al.,J.Org.Chem.,1978,43,2923所述的方法实施。
本文所讨论的所有
本文所讨论的所有
质谱记录于Waters(Waters Corp.；Milford,MA)Micromass Platform II光谱仪。除非另有说明，质谱记录于Waters(Milford,MA)Micromass Platform II光谱仪。
质子NMR化学位移以距四甲硅烷的低磁场的每百万份的份数给出且记录于VarianUnity 300、400或500MHz(百万赫)光谱仪(Varian Inc.；Palo Alto,CA)。NMR化学位移以距四甲硅烷(用于质子)或氟三氯甲烷(用于氟)的低磁场的每百万份的份数给出。
使用下述方法测量HPLC保留时间：方法A：柱：Waters Atlantis dC18 4.6×50毫米，5微米；流动相A：在水中的0.05％TFA(v/v)；流动相B：在乙腈中的0.05％TFA(v/v)；梯度：在4.0分钟内95％A/5％B线性至5％A/95％B，固定于5％A/95％B至5.0分钟；流率：2.0毫升/分钟。
下述制备物是用于下述实施例中以合成所例示的化合物。
自对应的来源可取得下述的起始物：
6-溴-1H-吲哚-3-甲腈-Indofine Chemical Company,Inc.(Hillsborough,NJ,USA)
5-溴-1H-吲哚-3-甲腈-Indofine Chemical Company,Inc.(Hillsborough,NJ,USA)
6-溴-1H-吲哚-2-甲酰胺-Aurora Fine Chemicals LLC(San Diego,CA,USA)
3-碘-1H-吲唑-5-羧酸甲酯-Anichem LLC(North Brunswick,NJ,USA)
1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸-ACS Scientific Inc.(Metuchen, NJ,USA)
1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸甲酯-ACS Scientific Inc.(Metuchen,NJ,USA)
1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-羧酸甲酯-Anichem LLC(North Brunswick,NJ,USA)
5-(甲氧羰基)-1H-吲哚-2-羧酸-Bepharm Ltd.(Shanghai,China)
3-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-羧酸甲酯-MolBridge(Plainsboro,NJ,USA)
2-溴-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-羧酸乙酯-American Custom Chemicals Corp.(San Diego,CA,USA)
5-溴-1H-吲唑-3-羧酸-Anichem LLC(North Brunswick,NJ,USA)
6-甲氧基喹啉-3-羧酸-BioBlocks,Inc.(San Diego,CA,USA)，如文献A.Hanna-Elias et al.Austr.J.Chem.2009,62,150-156所描述的方法进行制备
2-氨基喹啉-6-羧酸-Princeton Biomolecular Research Inc.(MonmouthJunction,NJ,USA)
5-溴-2-硝基苯甲醛-Oakwood Products,Inc.(West Columbia,SC,USA)
喹啉-7-羧酸乙酯-ASW MedChem,Inc.(New Brunswick,NJ,USA)
中间体和起始物的制备
中间体1：1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.9-氧代-3-氮杂螺[5.5]十一碳-7-烯-3-羧酸叔丁酯
将甲基乙烯基酮(146ml，1.78摩尔)加入至4-甲酰基哌啶-1-羧酸叔丁酯(375g，1.76摩尔)的四氢呋喃(18L)溶液中。使反应混合物冷却至-5℃并经10分钟逐滴加入氢氧化钾的乙醇溶液(3N，0.243L)。使反应混合物回温至室温并经搅拌16小时。加入环己烷(10L)并使溶液经饱和氯化钠溶液冲洗(3×10L)。使有机层经浓缩成油。使该油溶解于环己烷/乙酸乙酯(80：20，2L)中并通过硅藻土
步骤2.1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮
使9-氧代-3-氮杂螺[5.5]十一碳-7-烯-3-羧酸叔丁酯(250g)和三(二甲氨基甲烷)(325ml)的甲苯(1.9L)溶液于回流下经加热4小时。使混合物经蒸馏且浓缩至最小搅拌体积(110℃)并随后加入甲苯(1.9L)。使反应物再经蒸馏至最小搅拌体积并冷却至室温。加入甲苯(1.8L)和异丙基肼氢氯化物(135g)并使溶液经加热至回流状态达5小时。使反应物冷却至室温并经柠檬酸(10％水溶液，2×150ml)和水(200ml)冲洗。使有机层随后经蒸馏至最小搅拌体积。加入甲醇(2L)并经蒸馏至最小搅拌体积。使用甲醇(2L)重复此步骤。使溶液再溶解于甲醇(2.5L)中并加入一份N-溴琥珀酰亚胺(176g)。使该溶液于23℃下经搅拌2小时。加入硫代硫酸钠水溶液(5重量％(wt％)，0.5L)并使混合物经搅拌15分钟。使反应混合物经蒸馏(45℃，210mm Hg)浓缩至约0.5L并随后加入2-甲基四氢呋喃(2.5L)。经搅拌15分钟后，丢弃水层。使有机层经浓缩为约0.2L并加入四氢呋喃(0.5L)。 对该混合物加入叔丁醇钾的四氢呋喃溶液(1.9L，1M溶液)。使该溶液经加热至60℃并经搅拌1小时。经冷却至室温后，经20分钟加入氢氯酸水溶液(1N，2.2L)。使该混合物于室温下经搅拌20分钟并随后使相层分离。移出水层并再经乙酸乙酯(1.75L)萃取。使结合的有机层经水(1L)冲洗并经蒸馏浓缩(除去4L溶剂)。加入乙酸乙酯(1.8L)并使溶液浓缩至最小搅拌体积。加入乙酸乙酯(3L)和甲醇(0.8L)并使溶液冷却至0℃。经20分钟逐滴加入乙酰氯(401ml)并使溶液于0℃下经搅拌4小时。于氮气下通过过滤以收集沉淀物。使滤液经乙酸乙酯(0.5L)冲洗并经真空烘箱(40℃)干燥以生成灰白色固体的标题化合物(241g)。+ESI(M+H)248.4；1H>3OD,δ):7.43(s,1H),5.32-5.42(m,1H),3.15-3.25(m,4H),2.89(s,2H),2.64(s,2H),1.69-1.90(m,4H),1.37-1.45(m,6H)。
中间体2：2-叔丁基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(2H)-酮盐酸盐(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.9-氧代-3-氮杂螺[5.5]十一碳-7-烯-3-羧酸苄酯
于搅拌下将对甲苯磺酸(6.92g，36.4毫摩尔)加入至配备Dean-Stark阱的三颈烧瓶(2L)内4-甲酰基哌啶-1-羧酸苄酯(90.0g，364毫摩尔)的苯(700ml)溶液中。使反应物经加热至70℃并加入3-丁烯-2-酮(61.8ml，753毫摩尔)。使混合物于回流下经加热24小时并于该阱收集排出的水。使反应物冷却至室温并经饱和碳酸氢钠水溶 液(500ml)冲洗。使有机相置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。将所生成的暗褐色油溶解于二氯甲烷(200ml)中并通过二氧化硅垫(600ml二氧化硅)过滤且先后经庚烷(2L)、50％乙酸乙酯/庚烷(3L)及乙酸乙酯(3L)流洗。结合含有澄清产物的部分并经浓缩以生成浓稠褐色油的标题化合物(68.1g)。结合含有杂质的部分并经浓缩和急骤柱层析(10-80％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成额外的浓稠褐色油的标题化合物(23.6g)。达到结合产率91.7g(94.1％)。1H>3,δ):7.27-7.43(m,5H),6.79(d,J＝10.3Hz,1H),5.95(d,J＝10.3Hz,1H),5.13(s,2H),3.56-3.71(m,2H),3.39-3.55(m,2H),2.38-2.50(m,2H),1.96(t,J＝6.7Hz,2H),1.52-1.70(m,4H)。
步骤2.9-(2-叔丁基亚肼基)-3-氮杂螺[5.5]十一碳-7-烯-3-羧酸(E)-苄酯盐酸盐
使9-氧代-3-氮杂螺[5.5]十一碳-7-烯-3-羧酸苄酯(4.89g，16.3毫摩尔)溶解于乙醇(60ml)并加入叔丁基肼氢氯化物(2.44g，19.6毫摩尔)。使混合物于回流下经加热4小时并随后于60℃下经搅拌48小时。使反应物冷却至室温并经减压下浓缩以生成黄褐色油，其是经静置固化以生成黄褐色固体的标题化合物(6.60g，99％)。+ESI(M+H)370.3；1H>3,δ):7.26-7.42(m,5H),6.46(d,J＝10.0Hz,1H),6.26(br.s.,1H),5.08-5.16(m,2H),3.43-3.58(m,4H),3.19(s,2H),1.78(s,2H),1.44-1.63(m,4H),1.17-1.30(m,9H)。
步骤3.2-叔丁基-2,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯
使9-(2-叔丁基亚肼基)-3-氮杂螺[5.5]十一碳-7-烯-3-羧酸(E)-苄酯盐酸盐(8.00g，19.7毫摩尔)溶解于二氯甲烷(100ml)并经碳酸氢钠(1.70g，19.7毫摩尔)处理。使溶液经搅拌30分钟并随后经过滤和减压下浓缩以生成9-(2-叔丁基亚肼基)-3-氮杂螺[5.5]十一碳-7-烯-3-羧酸(E)-苄酯。将二甲基甲酰胺(80ml)载入圆底烧瓶(250ml)并经冷却至0℃。经2分钟逐滴加入氧氯化磷(5.51ml，59.1毫摩尔)并使溶液于0℃下经搅拌30分钟。对该溶液加入9-(2-叔丁基亚肼基)-3-氮杂螺[5.5]十一碳-7-烯-3-羧酸(E)-苄酯的二甲基甲酰胺(15ml)溶液并使反应物于80℃下经加热18小时。使反应物冷却至室温并经减压下浓缩。使所生成的油溶解于乙酸乙酯(500ml)并经盐水冲洗(2×150ml)。使水层经额外的乙酸乙酯(100ml)萃取。使结合的有机层置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。使所生成的油经急骤柱层析(10-80％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成淡黄色油的标题化合物(4.89g，65％)。+ESI(M+H)380.0；1H>3,δ):7.25-7.36(m,5H),7.18(s,1H),6.57(d,J＝10.0Hz,1H),5.86(d,J＝10.0Hz,1H),5.12(s,2H),3.51-3.69(m,2H),3.36-3.53(m,2H),2.58(s,2H),1.59-1.74(m,2H),1.52-1.58(m,9H),1.41-1.53(m,2H)。
步骤4.6-溴-2-叔丁基-7-甲氧基-2,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯
使2-叔丁基-2,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯(560mg，1.48毫摩尔)溶解于20％甲醇/四氢呋喃混合物(25ml)中。加入N-溴琥珀酰亚胺(315mg，1.77毫摩尔)并使混合物经搅拌30分钟。使该混合物于减压下经浓缩。使所生成的油分布于乙酸乙酯(50ml)和水(50ml)中。使有机相置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。使所生成的油经急骤柱层析(10-80％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成无色油的标题化合物(538mg，73％)。1H>3,δ):7.27-7.43(m,6H),5.12(s,2H),4.74(d,J＝2.7Hz,1H),4.41(d,J＝2.5Hz,1H),3.60-3.84(m,2H),3.54-3.61(m,3H),3.14-3.39(m,2H),2.59(s,2H),1.86(br.s.,1H),1.69(br.s.,3H),1.51-1.60(m,9H)。
步骤5.2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯
使6-溴-2-叔丁基-7-甲氧基-2,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯(150mg，0.31毫摩尔)溶解于四氢呋喃(5ml)中并与叔丁醇钾(0.61ml，0.61毫摩尔，1M四氢呋喃溶液)反应且经搅拌30分钟。加入2N HCl水溶液(5ml)并使混合物于室温下经搅拌15分钟。使混合物经水(50ml)稀释并经乙酸乙酯(50ml)萃取。使有机层置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。使残余物经急骤柱层析(10-80％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成澄清油的标题化合物(86mg，71％)。+ESI (M+H)396.5；1H>3,δ):7.38(s,1H),7.27-7.35(m,5H),5.11(s,2H),3.48(t,J＝5.8Hz,4H),2.71(s,2H),2.57(s,2H),1.57-1.66(m,9H),1.47-1.59(m,4H)。
步骤6.2-叔丁基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(2H)-酮盐酸盐
使2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯(441mg，1.12毫摩尔)溶解于甲醇(15ml)中并用甲酸铵(217mg，3.34毫摩尔)和Pd/C(50mg，10％Pd，50％H2O)处理。使反应物于室温下经搅拌2小时并通过过滤以除去催化剂。使滤液于减压下经浓缩。将所生成的无色固体溶解于乙酸乙酯(20ml)中并经0.5M>1H>3OD,δ):7.74(s,1H),3.20(t,J＝6.1Hz,4H),2.88(s,2H),2.64(s,2H),1.67-1.91(m,4H),1.55-1.63(m,9H)。
中间体3：2-(双环[1.1.1]戊-1-基)-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(2H)-酮(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.1-(双环[1.1.1]戊-1-基)肼-1,2-二羧酸二(叔丁酯)
使三(2,2,6,6-四甲基-3,5-庚二酸根)锰(III)(281mg，0.460毫摩尔)溶解于配备加入漏斗、气体入口及温度计的三颈烧瓶(1L)内2-丙醇(100ml)中。使溶液于氮气下冷却至-15℃。使偶氮二羧酸二(叔丁酯)(8.11g，34.5毫摩尔)和苯基硅烷(2.9ml，23毫摩尔)溶解于二氯甲烷(100ml)并将所生成的橙色溶液经10分钟逐滴加入至上述的冷却溶液且维持内部温度于约-10℃。于-15℃下将[1.1.1]螺桨烷(Journal of the American ChemicalSociety(2001),123(15),3484-3492)(50ml，23毫摩尔，0.46M戊烷溶液)一份加入至反应混合物中。使反应物于-15℃下经搅拌30分钟。除去冷却浴并使反应物回温至室温且经搅拌4小时。使反应物经浓缩并经急骤柱层析(5-20％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成呈澄清油的标题化合物(6.38g，93％)，该油经静置固化。-ESI(M-H)297.4；1H>3,δ):6.26(br.s.,1H),2.37(s,1H),2.02(s,6H),1.45(s,18H)。
步骤2.双环[1.1.1]戊-1-基肼氢氯化物
将4N氢氯酸的1,4-二
步骤3.2-(双环[1.1.1]戊-1-基)-7-氧代-2,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯
通过类似于制备中间体2的步骤1至5所描述的方法，于步骤2中使用双环[1.1.1]戊-1-基肼氢氯化物，制备标题化合物。+ESI(M+H)406.1；1H>3,δ):7.28-7.36(m,5H),7.27(s,1H),5.10(s,2H),3.44-3.50(m,4H),2.70(s,2H),2.62(s,1H),2.56(s,2H),2.31(s,6H),1.53(d,J＝2.5Hz,4H)。
步骤4.2-(双环[1.1.1]戊-1-基)-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(2H)-酮
将10％Pd/C(1mg)和1-甲基环己-1,4-二烯(0.1ml，0.9毫摩尔)加入至2-(双环[1.1.1]戊-1-基)-7-氧代-2,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯(150mg，0.37毫摩尔)的乙酸乙酯(10ml)溶液中。使反应物经加热至80℃并经搅拌2小时。使反应物冷却至室温并经通过硅藻土过滤。使滤液经浓缩以生成油的标题化合物(100mg，100％)。+ESI(M+H)272.4；1H>3,δ):7.26(s,1H),2.82(dd,J＝6.63,4.49Hz,4H),2.69(s,2H),2.60(s,1H),2.56(s,2H),2.30(s,6H),1.47-1.55(m,4H)。
中间体4：1-叔丁基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.10-((二甲氨基)亚甲基)-9-氧代-3-氮杂螺[5.5]十一碳 -7-烯-3-羧酸苄酯
使9-氧代-3-氮杂螺[5.5]十一碳-7-烯-3-羧酸苄酯(15.2g，51毫摩尔)溶解于甲苯(180ml)中并加入三(二甲氨基)甲烷(22.2g，27毫摩尔)。使反应物经加热至回流状态达5小时并随后冷却至室温且经隔夜搅拌。使反应溶液经真空浓缩以生成标题化合物(18.0g，100％)。+APCI(M+H)354.6；1H>3,δ):7.49(s,1H),7.28-7.40(m,5H),6.59(d,J＝10.16Hz,1H),6.01(d,J＝9.97Hz,1H),5.13(s,2H),3.52-3.66(m,2H),3.39-3.52(m,2H),3.07(s,6H),2.74(s,2H),1.58-1.73(m,2H),1.41-1.58(m,2H)。
步骤2.1-叔丁基-1,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯
使10-((二甲氨基)亚甲基)-9-氧代-3-氮杂螺[5.5]十一碳-7-烯-3-羧酸苄酯(59.2g，167毫摩尔)溶解于乙醇(835ml)中。对该溶液加入乙酸(20ml，345毫摩尔)和叔丁基肼氢氯化物(29.1g，234毫摩尔)。使反应物经加热至回流状态达1小时。使反应物冷却至室温并经浓缩为橙色油。急骤柱层析(20-40％乙酸乙酯/庚烷)纯化生成淡黄色固体的标题化合物(50g，79％)。+ESI(M+H)380.5；1H>3,δ):7.26-7.40(m,5H),7.17(s,1H),6.66(d,J＝9.95Hz,1H),5.77(d,J＝10.15Hz,1H),5.12(s,2H),3.38-3.64>
步骤3.6-溴-1-叔丁基-7-羟基-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯
使1-叔丁基-1,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯(50g，132毫摩尔)溶解于四氢呋喃(1L)中。对反应物加入N-溴琥珀酰亚胺(24.6g，138毫摩尔)和水(250ml)。使反应物于室温下经搅拌1小时。使反应物分布于乙酸乙酯和水中。分离相层并使有机相经水冲洗2次且经饱和氯化钠水溶液冲洗1次。使有机相置于硫酸镁上干燥并经过滤和真空浓缩。使残余物自二乙醚结晶析出以生成奶油色固体的标题化合物(60.7g，97％)。+ESI(M+H)476.5；1H>3,δ):7.28-7.36(m,5H),7.27(s,1H),5.23(t,J＝4.68Hz,1H),5.12(s,2H),4.24(d,J＝4.49Hz,1H),3.87(br.s.,2H),3.12(br.s.,2H),2.79(d,J＝16.00Hz,2H),2.59(d,J＝15.80Hz,2H),1.95(br.s.,1H),1.66(s,11H),1.58(br.s.,1H)。
步骤4.6-溴-1-叔丁基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯
使6-溴-1-叔丁基-7-羟基-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯(57.9g，122毫摩尔)溶解于丙酮(1L)中并经冰浴冷却至0℃。对该溶液加入Jones试剂(122ml)(Fillion,E.Tetrahedron Letters 2004,46,1091-1094)。除去冰浴并使反应物回温至室温且经搅拌45分钟。加入饱和碳酸氢钠水溶液直至气体产生终止且pH达至7。使所生成的混合物经通过硅藻土垫过滤并经乙酸乙酯洗涤。分离滤液层并使水层经乙酸乙酯萃取。使结合的有机萃取液经水冲洗2次并经饱和氯化钠水溶液冲洗1次，置于硫酸镁上干燥且经过滤和浓缩。使残余物自乙酸乙酯/庚烷结晶析出以生成标题化合物(50.4g，87％)。+ESI(M+H)474.5；1H>3,δ):7.32(d,J＝9.38Hz,6H),5.11(s,2H),4.24(s,1H),3.58-3.84(m,2H),3.16-3.41(m,2H),2.67-2.91(m,2H),1.80(br.s.,1H),1.61-1.76(m,11H),1.52-1.61(m,1H)。
步骤5.1-叔丁基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯
将饱和氯化铵水溶液(600ml)和锌粉(20.8g，319毫摩尔)加入至6-溴-1-叔丁基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯(50.4g，106毫摩尔)的四氢呋喃(600ml)溶液中。使反应物于室温下经搅拌30分钟。使反应物经通过硅藻土过滤。分离滤液的相层并使有机相经水和饱和氯化钠水溶液冲洗。使有机相置于硫酸镁上干燥并经过滤和浓缩以生成泡沫。使该泡沫经乙酸乙酯/庚烷研磨1次并经二乙醚研磨1次以生成白色固体的标题化合物(40.4g，96％)。+ESI(M+H)396.5；1H>3,δ):7.24-7.38(m,6H),5.11(s,2H),3.36-3.61(m,4H),2.74(s,2H),2.54(s,>
步骤6.1-叔丁基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮
将10％Pd/C(9.4g)加入至1-叔丁基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯(46.6g，118毫摩尔)的乙醇(730ml)溶液中。对该混合物加入1-甲基-1,4-环己二烯(90ml，769毫摩尔)。使反应物于回流下经搅拌2小时。使反应物冷却至室温并经通过硅藻土过滤。使滤液经真空浓缩以生成灰色固体。使该固体溶解于乙酸乙酯(150ml)中且对该溶液加入4M氢氯酸的1,4-二
中间体5：1-(双环[1.1.1]戊-1-基)-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮氢氯化物(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.1-(双环[1.1.1]戊-1-基)-1,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯
将三(二甲氨基)甲烷(0.47ml，2.7毫摩尔)加入至9-氧代-3-氮 杂螺[5.5]十一碳-7-烯-3-羧酸苄酯(543mg，1.81毫摩尔)的甲苯(15ml)溶液中。使反应物经加热至回流状态并经搅拌4小时。使反应物冷却至室温，经乙酸乙酯(50ml)稀释且经水(50ml)冲洗。使有机层置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。将所生成的黄色油溶解于甲苯(15ml)中并加入双环[1.1.1]戊-1-基肼氢氯化物(310mg，1.81毫摩尔)。使混合物经加热至回流状态并经搅拌18小时。使反应物冷却至室温，经乙酸乙酯(50ml)稀释且经水(50ml)和1M柠檬酸水溶液(50ml)冲洗。将有机层置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。急骤柱层析纯化生成2个位置异构产物。
1-(双环[1.1.1]戊-1-基)-1,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯(365mg，52％):+APCI(M+H)390.5；1H>3,δ):7.33-7.36(m,5H),7.22(s,1H),6.51(d,J＝10.1Hz,1H),5.81(d,J＝9.9Hz,1H),5.12(s,2H),3.42-3.59(m,4H),2.59(s,3H),2.35(s,6H),1.43-1.68(m,4H)。
2-(双环[1.1.1]戊-1-基)-2,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯(85mg，12％):+APCI(M+H)390.5；1H>3,δ):7.33-7.36(m,5H),7.08(d,J＝0.8Hz,1H),6.56(d,J＝10.0Hz,1H),5.91(d,J＝10.0Hz,1H),5.12(s,2H),3.40-3.62(m,4H),2.57(s,3H),2.26(s,6H),1.41-1.68(m,4H)。
步骤2.1-(双环[1.1.1]戊-1-基)-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯
将N-溴琥珀酰亚胺(155mg，0.87毫摩尔)加入至1-(双环[1.1.1]戊-1-基)-1,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羧酸苄酯(340mg，0.87 毫摩尔)的3：1四氢呋喃：水(10ml)溶液中。使反应物于室温下经搅拌45分钟。使反应物经乙酸乙酯(50ml)稀释并经0.5N氢氧化钠水溶液(25ml)和饱和硫代硫酸钠水溶液(25ml)冲洗。使有机层置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。将所生成的油溶解于二氯甲烷(5ml)中并经活化的4A分子筛(500mg)和过钌酸四丙基铵(16mg，0.04毫摩尔)处理。使浆泥经N-甲基吗啉-N-氧化物(243mg，1.75毫摩尔)的乙腈(5ml)溶液处理。使反应物于室温下经搅拌2小时。使反应物经通过硅藻土过滤并使滤液经浓缩。使残余物经急骤柱层析(7-60％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成澄清油。将该油溶解于四氢呋喃(5ml)中并经饱和氯化铵水溶液(5ml)和锌粉(171mg，2.62毫摩尔)处理。使混合物于室温下经搅拌30分钟。使反应物经水(50ml)稀释并经乙酸乙酯(2×30ml)萃取。使结合的有机相经盐水冲洗，置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。急骤柱层析(7-60％乙酸乙酯/庚烷)纯化生成白色固体的标题化合物(148mg，42％)。1H>3,δ):7.34(m,6H),5.13(s,2H),3.51(m,4H),2.75(s,2H),2.59(s,1H),2.54(s,2H),2.41(s,6H),1.56(m,4H)。
步骤3.1-(双环[1.1.1]戊-1-基)-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮氢氯化物
通过类似于制备中间体4的步骤6所描述的方法，制备标题化合物。
中间体6：3-氨甲酰基-1H-吲唑-6-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.1H-吲唑-6-羧酸甲酯
将碳酸钠(2.06g，19.4毫摩尔)加入至1H-吲唑-6-羧酸(3.00g，18.5毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(46ml)溶液中并随后逐滴加入碘甲烷(2.75g，1.21ml，19.4毫摩尔)。使混合物于室温下经隔夜搅拌。将混合物倒入半饱和碳酸氢钠溶液中并经乙酸乙酯萃取3次。使结合的有机层经盐水冲洗，置于硫酸钠上干燥并经过滤和真空浓缩以生成褐色油。使该残余物经急骤柱层析(12-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成黄色固体的1H-吲唑-6-羧酸甲酯(2.95g，90％)。1H>3,δ):10.40(br.s.,1H),8.26(s,1H),8.13(s,1H),7.84(d,J＝8.4Hz,1H),7.79(d,J＝8.4Hz,1H),3.96(s,3H)。
步骤2.3-碘-1H-吲唑-6-羧酸甲酯
将氢氧化钾(840mg，3.05毫摩尔)和碘(1.54g，5.9毫摩尔)先后加入至1H-吲唑-6-羧酸甲酯(865mg，4.91毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(12ml)溶液中。使混合物于室温下经搅拌3小时。加入硫酸氢钠(30ml，5％水溶液)并使混合物经乙酸乙酯萃取2次。使结合的有机层经盐水冲洗，置于硫酸钠上干燥并经过滤和真空浓缩。使残余物经急骤柱层析(5-65％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成无色固体的3-碘-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(1.16g，78％)。1H>6,δ):13.84(s,1H),8.13(s,1H),7.72(d,J＝8.4Hz,1H),7.54>
步骤3.3-氰基-1H-吲唑-6-羧酸甲酯
使3-碘-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(3.0g，9.9毫摩尔)、锌粉(400mg，6.11毫摩尔)、氰化锌(2.0g，17.0毫摩尔)、与二氯甲烷络合的[1,1’-双(二苯膦基)二茂铁]-二氯钯(II)(1.15g，1.41毫摩尔)及碘化铜(I)(1.90g，9.97毫摩尔)的混合物于二甲基乙酰胺(55ml)中经氮气清洗15分钟。使混合物于120℃下经搅拌15小时。使反应混合物冷却，经乙酸乙酯(250ml)稀释，经通过硅藻土过滤并经乙酸乙酯(100ml)洗涤。对该滤液加入饱和氯化铵水溶液和浓氢氧化铵的溶液(约400ml；通过将氢氧化铵加入至氯化铵饱和水溶液直至pH 8而制备)。使混合物经搅拌1小时。分离相层。使有机层经水和盐水冲洗，置于硫酸钠上干燥并经过滤和真空浓缩。对残余物加入甲醇(40ml)并使混合物经隔夜搅拌。使混合物经过滤并使固体经真空干燥以生成黄褐色固体的3-氰基-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(1.47g，73％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,δ):13.40(br.s.,1H),8.25(s,1H),7.94(d,J＝8.6Hz,1H),7.83(d,J＝8.4Hz,1H),3.88(s,3H)。
步骤4.3-氨甲酰基-1H-吲唑-6-羧酸
将脲过氧化氢(1.22g，12.6毫摩尔)于氢氧化钠(12.6ml，1M水溶液，12.6毫摩尔)的冷却溶液加入至0℃下3-氰基-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(254mg，1.26毫摩尔)的甲醇(12ml)溶液中。使该黄色溶液于室温下经隔夜搅拌。使混合物经真空浓缩以除去甲醇。使用1N氢氯酸将所生成的残余物的pH调整为约4。生成沉淀物。使混合物经过滤 并使固体经干燥以生成褐色固体的3-氨甲酰基-1H-吲唑-6-羧酸(82mg，32％)。1H>6,δ):13.84(s,1H),13.04(br.s.,1H),8.20(d,J＝8.4Hz,1H),8.13-8.16(m,1H),7.77(br.s.,1H),7.74(dd,J＝8.6,1.4Hz,1H),7.38(br.s.,1H)。
中间体7：3-氨甲酰基-1H-吲哚-6-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.3-氰基-1H-吲哚-6-羧酸乙酯
将乙酸钠(370mg，4.47毫摩尔)和与二氯甲烷络合的[1,1’-双(二苯膦基)二茂铁]二氯钯(II)(242mg，0.297毫摩尔)加入至Parr瓶(500ml)内6-溴-1H-吲哚-3-甲腈(328mg，1.48毫摩尔)的乙醇(5ml)溶液中。使反应容器经氮气清洗并经抽真空3次且随后经填充一氧化碳(30psi)。使反应混合物经加热至70℃并增加容器内压力至45psi。使反应物于70℃下经搅动24小时。使反应混合物冷却至室温。使混合物经通过硅藻土过滤并经乙醇洗涤。使滤液于减压下经浓缩并经二氯甲烷稀释。使残余的固体经过滤并使滤液经浓缩。使残余物经急骤柱层析(20-80％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成3-氰基-1H-吲哚-6-羧酸乙酯(142mg，45％)。-APCI(M-H)213.4；1H>6,δ):12.50(br.s.,1H),8.45(s,1H),8.16(s,1H),7.82(dd,J＝8.4,1.4Hz,1H),7.73(d,J＝8.4Hz,1H),4.32(q,J＝7.0>
步骤2.3-氨甲酰基-1H-吲哚-6-羧酸
将3-氰基-1H-吲哚-6-羧酸乙酯(100mg，1.4毫摩尔)的甲醇(1.12ml)悬浮液加入至0℃下脲过氧化氢(453mg，4.67毫摩尔)的2.5M氢氧化钠(1.12ml，2.80毫摩尔)溶液中。使悬浮液回温至室温并经隔夜搅拌。使反应物经减压下浓缩。加入水并使溶液经3N氢氯酸水溶液酸化至pH 2。生成沉淀物。使反应混合物于室温下经搅拌1分钟并随后经过滤以生成橙色固体。加入额外的脲过氧化氢(453mg)的2.5M氢氧化钠溶液和甲醇并使混合物经搅拌2小时。使反应物经浓缩，经水稀释，酸化至pH 3且经过滤。使固体经水和庚烷冲洗并置于真空烘箱内干燥以生成固体的3-氨甲酰基-1H-吲哚-6-羧酸(66.5mg，70％)。-ESI(M-1)203.1；1H>6,δ):12.45(br.s.,1H),11.78(br.s.,1H),8.83(d,J＝1.6Hz,1H),8.09(d,J＝2.9Hz,1H),7.73(dd,J＝8.6,1.8Hz,1H),7.51(br.s.,1H),7.45(d,J＝8.4Hz,1H),6.89(br.s.,1H)。
中间体8：3-氨甲酰基-1H-吲唑-5-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.3-氰基-1H-吲唑-5-羧酸甲酯
将3-碘-1H-吲唑-5-羧酸甲酯(30.7g，102毫摩尔)、氰化锌(20.3g，173毫摩尔)、锌粉(4.05g，61.9毫摩尔)、与二氯甲烷络合的[1,1’-双(二苯膦基)二茂铁]-二氯钯(II)(12g，15毫摩尔)及碘化铜(I)(19.7g，103毫摩尔)置入圆底烧瓶(1L)中。加入N,N-二甲基乙酰胺(500ml)并使反应混合物经氮气清洗10分钟。使反应物经加热至120℃达1小时。使反应物冷却至室温并经乙酸乙酯(1L)稀释且经搅拌20分钟。使反应混合物经通过硅藻土塞子过滤并经乙酸乙酯(500ml)洗涤。将滤液加入至饱和氯化铵和浓氢氧化铵的溶液(2L)(其是通过将氢氧化铵加入至氯化铵饱和水溶液中直至pH 8加以制备)中并使该两相溶液经激烈搅拌1小时。使所生成的乳化液经过硅藻土小垫过滤。分离相层并使水相经乙酸乙酯(1.1L)多萃取2次，每次皆使所生成的乳化液经过硅藻土过滤。使结合的有机层经水(2×900ml)和盐水(900ml)冲洗，置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。对粗产物加入甲醇(100ml)并使混合物经搅拌20分钟。使所生成的沉淀物经过滤并经甲醇(10ml)冲洗。使滤液经浓缩以生成固体的标题化合物(13.2g，65％)。-ESI(M-H)200.0；1H>6,δ):8.43-8.45(m,1H),8.05(dd,J＝8.8,1.6Hz,1H),7.85(dd,J＝8.9,0.9Hz,1H),3.88(s,3H)。
步骤2.3-氨甲酰基-1H-吲唑-5-羧酸
使3-氰基-1H-吲唑-5-羧酸甲酯(50.0g，249毫摩尔)的甲醇(1L)悬浮液冷却至10℃。逐滴加入脲过氧化氢(241g，2.49摩尔)的氢氧化钠溶液(1L，2.5N)和水(100ml)并维持内部温度低于25℃。当加入完成时，除去冰浴并使反应物于室温下经搅拌16小时。通过HPLC观察少量未反应的起始物。使反应物冷却至15℃并分批加入额外的脲过氧化氢(50g)。注意到激烈的冒泡现象。使反应物再经搅拌2小时。使粗反应物经过滤以除去存在的固体并使滤液经浓缩以除去甲醇。使残余的溶液经冰浴冷却并逐滴加入6N氢氯酸(420ml)以调整pH至4。 使溶液经搅拌20分钟并通过过滤以收集所生成的黄褐色固体且经干燥以生成粗产物(57.2g)。对该粗产物加入乙腈(700ml)和二氯甲烷(700ml)并使混合物于室温下经搅拌1小时。通过过滤以收集固体并经乙腈:二氯甲烷(1：1，400ml)冲洗且经干燥以生成黄褐色固体的标题化合物(39.5g，77％)。+ESI(M+H)206.1；1H>6,δ):13.81(s,1H),12.85(br.s.,1H),8.82(d,J＝0.8Hz,1H),7.93(dd,J＝8.8,1.6Hz,1H),7.79-7.85(m,1H),7.64(d,J＝8.6Hz,1H),7.44(s,1H)。
中间体9：3-氨甲酰基-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸苄酯
将碳酸铯(2.79g，8.56毫摩尔)和苄基溴(1.05ml，8.64毫摩尔)加入至1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸(1.37g，8.45毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(55ml)溶液中。使反应物于室温下经搅拌17小时。加入额外的碳酸铯(500mg，1.54毫摩尔)和苄基溴(0.186ml，1.53毫摩尔)并使反应物再经搅拌4小时。使反应物经水骤冷并经乙酸乙酯稀释。分离相层并使水层经乙酸乙酯萃取3次。使结合的有机相经水和盐水冲洗，置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。通过急骤柱层析 (0-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成标题化合物(1.42g，67％)。+ESI(M+H)253.3；1H>6,δ):11.68(br.s.,1H),8.93(d,J＝2.0Hz,1H),8.33(dd,J＝2.0,1.0Hz,1H),7.93(t,J＝3.0Hz,1H),7.51(m,2H),7.41(m,3H),6.68(ddd,J＝3.1,2.0,1.0Hz,1H),5.40(s,2H)。
步骤2.3-溴-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸苄酯
将N-溴琥珀酰亚胺(609mg，3.42毫摩尔)加入至1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸苄酯(830mg，3.29毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(19ml)的0℃溶液中。使反应物缓慢回温至室温并于周末期间经搅拌。使反应物经乙酸乙酯稀释并连续经饱和硫代硫酸钠水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、水及盐水冲洗。使有机相置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩以生成标题化合物(1.08g，定量)。+ESI(M+1+H)333.0；1H>6,δ):12.06(br.s.,1H),8.99(d,J＝1.8Hz,1H),8.37(d,J＝2.0Hz,1H),8.14(d,J＝2.9Hz,1H),7.52(m,2H),7.41(m,3H),5.41(s,2H)。
步骤3.3-氨甲酰基-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸
通过类似于制备中间体6的步骤3至4所描述的方法，使用3-溴-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸苄酯，制备标题化合物。+ESI(M+H)206.2；1H>6,δ):12.76(br.s.,1H),8.92(d,J＝1.6Hz,1H),8.54-8.64(m,2H),8.17(br.s.,1H),7.51(br.s.,1H)。
中间体10：3-氨甲酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-羧酸(如下式所示)经下述方法制备：
步骤1.3-碘-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-羧酸甲酯
将碳酸钾(5.79g，41.9毫摩尔)加入至1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-羧酸甲酯(2.97g，14.0毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液中。随后逐滴加入碘(3.90g，15.4毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(5.0ml)溶液并使反应物于室温下经搅拌2小时。将水(150ml)加入反应混合物中，导致生成沉淀物。缓慢加入亚硫酸氢钠(5.79g，41.9毫摩尔)的水(50ml)溶液并使混合物经搅拌1小时。使所生成的固体经过滤并经真空干燥以生成标题化合物(3.07g，73％)。+ESI(M+H)303.0；1H>6,δ):12.53(br.s.,1H),8.79(d,J＝2.0Hz,1H),8.15(d,J＝2.0Hz,1H),7.86(s,1H),3.88(s,3H)。
步骤2.3-碘-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-1,5-二羧酸(1-叔丁酯)(5-甲酯)
将N,N-二异丙基乙胺(1.21ml，6.95毫摩尔)、二碳酸二(叔丁酯)(607mg，2.78毫摩尔)及4-二甲氨基吡啶(28mg，23毫摩尔)加入至3-碘-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-羧酸甲酯(700mg，2.32毫摩尔)的二氯甲烷(10ml)和四氢呋喃(10ml)的混合物中。使反应物于室温下经搅拌16小时。使反应物经浓缩及急骤柱层析(0-50％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成固体的标题化合物(760mg，82％)。+APCI(M+H)403.3；>1H>6,δ):8.93(d,J＝2.0Hz,1H),8.16(d,J＝2.0Hz,1H),8.14(s,1H),3.91(s,3H),1.59(s,9H)。
步骤3.3-氨甲酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-羧酸
通过类似于制备中间体6的步骤3至4所描述的方法，使用3-碘-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-1,5-二羧酸(1-叔丁酯)(5-甲酯)，制备标题化合物。-APCI(M-H)204.4。
中间体11：2-氨甲酰基-1H-吲哚-5-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.2-氨甲酰基-1H-吲哚-5-羧酸甲酯
将1,1-羰基二咪唑(3.70g，22.8毫摩尔)加入至5-(甲氧羰基)-1H-吲哚-2-羧酸(2.50g，11.4毫摩尔)的四氢呋喃(20ml)溶液中。使黄色悬浮液经搅拌2小时。随后加入浓氢氧化铵(20ml)并使混合物于室温下经搅拌5小时。使淡绿色悬浮液经过滤，经水和甲醇(5ml)冲洗且经空气干燥以生成无色固体的2-氨甲酰基-1H-吲哚-5-羧酸甲酯(2.04g，82％)。1H>6,δ):11.93(br.s.,1H),8.32(d,J＝1.2Hz,1H),8.06(br.s.,1H),7.79(dd,J＝8.6,1.6Hz,1H),7.48(d,J＝8.6Hz,1H),7.45(br.s.,1H),7.27(s,1H),3.32(s,3H)。
步骤2.2-氨甲酰基-1H-吲哚-5-羧酸
将氢氧化钾(3.16g，56.4毫摩尔)加入至2-氨甲酰基-1H-吲哚-5-羧酸甲酯(300mg，1.38毫摩尔)的四氢呋喃(4.5ml)和乙二醇(4.5ml)的悬浮液中。使混合物经加热至回流状态并经搅拌2小时。使反应物冷却至室温并经水稀释。于减压下除去四氢呋喃。过滤固体并通过浓氢氯酸使滤液酸化至pH 4。通过过滤以收集所生成的沉淀物并经真空干燥以生成2-氨甲酰基-1H-吲哚-5-羧酸(230mg，82％)。1H>6,δ):12.53(br.s.,1H),11.88(br.s.,1H),8.28(s,1H),8.04(br.s.,1H),7.77(d,J＝8.6Hz,1H),7.46(m,J＝8.6Hz,2H),7.25(s,1H)。
中间体12：3-氨甲酰基-1H-吲哚-5-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.3-氰基-1H-吲哚-5-羧酸乙酯
将乙酸钠(2.90g，35.6毫摩尔)和1,1’-双(二苯膦基)二茂铁-二氯化钯(II)/二氯甲烷络合物(1.93g，2.36毫摩尔)加入至Parr瓶(500ml)内5-溴-1H-吲哚-3-甲腈(2.61g，11.8毫摩尔)的乙醇(50ml)溶液中。对反应混合物抽真空并经回填氮气3次。使反应容器经一氧化碳(25psi)加压。使反应物经加热至70℃且当达到所期望的温度时，使反应容器内压力增加至40psi。使反应物于70℃下经搅动24小时。使混合物经通过硅藻土过滤并经乙醇洗涤。使滤液于减压下经浓缩并随后经二氯甲烷稀释。使混合物经过滤以除去不溶的固体。使滤液经浓缩及急骤柱层析(20-80％乙酸乙酯/庚烷)纯化。使所生成的固体经二氯甲烷和少量的庚烷研磨以生成3-氰基-1H-吲哚-5-羧酸乙酯(1.05g，41％)。1H>6,δ):12.54(br.s.,1H),8.41(d,J＝2.7Hz,1H),8.25(d,J＝1.6Hz,1H),7.89(dd,J＝8.6,1.6Hz,1H),7.66(dd,J＝8.6,0.6Hz,1H),4.34(q,J＝7.0Hz,2H),1.35(t,J＝7.1Hz,3H)。
步骤2.3-氨甲酰基-1H-吲哚-5-羧酸
将3-氰基-1H-吲哚-5-羧酸乙酯(1.05g，4.89毫摩尔)的甲醇(12ml)溶液加入至0℃下脲过氧化氢(4.74g，48.9毫摩尔)和氢氧化钠(11.7ml，2.5M水溶液,29.3毫摩尔)的溶液中。使混合物回温至室温并经隔夜搅拌。加入额外的2.5M氢氧化钠溶液(2ml)并使反应物经搅拌4小时。使混合物经浓缩并通过6M氢氯酸酸化至pH 2。使所生 成的沉淀物经过滤并于60℃下经真空干燥以生成标题化合物(915mg，92％)。1H>6,δ):12.46(br.s.,1H),11.84(s,1H),8.85(s,1H),8.12(d,J＝2.5Hz,1H),7.75(dd,J＝8.6,1.6Hz,1H),7.50-7.63(m,1H),7.47(d,J＝8.6Hz,1H),6.88(br.s.,1H)。
中间体13：2-氨甲酰基-1H-吲哚-6-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.2-氨甲酰基-1H-吲哚-6-羧酸乙酯
通过类似于制备中间体12的步骤1所描述的方法，使用6-溴-1H-吲哚-2-甲酰胺，制备标题化合物。+ESI(M+H)233.2；1H>6,δ):11.92(s,1H),8.07(s,2H),7.65-7.71(m,1H),7.57-7.63(m,1H),7.49(br.s.,1H),7.17(dd,J＝2.1,1.0Hz,1H),4.30(q,J＝7.1Hz,2H),1.31(t,J＝7.1Hz,3H)。
步骤2.2-氨甲酰基-1H-吲哚-6-羧酸
将1N氢氧化钠水溶液(71ml，71毫摩尔)加入至2-氨甲酰基-1H-吲哚-6-羧酸乙酯(3.3g，14毫摩尔)的甲醇(50ml)溶液中。使反应物于室温下经搅拌17小时。随后通过6N氢氯酸水溶液使反应物酸化至pH 2-3。通过过滤以收集所生成的沉淀物并经真空干燥以生成标题化合物(2.97g，100％)。-APCI(M-H)203.4。
中间体14：2-氨基-1H-苯并[d]咪唑-5-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
将溴化氰溶液(5.0ml，5M乙腈溶液,25毫摩尔)加入至3,4-二氨基苯甲酸甲酯(3.0g，18毫摩尔)的水(50ml)溶液中。使反应物于室温下经隔夜搅拌。将氨水(20ml)和乙酸乙酯(100ml)加入至反应混合物中并分离相层。使有机相置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。对粗残余物加入2N氢氯酸水溶液(18ml，36.0毫摩尔)并使混合物于回流下经隔夜加热。使反应物经浓缩以生成标题化合物(2.90g，97％)。>1H>6,δ):8.75(s,2H),7.84(s,1H),7.77(dd,J＝1.2Hz,J＝8.4Hz,1H),7.38(d,J＝8.4Hz,1H)。
中间体15：3-(甲基氨甲酰基)-1H-吲唑-5-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.5-溴-N-甲基-1H-吲唑-3-甲酰胺
将甲胺(5ml，2M四氢呋喃溶液，10毫摩尔)、(1,3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二酰亚胺氢氯化物(1.4g，7.5毫摩尔)、1-羟基苯并三唑水合物(1.2g，7.5毫摩尔)及N-甲基吗啉(1.0g，10毫摩尔)加入至5-溴-1H-吲唑-3-羧酸(1.2g，5.0毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(20ml)溶液中。使反应物于室温下经隔夜搅拌。使反应物经浓缩和急骤柱层析纯化以生成无色固体的标题化合物(0.71g，56％)。1H>6,δ):13.8(br.s.,1H),8.41(m,1H),8.31(s,1H),7.60(d,J＝8.8Hz,1H),7.51-7.54(m,1H),2.80(d,J＝4.8Hz,3H)。
步骤2.3-(甲基氨甲酰基)-1H-吲唑-5-羧酸甲酯
将1,1’-双(二苯膦基)二茂铁-二氯化钯(II)/二氯甲烷络合物(400mg，0.56毫摩尔)和N-甲基吗啉(565mg，5.60毫摩尔)加入至5-溴-N-甲基-1H-吲唑-3-甲酰胺(710mg，2.8毫摩尔)的无水甲醇(20ml)溶液中。对反应容器抽真空并回填氮气3次。随后对该反应容器填充一氧化碳(30psi)。使反应混合物经加热至70℃使该反应容器内压力增加至45psi。使反应物于70℃下经搅动24小时。使反应混合物冷却至室温并经通过硅藻土过滤且经甲醇洗涤。使滤液经浓缩和急骤柱层析纯化以生成褐色固体的标题化合物(410mg，61％)。1H>
步骤3.3-(甲基氨甲酰基)-1H-吲唑-5-羧酸
将氢氧化锂单水合物(0.36g，8.5毫摩尔)加入至3-(甲基氨甲酰基)-1H-吲唑-5-羧酸甲酯(400mg，1.7毫摩尔)的甲醇(10ml)和水(10ml)溶液中。使反应物经加热至60℃并经隔夜搅拌。于减压下除去甲醇并通过1N氢氯酸水溶液使残余物酸化至pH 4。通过过滤以收集所生成的沉淀物并经真空干燥以生成黄色固体的标题化合物(350mg，94％)。1H>6,δ):13.99(s,1H),8.85(s,1H),8.47-8.48(m,1H),7.94-7.96(m,1H),7.65-7.68(m,1H),2.82(d,J＝4.4Hz,3H)。
中间体16：3-(乙基氨甲酰基)-1H-吲唑-5-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.5-溴-N-乙基-1H-吲唑-3-甲酰胺
将草酰氯(1.26g，10毫摩尔)和N,N-二甲基甲酰胺(1滴)加入至5-溴-1H-吲唑-3-羧酸(1.2g，5.0毫摩尔)的二氯甲烷(20ml)溶液中。使混合物于室温和氮气下经隔夜搅拌。使反应物经浓缩并使残余物溶解于二氯甲烷(20ml)中。逐滴加入乙胺(1.1g，25毫摩尔)。使反应物于室温下经搅拌4小时。使反应混合物经浓缩以生成标题化合物(1.27g)。+ESI(M+H+1)270.9。
步骤2.3-(乙基氨甲酰基)-1H-吲唑-5-羧酸乙酯
将三乙胺(1.24g，12.3毫摩尔)和1,1’-双(二苯膦基)二茂铁-二氯化钯(II)/二氯甲烷络合物(300mg，0.41毫摩尔)加入至5-溴-N-乙基-1H-吲唑-3-甲酰胺(1.1g，4.1毫摩尔)的乙醇(50ml)溶液中。对反应容器抽真空并回填氮气3次。对该反应容器填充一氧化碳(50psi)并经加热至80℃且经搅动24小时。使反应物冷却至室温并经硅藻土过滤。浓缩滤液至褐色残余物。使该残余物经乙酸乙酯(100ml)稀释并连续经1N氢氯酸、饱和碳酸氢钠水溶液及盐水冲洗。使有机相置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩以生成褐色固体的标题化合物(0.88g，82％)。1H>6,δ):13.87(s,1H),8.88(s,1H),8.54-8.57(m,1H),7.96-7.98(m,1H),7.68-7.70(m,1H),4.32-4.37(m,2H),3.33-3.37(m,2H),1.35(t,3H),1.22(t,3H)。
步骤3.3-(乙基氨甲酰基)-1H-吲唑-5-羧酸
通过类似于制备中间体15的步骤3所描述的方法，制备标题化合物。1H>6,δ):13.83(s,1H),12.91(br.s.,1H),8.86(s,1H),8.51-8.54(m,1H),7.95-7.97(m,1H),7.65-7.68(m,1H),3.30-3.36(m,2H),1.12-1.16(t,3H)。
中间体17：3-(2,2,2-三氟乙基氨甲酰基)-1H-吲唑-5-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
通过类似于制备中间体16所描述的方法，于步骤1中使用2,2,2-三氟乙胺，制备标题化合物。1H>6,δ):14.04(s,1H),13.0(br.s.,1H),9.12-9.15(m,1H),8.83(s,1H),7.97-7.99(m,1H),7.69-7.72(m,1H),4.04-4.13(m,2H)。
中间体18：2-(甲基氨基)-1H-苯并[d]咪唑-5-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.2-(甲基氨基)-1H-苯并[d]咪唑-5-羧酸甲酯
使3,4-二氨基苯甲酸(15g，0.09摩尔)与异硫氰基甲烷(6.6g，0.09摩尔)的混合物溶解于四氢呋喃(90ml)中。使反应物于回流下经加热3小时并随后经浓缩。将残余物倒入冰水中。使所生成的沉淀物经过滤，经水冲洗且经真空干燥以生成4-氨基-3-(3-甲基硫脲基)苯甲酸甲酯(12.0g，56％)。
对该固体(12g，0.05摩尔)先后加入乙醇(200ml)和甲基碘(35.5g，0.25摩尔)。使反应物经加热至回流状态并经隔夜搅拌。使反应物经浓缩并通过氢氧化铵使残余物碱化。通过过滤以收集固体并经水冲 洗。柱层析(9-25％乙酸乙酯/石油醚)纯化生成黄色固体的标题化合物(2.9g，28％)。1H>3,δ):8.37(s,1H),7.92-7.96(m,1H),7.51(d,J＝8.4Hz,1H),3.93(s,3H),2.81(s,3H)。
步骤2.2-(甲基氨基)-1H-苯并[d]咪唑-5-羧酸
将3N氢氯酸水溶液(14ml，42毫摩尔)加入至2-(甲基氨基)-1H-苯并[d]咪唑-5-羧酸甲酯(2.9g，14毫摩尔)并使反应物于回流下经隔夜搅拌。使反应物经浓缩以生成黄色固体的标题化合物(2.4g，90％)。1H>3OD,δ):7.96-8.00(m,2H),7.40(d,J＝8.4Hz,1H),3.10(s,3H)。
中间体19：3-氰基-1H-吲唑-6-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.1H-吲唑-6-羧酸甲酯
将碳酸钠(2.06g，19.4毫摩尔)加入至1H-吲唑-6-羧酸(3.00g，18.5毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(46ml)溶液中并随后逐滴加入碘甲烷(2.75g，1.21ml，19.4毫摩尔)。使混合物于室温下经隔夜搅拌。将混合物倒入至半饱和碳酸氢钠溶液中并经乙酸乙酯萃取3次。使结合的有机层经盐水冲洗，置于硫酸钠上干燥且经过滤和真空浓缩以生成褐色油。使该残余物经急骤柱层析(12-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化以 生成黄色固体的1H-吲唑-6-羧酸甲酯(2.95g，90％)。1H>3,δ):10.40(br.s.,1H),8.26(s,1H),8.13(s,1H),7.84(d,J＝8.4Hz,1H),7.79(d,J＝8.4Hz,1H),3.96(s,3H)。
步骤2.3-碘-1H-吲唑-6-羧酸甲酯
先后将氢氧化钾(840mg，3.05毫摩尔)和碘(1.54g，5.9毫摩尔)加入至1H-吲唑-6-羧酸甲酯(865mg，4.91毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(12ml)溶液中。使混合物于室温下经搅拌3小时。加入硫酸氢钠(30ml，5％水溶液)并使混合物经乙酸乙酯萃取2次。使结合的有机层经盐水冲洗，置于硫酸钠上干燥且经过滤和真空浓缩。使残余物经急骤柱层析(5-65％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成无色固体的3-碘-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(1.16g，78％)。1H>6,δ):13.84(s,1H),8.13(s,1H),7.72(d,J＝8.4Hz,1H),7.54(d,J＝8.6Hz,1H),3.87(s,3H)。
步骤3.3-氰基-1H-吲唑-6-羧酸甲酯
使3-碘-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(3.0g，9.9毫摩尔)、锌粉(400mg，6.11毫摩尔)、氰化锌(2.0g，17.0毫摩尔)、与二氯甲烷络合的[1,1’ -双(二苯膦基)二茂铁]-二氯钯(II)(1.15g，1.41毫摩尔)及碘化铜(I)(1.90g，9.97毫摩尔)的混合物于二甲基乙酰胺(55ml)中经氮气清洗15分钟。使混合物于120℃下经搅拌15小时。使反应混合物冷却，经乙酸乙酯(250ml)稀释，经通过硅藻土过滤且经乙酸乙酯(100ml)洗涤。对滤液加入饱和氯化铵水溶液和浓氢氧化铵的溶液(约400ml；通过将氢氧化铵加入至饱和氯化铵水溶液直至pH 8而加以制备)。使混合物经搅拌1小时。随后分离相层。使有机层经水和盐水冲洗，置于硫酸钠上干燥且经过滤和真空浓缩。对残余物加入甲醇(40ml)并使混合物经隔夜搅拌。使混合物经过滤并使固体经真空干燥以生成黄褐色固体的3-氰基-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(1.47g，73％)。1H>6,δ):13.40(br.s.,1H),8.25(s,1H),7.94(d,J＝8.6Hz,1H),7.83(d,J＝8.4Hz,1H),3.88(s,3H)。
步骤4.3-氰基-1H-吲唑-6-羧酸
将2N氢氧化锂水溶液(16ml，32毫摩尔)加入至3-氰基-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(1.47g，7.31毫摩尔)的甲醇(36ml)和四氢呋喃(20ml)溶液中。使反应物经加热至50℃达72小时。使反应物冷却至室温并经浓缩。使残余物经水稀释并通过1N氢氯酸水溶液调整pH至4。使所生成的沉淀物经过滤，经水洗涤且经真空干燥以生成黄褐色固体的标题化合物(500mg，37％)。+ESI(M+H)188.2。
中间体20：3-氯-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.3-氯-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸甲酯
将N-氯琥珀酰亚胺(895mg，5.96毫摩尔)加入至1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸甲酯(1.00g，5.68毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(15ml)的0℃溶液中。使反应物缓慢回温至室温并经隔夜搅拌。使反应物经水(125ml)稀释并经搅拌20分钟。通过过滤以收集所生成的固体，经水冲洗且经真空干燥以生成橙色粉末的标题化合物(1.11g，93％)。+ESI(M+H)211.0；1H>6,δ):11.99(br.s.,1H),8.92(d,J＝2.0Hz,1H),8.31(d,J＝1.8Hz,1H),8.08(d,J＝3.1Hz,1H),3.88(s,3H)。
步骤2.3-氯-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸
使3-氯-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸甲酯(1.10g，5.22毫摩尔)悬浮于1,4-二
中间体21：3-氰基-1H-吲唑-5-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
使3-氰基-1H-吲唑-5-羧酸甲酯(500mg，2.5毫摩尔)溶解于甲醇(12ml)中并加入2N氢氧化锂水溶液(3.7ml，7毫摩尔)。使反应物 于室温下经隔夜搅拌。使反应混合物经浓缩以除去甲醇并通过1N氢氯酸水溶液使残余物酸化至pH 4。通过过滤以收集所生成的黄色沉淀物，经水冲洗且置于真空烘箱中干燥以生成标题化合物(445mg，96％)。-ESI(M-H)186.4；1H>6,δ):13.17(br.s.,1H),8.42(s,1H),8.05(dd,J＝8.8,1.6Hz,1H),7.83(d,1H)。
中间体22：6-(2-叔丁氧基-2-氧代乙氧基)喹啉-3-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.2-氯-6-羟基喹啉-3-醛
将三溴化硼(4.0ml，42毫摩尔)加入至2-氯-6-甲氧基喹啉-3-醛(4.64g，20.9毫摩尔)的二氯甲烷(130ml)的-78℃混合物中。使混合物回温至室温并经搅拌4小时。小心地加入饱和碳酸氢钠水溶液以中和反应物。使混合物经2-甲基四氢呋喃萃取(3x)。使结合的有机相经过滤并使滤液经饱和碳酸氢钠水溶液冲洗(3x)及盐水冲洗(1x)。使有机相置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩成黄色固体。使该固体部分溶解于2-甲基四氢呋喃中且经过滤。使滤液浓缩成固体并再次部分溶解于2-甲基四氢呋喃中且经过滤和浓缩。急骤柱层析(10-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化生成淡黄色固体的标题化合物(2.65g，61％)。+ESI(M+H)208.1；1H>3,δ):10.54(s,1H),8.59(s,1H),7.98(d,J＝9.17Hz,1H),7.47(dd,J＝9.17,2.73Hz,1H),7.25(d,J＝2.93Hz,1H),5.57(br.s.,1H)。
步骤2.2-(2-氯-3-甲酰基喹啉-6-基氧)乙酸叔丁酯
将2-溴乙酸叔丁酯(2.0ml，13.6毫摩尔)和碳酸钾(3.13g，22.6毫摩尔)加入至2-氯-6-羟基喹啉-3-醛(2.35g，11.3毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(15ml)溶液中。使反应物于室温下经搅拌1.5小时。使反应物经水(100ml)稀释并经搅拌1小时。通过过滤以收集所生成的固体，经水冲洗且经真空干燥以生成灰白色固体的标题化合物(3.62g，99％)。+ESI(M+H)322.1；1H>3,δ):10.54(s,1H),8.60(s,1H),7.99(d,J＝9.36Hz,1H),7.59(dd,J＝9.17,2.93Hz,1H),7.11(d,J＝2.73Hz,1H),4.65(s,2H),1.49(s,9H)。
步骤3.6-(2-叔丁氧基-2-氧代乙氧基)-2-氯喹啉-3-羧酸
将2-甲基-2-丁烯(14.9ml，133毫摩尔)及亚氯酸钠(8.27g，73.1毫摩尔)和磷酸二氢钠(8.10g，58.7毫摩尔)的水(50ml)溶液加入至2-(2-氯-3-甲酰基喹啉-6-基氧)乙酸叔丁酯(3.6g，11毫摩尔)的叔丁醇(150ml)悬浮液中。使反应物于室温下经搅拌1小时。真空下除去叔丁醇。使混合物经水(60ml)稀释并通过1N氢氯酸水溶液酸化至pH 4。使所生成的沉淀物经过滤，经水冲洗且经真空干燥以生成白色固体的标题化合物(3.7g，100％)。+ESI(M+H)338.1；1H>3OD,δ):8.69(s,1H),7.89(d,J＝9.19Hz,1H),7.56(dd,>
步骤4.6-(2-叔丁氧基-2-氧代乙氧基)喹啉-3-羧酸
将甲醇(100ml)和三乙胺(4.5ml，33毫摩尔)加入至6-(2-叔丁氧基-2-氧代乙氧基)-2-氯喹啉-3-羧酸(1.27g，3.76毫摩尔)。加入10％Pd/C(350mg)并加压反应物至17psi氢。使反应物于室温下经搅动3小时。使反应混合物经甲醇稀释并经通过硅藻土过滤。使滤液浓缩成黄色固体。使该固体经水稀释并通过1N氢氯酸水溶液使混合物酸化至pH 4。通过过滤以收集固体，经水冲洗且经真空干燥以生成淡黄色固体的标题化合物(960mg，84％)。+ESI(M+H)304.2；1H>3OD,δ):9.19(d,J＝2.15Hz,1H),8.87(d,J＝2.15Hz,1H),8.01(d,J＝9.36Hz,1H),7.59(dd,J＝9.27,2.83Hz,1H),7.38(d,J＝2.73Hz,1H),4.78(s,2H),1.49(s,9H)。
中间体23：6-氨甲酰基喹啉-3-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.6-溴喹啉-3-羧酸乙酯
将氯化锡(II)二水合物(7.95g，35.2毫摩尔)和3,3-二乙氧基丙酸乙酯(4.2ml，22毫摩尔)加入至5-溴-2-硝基苯甲醛(2g，9毫摩尔)的乙醇(46ml)溶液中。使反应物经加热至90℃达16小时。随后 使反应物冷却至室温并经隔夜搅拌。使反应混合物经浓缩并使残余物溶解于乙酸乙酯。将混合物倒入饱和碳酸氢钠水溶液中。使所生成的乳化液经通过硅藻土过滤并经乙酸乙酯洗涤。分离相层并使水层经乙酸乙酯萃取。使结合的有机相经盐水冲洗，置于硫酸镁上干燥且经过滤和浓缩。通过急骤柱层析(0-50％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成固体的标题化合物(1.41g，60％)。
步骤2.6-氨甲酰基喹啉-3-羧酸
通过类似于制备中间体6的步骤3至4所描述的方法，使用6-溴喹啉-3-羧酸乙酯，制备标题化合物。+ESI(M+H)217.0；1H>6,δ):13.58(br.s.,1H),9.34(d,J＝2.1Hz,1H),8.97(d,J＝2.1Hz,1H),8.67(d,J＝2.0Hz,1H),8.25-8.31(m,1H),8.20(br.s.,1H),8.09-8.14(m,1H),7.61(br.s.,1H)。
中间体24：7-溴-6-甲氧基喹啉-3-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.1-溴-2-甲氧基-4-甲基-5-硝基苯
将N-溴琥珀酰亚胺(8.52g，47.9毫摩尔)加入至4-甲氧基-2-甲基-1-硝基苯(2.0g，12毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液中。使反应物经加热至100℃达1.5小时。使反应物冷却至室温并经饱和 硫代硫酸钠水溶液稀释。使混合物经乙酸乙酯萃取(3x)。使结合的有机相经水、饱和硫代硫酸钠溶液及盐水冲洗，置于硫酸钠上干燥且经过滤和浓缩。使残余物经急骤柱层析(0-30％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成淡黄色固体的标题化合物(2.6g，约43％纯度)。1H>3,δ):8.32(s,1H),6.74(s,1H),3.97(s,3H),2.63(s,3H)。
步骤2.4-溴-5-甲氧基-2-硝基苯甲醛
使粗1-溴-2-甲氧基-4-甲基-5-硝基苯(2.6g，11毫摩尔)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(15ml)中并加入N,N-二甲基甲酰胺二甲缩醛(5ml，38毫摩尔)。使反应物经加热至120℃达18小时。使反应物冷却至室温并直接将混合物加入至过碘酸钠(12.2g，57.2毫摩尔)的水(20ml)和N,N-二甲基甲酰胺(5ml)的0℃悬浮液中。使反应物于0℃下经搅拌2小时并随后回温至室温且再经搅拌6小时。使反应混合物经过滤并经乙酸乙酯、甲苯及水洗涤。使滤液经乙酸乙酯萃取(3x)。使结合的有机相经水和盐水冲洗，置于硫酸钠上干燥且经过滤和浓缩。通过急骤柱层析(0-50％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成淡黄色固体的标题化合物(550mg，19％)。1H>3,δ):10.47(s,1H),8.41(s,1H),7.35(s,1H),4.05(s,3H)。
步骤3.7-溴-6-甲氧基喹啉-3-羧酸乙酯
将氯化锡(II)二水合物(1.65g，7.31毫摩尔)和3,3-二乙氧基丙酸乙酯(1.0ml，5.1毫摩尔)加入至4-溴-5-甲氧基-2-硝基苯甲醛(475mg，1.83毫摩尔)的乙醇(15ml)悬浮液中。使反应物经加热至90℃达3小时。LCMS显示反应未完全。加入额外的氯化锡(II)二水合物(600mg，2.7毫摩尔)和3,3-二乙氧基丙酸乙酯(0.35ml，1.8毫摩尔)并使反应物经隔夜加热。LCMS显示该反应未完全。加入氯化锡(II)二水合物(200mg，0.89毫摩尔)和3,3-二乙氧基丙酸乙酯(0.10ml，0.51毫摩尔)并使反应物于90℃下再经加热3小时。使反应物经浓缩并使残余物分布于乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液中。使水层经过滤并再次经乙酸乙酯萃取。使结合的有机相经盐水冲洗，置于硫酸钠上干燥且经过滤和浓缩。使残余物经急骤柱层析(0-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成黄色固体(410mg)，其含有所期望的产物和杂质。将该固体溶解于四氢呋喃(5ml)中并加入3,3-二乙氧基丙酸乙酯(0.17ml，0.87毫摩尔)和对甲苯磺酸单水合物(12.0mg，0.63毫摩尔)。使混合物经加热至75℃并经搅拌3小时。使反应物经浓缩并使残余物分布于乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液中。分离相层并使水层经乙酸乙酯萃取(2x)。使结合的有机相经盐水冲洗，置于硫酸钠上干燥且经过滤和浓缩。通过急骤柱层析(0-25％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成黄色固体的标题化合物(256mg，45％)。+ESI(M+H+1)313.3。
步骤4.7-溴-6-甲氧基喹啉-3-羧酸
将1N氢氧化锂水溶液(1.6ml，1.6毫摩尔)加入至7-溴-6-甲氧基喹啉-3-羧酸乙酯(250mg，0.80毫摩尔)的四氢呋喃(5ml)溶液中。使反应物于室温下经隔夜搅拌。使反应物经浓缩并将残余物溶解于水和1N氢氧化锂水溶液(0.4ml)中。使溶液经乙酸乙酯萃取2次。通过1N氢氯酸水溶液使水层酸化至pH 4。使所生成的沉淀物经过滤，经水冲洗且经真空干燥以生成灰白色固体的标题化合物(165mg，73％)。+ESI(M+H+1)284.1；1H>3OD,δ):9.19(d,J＝2.15>
中间体25：2-(叔丁基氨基)喹啉-7-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.7-(乙氧羰基)喹啉1-氧化物
将过乙酸(2.13ml，10.1毫摩尔，32重量％乙酸溶液)加入至喹啉-7-羧酸乙酯(1.02g，5.05毫摩尔)的二氯甲烷(20ml)溶液中。使反应物于室温下经隔夜搅拌。使反应物分布于水和二氯甲烷中。分离相层并使水层经二氯甲烷萃取(4x)。使结合的有机相经水和盐水冲洗，置于硫酸钠上干燥且经过滤和浓缩。使固体经庚烷和乙酸乙酯浓缩数次并随后经真空干燥以生成黄色固体的标题化合物(1.01g，92％)。+ESI(M+H)218.2；1H>3,δ):9.40(s,1H),8.65(d,J＝6.05Hz,1H),8.27(dd,J＝8.58,1.56Hz,1H),7.95(d,J＝8.39Hz,1H),7.82(d,J＝8.58Hz,1H),7.42(dd,J＝8.49,6.15Hz,1H),4.47(q,J＝7.02Hz,2H),1.45(t,J＝7.1Hz,3H)。
步骤2.2-(叔丁基氨基)喹啉-7-羧酸
将对甲苯磺酸酐(1.96g，5.76毫摩尔)分批加入至7-(乙氧羰基)喹啉1-氧化物(500mg，2.3毫摩尔)和叔丁胺(1.46ml，13.8毫摩尔) 的三氟甲基苯(25ml)的0℃溶液中，并维持内部反应温度低于5℃。使反应物经搅拌1小时。加入饱和碳酸氢钠水溶液并使反应混合物经搅拌15分钟。分离相层并使水层经二氯甲烷萃取(2x)。使结合的有机相经盐水冲洗，置于硫酸镁上干燥且经过滤和浓缩。经急骤柱层析纯化生成澄清油(499mg)，其是经静置固化。将该产物溶解于四氢呋喃(5ml)中并加入1N氢氧化锂水溶液(3.6ml，3.6毫摩尔)。使反应物于室温下经隔夜搅拌。使反应物经浓缩并使残余物经水稀释且通过1N氢氯酸水溶液酸化至pH 4。使所生成的沉淀物经过滤并经真空干燥以生成淡黄色粉末的标题化合物(330mg，75％)。-ESI(M-H)243.1；>1H>6,δ):12.86(br.s.,1H),8.02(d,J＝1.56Hz,1H),7.81(d,J＝9.03Hz,1H),7.57-7.65(m,2H),6.83(d,J＝8.97Hz,1H),6.81(br.s.,1H),1.46(s,9H)。
中间体26：2-(甲基氨基)喹啉-7-羧酸(如下式所示)是经下述方法制备：
步骤1.2-(甲基氨基)喹啉-7-羧酸乙酯
于氮气下将三氟甲烷磺酸酐(1.43ml，8.47毫摩尔)逐滴加入至7-(乙氧羰基)喹啉1-氧化物(1.67g，7.70毫摩尔)的二氯甲烷(80ml)的-70℃溶液中。使混合物于-70℃下经搅拌5分钟。随后于-70℃下逐滴加入甲胺的四氢呋喃溶液(21ml，42毫摩尔，2.0M)。使混合物经搅拌5分钟并随后使反应物经水(20ml)骤冷。分离相层并使水层经二 氯甲烷(3×30ml)萃取。使结合的有机相经盐水冲洗，置于硫酸钠上干燥且经过滤和浓缩。经急骤柱层析纯化生成黄色固体的标题化合物(720mg，41％)。1H>3,δ):8.42(s,1H),7.84-7.82(m,2H),7.63-7.61(m,1H),6.72-6.70(m,1H),4.92(br.s.,1H),4.44-4.38(m,2H),3.12-3.11(m,3H),1.44-1.40(m,3H)。
步骤2.2-(甲基氨基)喹啉-7-羧酸
通过类似于制备中间体13的步骤2所描述的方法，使用2-(甲基氨基)喹啉-7-羧酸乙酯，制备标题化合物。1H>
实施例1：6-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲哚-3-甲酰胺
使3-氨甲酰基-1H-吲哚-6-羧酸(25mg，0.12毫摩尔)、1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮(38mg，0.13毫摩尔)、六氟磷酸(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(46mg，0.12毫摩尔)及二异丙基乙胺(85μl，0.49毫摩尔)的二甲基甲酰胺(0.5ml)的混合物于室温下经隔夜搅拌。使反应物经乙酸乙酯稀释并经0.1N氢氯酸冲洗。使有机层置于硫酸镁上干燥并经过滤和真空浓缩。使残余物经反相HPLC纯化以生成标题化合物(14.6mg，28％)。分析级LCMS：+ESI(M+H)434.1；保留时间2.24分钟(Waters Atlantis C184.6×50mm,5μM柱；95％水/乙腈线性梯度至5％水/乙腈经4.0分钟，维持于5％水/乙腈达5.0分钟；0.05％三氟乙酸改质剂；流速2.0ml/分>
实施例2：5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲唑-3-甲酰胺
将三乙胺(40ml，290毫摩尔)加入至1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮(16.8g，53.6毫摩尔)和3-氨甲酰基-1H-吲唑-5-羧酸(10.0g，48.7毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(120ml)悬浮液中。使混合物于室温下经搅拌5分钟并随后冷却至5℃。经20分钟逐滴加入1-丙烷膦酸环酐(60ml，100毫摩尔，50重量％乙酸乙酯溶液)并维持内部温度介于5至10℃。使反应物经隔夜搅拌并逐渐回温至室温。将反应混合物缓慢倒入水(700ml，5℃)中。使所生成的沉淀物经过滤和干燥。对滤液加入10％甲醇/乙酸乙酯(1L)并使所生成的沉淀物经过滤和干燥。结合所收集的固体(8.9g)且于130℃下溶解于N,N-二甲基甲酰胺(34ml)中。使溶液冷却至100℃并加入甲醇(65ml)。使溶液缓慢冷却至室温。通过过滤以收集所生成的沉淀物并经干燥以生成标题化合物(6.0g，28％)。+ESI(M+H)435.1；1H>6,δ):13.65(s,1H),8.15(s,1H),7.75(s,1H),7.60(d,J＝8.6Hz,1H),7.29-7.47(m,3H),5.24(m,1H),3.32-3.79(m,4H),2.78(s,2H),2.59(s,2H),1.47(br.s.,4H),1.32(d,J＝6.7Hz,6H)。
实施例3：6-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-甲酰胺
将3-氨甲酰基-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸(212mg，1.04毫摩尔)加入至(1,3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二酰亚胺氢氯化物(252mg，1.31毫摩尔)和1-羟基苯并三唑水合物(199mg，1.30毫摩尔)的二氯甲烷(5ml)溶液中。使混合物于室温下经搅拌40分钟。随后加入1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮(312mg，1.26毫摩尔)和三乙胺(0.434ml，3.11毫摩尔)并使反应物于室温下经搅拌16小时。使反应物经饱和氯化铵水溶液稀释并经二氯甲烷萃取2次。使结合的有机层连续经饱和碳酸氢钠溶液、水及盐水冲洗。使有机相置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。通过急骤柱层析(0-100％20％甲醇/二氯甲烷溶液)纯化以生成标题化合物(254mg，57％)。+ESI(M+H)435.5；1H>3OD,δ):8.57(d,J＝1.8Hz,1H),8.26(s,1H),7.98(d,J＝1.0Hz,1H),7.43(s,1H),5.38(m,1H),3.63(m,4H),2.90(s,2H),2.66(s,2H),1.66(m,4H),1.42(d,J＝6.6Hz,6H)。
通过类似于上述合成实施例1至3的化合物所描述的方法，使用适当的起始物(其是可购得、使用本领域技术人员所公知的制剂加以制备或通过上述路径加以制备)，制备下述表1所示的化合物。下述化合物起初是作为游离碱被分离且为进行测试可被转化为药学上可接受的盐。
表1
实施例18：5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲酰胺
步骤1.3-氰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-羧酸甲酯
使3-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-羧酸甲酯(1.28g，5.01毫摩尔)与N,N-二甲基乙酰胺(34ml)混合。对该混合物加入锌粉(195mg，2.90毫摩尔)和氰化锌(1.20g，10.2毫摩尔)。使氮气冒泡通过该混合物30分钟。随后加入1,1’-双(二苯膦基)二茂铁-二氯化钯(II)二氯甲烷络合物(611mg，0.749毫摩尔)并密封反应容器。使反应物经加热至120℃达65小时。使反应物经20％甲醇/乙酸乙酯稀释并经通过硅藻土过滤。使滤液经水稀释并转移至分离漏斗。分离相层并使有机相再次经水和盐水冲洗。使有机相置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。通过急骤柱层析(0-75％乙酸乙酯/庚烷)纯化以生成标题化合物(390mg，39％)。+ESI(M+H)203.1。
步骤2.5-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基羰基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲腈
使3-氰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-羧酸甲酯(390mg，1.93毫摩尔)溶解于甲醇(20ml)。加入1N氢氧化钠水溶液(11ml，10毫摩尔)并使反应物于室温下经搅拌22小时。浓缩粗产物以除去甲醇并经二氯甲烷冲洗1次。通过6N氢氯酸水溶液使水层酸化至pH 2并通过过滤以收集所生成的固体(172mg)。
将4-二甲氨基吡啶(27.6mg，0.22毫摩尔)、2-丙烷膦酸环酐(0.65ml，1.1毫摩尔)及二氯甲烷(3ml)加入至该羧酸(170mg，0.91毫摩尔)。使混合物于室温下经搅拌1小时。随后加入三乙胺(0.51ml，3.6毫摩尔)和1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮(293mg，0.913毫摩尔)并使反应物经搅拌17小时。加入额外的三乙胺(0.30ml，2.2毫摩尔)并使反应物再经搅拌24小时。使反应物经水稀释并分离相层。使水层经二氯甲烷萃取2次。使结合的有机相置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。通过柱层析(0-100％10％甲醇的二氯甲烷溶液/二氯甲烷)纯化以生成标题化合物(177mg，47％)。+ESI(M+H)418.3；>1H>
步骤3.5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲酰胺
将5-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基羰基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲腈(177mg，0.424毫摩尔)的甲醇(2ml)溶液加入至脲过氧化氢(552mg，5.70毫摩尔)的1N氢氧 化钠水溶液(4.24ml，4.24毫摩尔)的0℃溶液中。使反应物回温至室温并经搅拌22小时。减压下除去甲醇并使残余物经水和饱和氯化铵水溶液稀释。使混合物经二氯甲烷(3x)萃取。使结合的有机相置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。通过反相HPLC纯化以生成标题化合物。分析级LCMS：+ESI(M+H)436.2；保留时间2.11分钟(方法A)。
实施例19：5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.2-氰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-羧酸乙酯
通过类似于实施例18的步骤1所描述的方法，使用2-溴-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-羧酸乙酯，制备标题化合物。+ESI(M+H)216.3；>1H>4,δ):9.02(d,J＝2.1Hz,1H),8.73(d,J＝2.0Hz,1H),7.35(s,1H),4.41(q,J＝7.2Hz,2H),1.40(t,J＝7.1Hz,3H)。
步骤2.5-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基羰基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲腈
将甲醇(1ml)、四氢呋喃(1ml)及水(1ml)加入至2-氰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-羧酸乙酯(36mg，0.17毫摩尔)并随后加入2N氢氧化锂水溶液(0.17ml，0.33毫摩尔)。使反应物于室温下经隔夜搅拌并随后经浓缩。将粗反应物溶解于水中并使用1N氢氯酸水溶液调整pH至4。使混合物经乙酸乙酯萃取(3x)。使结合的有机相置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩以生成2-氰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-羧酸。随后通过类似于实施例1所描述的方法，使用2-氰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-羧酸，制备标题化合物。-ESI(M-H)415.1。
步骤3.5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
通过类似于实施例18的步骤3所描述的方法，制备标题化合物。分析级LCMS：+ESI(M+H)435.1；保留时间2.17分钟(方法A)。
实施例20：1-异丙基-1’-{[2-(甲基氨基)-1H-苯并咪唑-5-基]羰基}-1,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(6H)-酮
步骤1.1’-(3,4-二氨基苯甲酰基)-1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮
通过类似于实施例3所描述的方法，使用3,4-二氨基苯甲酸，制备标题化合物。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,δ):7.45(s,1H),6.60(s,1H),6.46(s,1H),5.76(s,1H),5.24-5.30(m,1H),4.78(s,2H),4.56(s,2H),3.35-3.55(m,4H),2.79(s,2H),2.59(s,2H),2.40-2.50(m,1H),1.42-1.46(m,3H),1.35(d,J＝6.8Hz,6H)。
步骤2.1-异丙基-1’-{[2-(甲基氨基)-1H-苯并咪唑-5-基]羰基}-1,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(6H)-酮
使1’-(3,4-二氨基苯甲酰基)-1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮(0.1g，0.3毫摩尔)和异硫氰基甲烷(19mg，0.3毫摩尔)的混合物溶解于四氢呋喃(3ml)。使反应物经加热至回流状态并经搅拌6小时。使反应混合物经浓缩并将残余物倒入冰水中。使溶液经乙酸乙酯萃取(3×20ml)。使结合的有机相置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩以生成1-(2-氨基-4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基羰基)苯基)-3-甲基硫脲(37mg，27％)。
使粗产物溶解于乙醇(2ml)并加入甲基碘(147mg，1.0毫摩尔)。使反应物经加热至回流状态并经隔夜搅拌。使反应物经浓缩并通过氢氧化铵使残余物碱化至pH 9。使混合物经二氯甲烷萃取(3×20ml)。使结合的有机相置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。通过反相HPLC纯化以生成灰白色固体的标题化合物(28mg，83％)。1H>3,δ):7.39(s,1H),7.13(s,1H),7.05-7.07(m,1H),6.99-7.01(m,1H),5.33-5.43(m,1H),3.44-3.89(m,4H),2.91(s,3H),2.86(s,2H),2.60(s,2H),1.50-1.80(m,4H),1.46(d,J＝6.8Hz,6H)。
实施例21：5-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-苯并咪唑-2-甲酰胺
使1’-(3,4-二氨基苯甲酰基)-1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮(500mg，1.3毫摩尔)、2-氯乙酰胺(200mg，2.1毫摩尔)、硫(200mg，6.3毫摩尔)及三乙胺(1ml，7毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(5ml)混合物于65℃下经隔夜搅拌。使反应混合物冷却至0℃，经水(10ml)稀释且经乙酸乙酯(2×20ml)萃取。使结合的有机相置于硫酸钠上干燥并经过滤和浓缩。通过柱层析纯化以生成黄色固体的标题化合物(252mg，44％)。1H>3OD,δ):7.60-7.90(m,2H),7.30-7.50(m,2H),5.37-5.40(m,1H),3.40-4.00(m,4H),2.89(s,2H),2.65(s,2H),1.50-1.80(m,4H),1.42(d,J＝6.4Hz,6H)。
实施例22：3-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-6-甲氧基喹啉-7-甲酰胺
步骤1.1’-(7-溴-6-甲氧基喹啉-3-羰基)-1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮
通过类似于实施例2所描述的方法，使用7-溴-6-甲氧基喹啉-3-羧酸，制备标题化合物。+ESI(M+H+1)513.2；1H>3,δ):8.71(d,J＝2.15Hz,1H),8.29(s,1H),8.05(d,J＝2.15Hz,1H),7.32(s,1H),7.05(s,1H),5.25-5.37(m,1H),3.96(s,3H),3.65-3.91(m,2H),3.37-3.58(m,2H),2.77(s,2H),2.55(s,2H),1.59-1.73(m,2H),1.46-1.59(m,2H),1.39(d,J＝6.44Hz,6H)。
步骤2.3-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基羰基)-6-甲氧基喹啉-7-甲腈
通过类似于制备中间体6所描述的方法，使用1’-(7-溴-6-甲氧基喹啉-3-羰基)-1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮，制备标题化合物。+ESI(M+H)458.4；1HNMR(400MHz,CDCl3,δ):8.82(d,J＝1.95Hz,1H),8.37(s,1H),8.10(d,J＝1.56Hz,1H),7.35(s,1H),7.14(s,1H),5.33(m,1H),4.02(s,3H),3.70-3.91(m,2H),3.36-3.54(m,2H),2.80(s,2H),2.58(s,2H),1.65-1.77(m,2H),1.51-1.62(m,2H),1.42(d,J＝4.49Hz,6H)。
步骤3.3-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-6-甲氧基喹啉-7-甲酰胺
通过类似于制备中间体6的步骤4所描述的方法，使用3-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基羰基)-6-甲氧基喹啉-7-甲腈，制备标题化合物。+ESI(M+H)476.4；1H>3OD,δ):8.77(s,1H),8.52(s,1H),8.36(s,1H),7.55(s,1H),7.42(s,1H),5.31-5.43(m,1H),4.08(s,3H),3.84-4.00(m,1H),3.69-3.83(m,1H),3.48-3.58(m,2H),2.90(s,2H),2.65(br.s.,2H),1.53-1.78(m,4H),1.35-1.45(m,6H)。
实施例23：6-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-甲腈
步骤1.1’-(3-溴-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羰基)-1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮
通过类似于实施例3所描述的方法，使用3-溴-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸，制备标题化合物。+ESI(M+H+1)472.1；1H>6,δ):11.85(br.s.,1H),8.39(d,J＝1.8Hz,1H),7.93>
步骤2.6-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-甲腈
将N,N-二甲基乙酰胺(9ml)加入至1’-(3-溴-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羰基)-1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮(500mg，1.1毫摩尔)、锌粉(70mg，1.1毫摩尔)及氰化锌(187mg，1.60毫摩尔)的混合物中。使反应小瓶加盖并使氮气冒泡通过该混合物15分钟。其间，使乙酸钯(II)(24mg，0.11毫摩尔)、4,5-双(二苯膦基)-9,9-二甲基二苯并吡喃(68mg，0.12毫摩尔)及锌粉(7mg，0.13毫摩尔)的N,N-二甲基乙酰胺(1.5ml)混合物经加热至80℃达15分钟以生成带红色的褐色溶液。随后通过注射器将该钯溶液加入至该基质混合物。使反应物经加热至100℃并经搅拌3天。使反应物冷却至室温并经乙酸乙酯(100ml)稀释。使溶液经通过硅藻土过滤并浓缩滤液。使粗残余物(50mg)经反相HPLC纯化以生成标题化合物(25.8mg)。+ESI(M+H)417.1；HPLC保留时间2.32分钟(方法A)。
实施例24：2-({3-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]喹啉-6-基}氧)乙酰胺
步骤1.2-(2-氯-3-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基羰基)喹啉-6-基氧)乙酰胺
通过类似于实施例1所描述的方法，使6-(2-叔丁氧基-2-氧代乙氧基)-2-氯喹啉-3-羧酸与1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮偶合以生成2-(2-氯-3-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基羰基)喹啉-6-基氧)乙酸叔丁酯。使产物(30mg，0.053毫摩尔)悬浮于氨(2ml，10毫摩尔，7M甲醇溶液)并于室温下经搅拌18小时。使反应物经浓缩以生成标题化合物(27mg，100％)。+ESI(M+H)510.4。
步骤2.2-({3-[(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]喹啉-6-基}氧)乙酰胺
将甲醇(1.5ml)和乙酸乙酯(1.5ml)加入至2-(2-氯-3-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基羰基)喹啉-6-基氧)乙酰胺(27mg，0.053毫摩尔)。随后加入氢氧化钯(15mg)并使反应物经加压至40psi氢且于室温下经搅动20小时。使反应混合物经通过硅藻土过滤并经浓缩。通过反相HPLC纯化以生成标题化合物(2.1mg，8％)。+ESI(M+H)476.2；HPLC保留时间2.11分钟(方法A)。
实施例25：1’-[(2-氨基喹啉-7-基)羰基]-1-异丙基-1,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(6H)-酮
步骤1.1’-(2-(叔丁基氨基)喹啉-7-羰基)-1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮
通过类似于实施例3所描述的方法，使用2-(叔丁基氨基)喹啉-7-羧酸，制备标题化合物。+APCI(M+H)474.6；1H>3,δ):7.72(d,J＝8.8Hz,1H),7.64(s,1H),7.55(d,J＝8.2Hz,1H),7.36(s,1H),7.16(dd,J＝8.1,1.3Hz,1H),6.59(d,J＝9.2Hz,1H),5.36(quin,J＝6.6Hz,1H),3.31-3.96(m,4H),2.79(s,2H),2.58(s,2H),1.55-1.75(m,4H),1.52(s,9H),1.44(d,J＝6.4Hz,6H)。
步骤2.1’-[(2-氨基喹啉-7-基)羰基]-1-异丙基-1,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(6H)-酮三氟乙酸盐
将三氟乙酸(0.90ml，12毫摩尔)加入至1’-(2-(叔丁基氨基)喹啉-7-羰基)-1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮(50mg，0.11毫摩尔)。使反应物经加热至70℃达3小时，随后冷却至室温且经隔夜搅拌。使反应物经浓缩至干燥状态并经反相HPLC纯化以生成标题化合物(41mg，93％)。+ESI(M+H)418.2；HPLC保留时间2.11分钟(方法A)。1H>3OD,δ):8.36(d,J＝9.27Hz,1H),7.97(d,J＝8.05Hz,1H),7.66(s,1H),7.53(dd,J＝8.17,1.34Hz,1H),7.44(s,1H),7.12(d,J＝9.27Hz,1H),5.39(五重峰,J＝13.23,6.68Hz,1H),3.91(br.s.,1H),3.76(br.s.,1H),3.46(br.s.,2H),2.92(s,2H),2.67(d,J＝7.81>
通过类似于上述合成实施例1至3的化合物所描述的方法，使用适当的起始物(其是可购得、使用本领域技术人员所公知的制剂加以制备或通过上述路径加以制备)，制备下述表2所示的化合物。下述表所示的化合物起初是作为游离碱被分离且为进行测试可被转化为药学上可接受的盐。
表2
通过类似于上述合成实施例1至3的化合物所描述的方法，使用适当的起始物(其是可购得、使用本领域技术人员所公知的制剂加以制备或通过上述路径加以制备)，制备下述表3所示的化合物。下述化合物起初是作为游离碱被分离且为进行测试可被转化为药学上可接受的盐。
表3
实施例45：6-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-甲酰胺
步骤1.3-溴-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸甲酯
通过类似于制备中间体9的步骤2所描述的方法，使用1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸甲酯，制备标题化合物。+ESI(M+H)257.1；1H>6,δ):12.08(br.s.,1H),8.92(d,J＝1.8Hz,1H),8.30(d,J＝2.0Hz,1H),8.10(d,J＝2.9Hz,1H),3.88(s,3H)。
步骤2.3-溴-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸氢氯化物
将6N氢氯酸水溶液(18.9ml，114毫摩尔)加入至3-溴-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸甲酯(2.90g，11.4毫摩尔)的1,4-二
步骤3.1’-(3-溴-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羰基)-2-叔丁基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(2H)-酮
将三乙胺(5.52ml，39.6毫摩尔)加入至3-溴-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羧酸氢氯化物(2.75g，9.91毫摩尔)和2-叔丁基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(2H)-酮盐酸盐(2.95g，9.91毫摩尔)的二氯甲烷(30ml)悬浮液中。加入N,N-二甲基甲酰胺(5ml)且随后加入1-羟基苯并三唑(1.61g，11.9毫摩尔)和(1,3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二酰亚胺氢氯化物(2.28g，11.9毫摩尔)。使反应物于室温下经搅拌60小时。使反应物经乙酸乙酯稀释并经饱和碳酸氢钠水溶液和盐水冲洗。使有机相置于硫酸镁上干燥并经过滤和浓缩。通过急骤柱层析(0-10％甲醇/乙酸乙酯)纯化以生成淡褐色固体的标题化合物(3.39g，71％)。+ESI(M+1+H)486.2；1H>3,δ):10.05(br.s.,1H),8.57(d,J＝1.8Hz,1H),7.87(d,J＝1.8Hz,1H),7.61(d,J＝2.7Hz,1H),7.44(s,1H),3.78(br.s.,2H),3.51(br.s.,2H),2.81(s,2H),2.65(s,2H),1.63(s,13H)。
步骤4.6-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-3-甲酰胺
先后将1’-(3-溴-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羰基)-2-叔丁基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(2H)-酮(1.25g，2.58毫摩尔)、氰化锌(454mg，3.87毫摩尔)、锌粉(169mg，2.58毫摩尔)及最后二甲基乙酰胺(22ml)载入圆底烧瓶。使氮气冒泡通过混合物5分钟。加入碘化铜(I)(494mg，2.58毫摩尔)和与二氯甲烷络合的[1,1’-双(二苯膦基)二茂铁]二氯钯(II)(189mg，0.258毫摩尔)并使反应物经隔夜加热至120℃。使反应混合物经乙酸乙酯稀释并经通过硅藻土过滤。使滤液经碳酸氢钠(7％水溶液)和盐水冲洗。使有机相置于硫酸镁上干燥并经过滤和浓缩。使粗残余物经甲基叔丁醚研磨并使所生成的橙色粉末经过滤和干燥。
使该粉末(550mg)悬浮于二氯甲烷(20ml)并加入浓硫酸(1ml)。使反应物经激烈搅拌3小时并随后倾析上部分二氯甲烷层且放置一 边。对残余的褐色浆加入冰(50g)并通过5N氢氧化钠水溶液将pH调整至7。使混合物与先前经分离的二氯甲烷层组合并转移至分离漏斗。分离相层并使水层经二氯甲烷萃取2次。使结合的有机相经盐水冲洗，置于硫酸镁上干燥且经过滤和浓缩。通过急骤柱层析(0-10％甲醇/二氯甲烷)纯化以生成灰白色固体的标题化合物(420mg，73％)。+ESI(M+H)449.3；1H>6,δ):12.09(br.s.,1H),8.49(d,J＝1.8Hz,1H),8.24(s,1H),8.12(br.s.,1H),7.93(d,J＝1.8Hz,1H),7.83(s,1H),7.39(d,J＝2.7Hz,1H),3.62(br.s.,2H),3.43(br.s.,2H),2.79(s,2H),2.58(s,2H),1.53(s,13H)。
实施例46：2-({3-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]喹啉-6-基}氧)乙酰胺
步骤1.2-(3-(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基羰基)喹啉-6-基氧)乙酸叔丁酯
通过类似于实施例3所描述的方法，使用6-(2-叔丁氧基-2-氧代乙氧基)喹啉-3-羧酸和2-叔丁基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(2H)-酮盐酸盐，制备标题化合物。+ESI(M+H)547.3；1H>3,δ):8.77(d,J＝2.0Hz,1H),8.10(d,J＝1.6>
步骤2.2-(3-(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基羰基)喹啉-6-基氧)乙酸
将氢氯酸(10ml，40毫摩尔，4M 1,4-二
步骤3.2-({3-[(2-叔丁基-7-氧代-2,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]喹啉-6-基}氧)乙酰胺
将氨(2.36ml，1.18毫摩尔，0.5M 1,4-二
实施例47：1’-[(2-氨基喹啉-7-基)羰基]-2-叔丁基-2,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(6H)-酮
通过类似于实施例25所描述的方法，使用2-叔丁基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(2H)-酮盐酸盐，制备标题化合物。+ESI(M+H)432.3；1H>3,δ):8.10(d,J＝9.21Hz,1H),7.82(s,1H),7.76(dd,J＝7.95Hz,1H),7.49(dd,1H),7.43(s,1H),6.87(d,J＝9.33Hz,1H),3.95(m,1H),3.64(m,1H),3.26-3.46(m,2H),2.79(s,2H),2.66(s,2H),1.57-1.80(m,4H),1.61(s,9H)。
实施例48：2-双环[1.1.1]戊-1-基-1’-(1H-吲唑-5-基羰基)-2,4-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(6H)-酮
通过类似于实施例1所描述的方法，使用2-(双环[1.1.1]戊-1-基)-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(2H)-酮和1H-吲唑-5-羧酸，制备标题化合物。+ESI(M+H)416.2；HPLC保留时间2.32分钟(方法A)。
实施例49：5-[(1-双环[1.1.1]戊-1-基-7-氧代-1,4,6,7-四氢-1’H-螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-基)羰基]-1H-吲唑-3-甲酰胺
通过类似于实施例2所描述的方法，使用1-(双环[1.1.1]戊-1-基)-4,6-二氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-7(1H)-酮氢氯化物和3-氨甲酰基-1H-吲唑-5-羧酸，制备标题化合物。+APCI(M+H)459.5；1H>3,δ):8.42(s,1H),7.50(s,2H),7.35(s,1H),6.93(br.s.,1H),5.47(br.s.,1H),3.32-3.93(m,4H),2.79(s,2H),2.58(s,2H),2.56(s,1H),2.39(s,6H),1.45-1.76(m,4H)。
通过类似于上述实施例所描述的方式，可制备下述表4所示的化合物。
表4
药理数据
生物学实验方案
本发明化合物类在治疗动物(特别是哺乳动物(例如人))疾病(诸如本文所详述者)中的利用性可以通过本领域技术人员已知的常规分析证明其活性，该分析包括下述体外和体内分析。这些分析还提供通过本发明化合物的活性可与其他已知化合物类的活性相比较的方法。
ACC1和ACC2的活性的直接抑制作用
本发明化合物的ACC抑制活性是由基于标准步骤的方法证明。使用重组人ACC1(rhACC1)和重组人ACC2(rhACC2)的制备物以测定例如 式I化合物的ACC活性直接抑制作用。该分析所使用的重组人ACC1和ACC2的代表序列分别以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2显示。
[1]rhACC1的制备。将2升经包含全长人ACC1cDNA的重组杆状病毒感染的SF9细胞悬浮在冰冷的细胞裂解缓冲液(25mM Tris,pH7.5；150mM NaCl；10％甘油；5mM咪唑(EMDBioscience；Gibbstown,NJ)；2mM TCEP(BioVectra；Charlottetown,Canada)；Benzonase核酸酶(10000U/100克细胞浆；Novagen；Madison,WI)；无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(1片/50毫升；Roche Diagnostics；Mannheim，德国))中。通过3周期的冷冻-解冻将细胞裂解且经40,000X g离心40分钟(4℃)。将上清液直接载入HisTrap FF粗制柱(GE Healthcare；Piscataway,NJ)并经咪唑梯度洗脱至0.5M经过20柱体积(CV)。收集包含ACC1的部分且经25mM Tris,pH 7.5、2mM TCEP、10％甘油稀释1：5且直接载入CaptoQ(GE Healthcare)柱且经NaCl梯度洗脱至1M经过20CV’s。通过经λ磷酸酶(100U/10μM目标蛋白；New EnglandBiolabs；Beverly,MA)在4℃下培养14小时，从纯化的ACC1除去磷酸酯基；添加黑海绵酸(okadaic acid)(1μM最终浓度；Roche Diagnostics)以抑制磷酸酶。通过在4℃下经透析6小时将经纯化的ACC1交换进入25mM Tris,pH 7.5、2mM TCEP、10％甘油及0.5M NaCl中。制备等分试样且冷冻于-80℃下。
[2]rhACC1抑制的测量。hACC1是通过使用Transcreener ADP检测FP分析试剂盒(Bellbrook Labs，Madison,Wisconsin)于Costar#3676(Costar,Cambridge,MA)384-孔板中使用用于50μM ATP反应的制造者所推荐的条件进行分析。分析的最终条件为50mMHEPES,pH7.2、10mM MgCl2、7.5mM柠檬酸三钾、2mM>3。通常，10微升反应是在25℃下进行120分钟，并添加10微升Transcreener停止和检测缓冲剂并将组合物在室温下培养1小时。数据是经使用620激发Cy5FP一般双镜、620激发Cy5FP滤器、688发射(S)和688(P)发射滤器的Envision荧光读计(Perkinelmer)获得。
[3]rhACC2的制备。人ACC2抑制作用是使用经纯化的重组人ACC2(hrACC2)测量。简言之，自剑桥生物科技有限公司(Cambridge Bioscience Limited)购得ACC2的全长Cytomax克隆株并定序列且次克隆至PCDNA5FRT TO-TOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA)。通过四环霉素诱导将ACC2表达于CHO细胞中并收集5升具有谷氨酰胺、生物素、潮霉素、杀稻瘟素及1微克/毫升四环霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的DMEM/F12中。随后施用含有ACC2的培养基至Softlink Soft Release Avidin柱(Promega,Madison,Wisconsin)并经5mM生物素洗脱。洗脱4毫克ACC2于0.05毫克/毫升的浓度(以A280测定)，其具有95％的评估纯度(以A280测定)。在50mM Tris、200mM NaCl、4mM DTT、2mM EDTA及5％甘油中透析经纯化的ACC2。将收集的蛋白冷冻并储存于-80℃下，且融解时活性未损失。对ACC2活性的测量和ACC2抑制作用的评估，将测试化合物溶解在DMSO中并加至具有1％最终DMSO浓度的5x储备液(stock)的rhACC2酶。
[4]人ACC2抑制的测量。hACC2是通过使用Transcreener ADP检测FP分析试剂盒(Bellbrook Labs,Madison,Wisconsin)于Costar#3676(Costar,Cambridge,MA)384-孔板中使用用于50uM ATP反应的制造者所推荐的条件进行分析。分析的最终条件为50mMHEPES,pH7.2、5mM MgCl2、5mM柠檬酸三钾、2mM>3。通常，10微升反应是在25℃下进行50分钟，并添加10微升Transcreener停止和检测缓冲剂且将组合物在室温下培养1小时。数据是通过使用620激发Cy5FP一般双镜、620激发Cy5FP滤器、688发射(S)和688(P)发射滤器的Envision荧光读计(Perkinelmer)获得。
上述实施例所例示的式(I)化合物类的使用上述重组hACC1和重组hACC2的Transcreener分析的结果示于下表中。
SEQ ID NO.1显示可用于Transcreener体外分析的重组人ACC1的序列(SEQ IDNO.1)。
hACC1序列
SEQ.ID NO.1：
MAHHHHHHDEVDDEPSPLAQPLELNQHSRFIIGSVSEDNSEDEISNLVKLDLLEKEGSLSPASVGSDTLSDLGISSLQDGLALHIRSSMSGLHLVKQGRDRKKIDSQRDFTVASPAEFVTRFGGNKVIEKVLIANNGIAAVKCMRSIRRWSYEMFRNERAIRFVVMVTPEDLKANAEYIKMADHYVPVPGGPNNNNYANVELILDIAKRIPVQAVWAGWGHASENPKLPELLLKNGIAFMGPPSQAMWALGDKIASSIVAQTAGIPTLPWSGSGLRVDWQENDFSKRILNVPQELYEKGYVKDVDDGLQAAEEVGYPVMIKASEGGGGKGIRKVNNADDFPNLFRQVQAEVPGSPIFVMRLAKQSRHLEVQILADQYGNAISLFGRDCSVQRRHQKIIEEAPATIATPAVFEHMEQCAVKLAKMVGYVSAGTVEYLYSQDGSFYFLELNPRLQVEHPCTEMVADVNLPAAQLQIAMGIPLYRIKDIRMMYGVSPWGDSPIDFEDSAHVPCPRGHVIAARITSENPDEGFKPSSGTVQELNFRSNKNVWGYFSVAAAGGLHEFADSQFGH
CFSWGENREEAISNMVVALKELSIRGDFRTTVEYLIKLLETESFQMNRIDTGWLDRLIAEKVQAERPDTMLGVVCGALHVADVSLRNSVSNFLHSLERGQVLPAHTLLNTVDVELIYEGVKYVLKVTRQSPNSYVVIMNGSCVEVDVHRLSDGGLLLSYDGSSYTTYMKEEVDRYRITIGNKTCVFEKENDPSVMRSPSAGKLIQYIVEDGGHVFAGQCYAEIEVMKMVMTLTAVESGCIHYVKRPGAALDPGCVLAKMQLDNPSKVQQAELHTGSLPRIQSTALRGEKLHRVFHYVLDNLVNVMNGYCLPDPFFSSKVKDWVERLMKTLRDPSLPLLELQDIMTSVSGRIPPNVEKSIKKEMAQYASNITSVLCQFPSQQIANILDSHAATLNRKSEREVFFMNTQSIVQLVQRYRSGIRGHMKAVVMDLLRQYLRVETQFQNGHYDKCVFALREENKSDMNTVLNYIFSHAQVTKKNLLVTMLIDQLCGRDPTLTDELLNILTELTQLSKTTNAKVALRARQVLIASHLPSYELRHNQVESIFLSAIDMYGHQFCIENLQKLILSETSIFDVLPNFFYHSNQVVRMAALEVYVRRAYIAYELNSVQHRQLKDNTCVVEFQFMLPTSHPNRGNIPTLNRMSFSSNLNHYGMTHVASVSDVLLDNSFTPPCQRMGGMVSFRTFEDFVRIFDEVMGCFSDSPPQSPTFPEAGHTSLYDEDKVPRDEPIHILNVAIKTDCDIEDDRLAAMFREFTQQNKATLVDHGIRRLTFLVAQKDFRKQVNYEVDRRFHREFPKFFTFRARDKFEEDRIYRHLEPALAFQLELNRMRNFDLTAIPCANHKMHLYLGAAKVEVGTEVTDYRFFVRAIIRHSDLVTKEASFEYLQNEGERLLLEAMDELEVAFNNTNVRTDCNHIFLNFVPTVIMDPSKIEESVRSMVMRYGSRLWKLRVLQAELKINIRLTPTGKAIPIRLFLTNESGYYLDISLYKEVTDSRTAQIMFQAYGDKQGPLHGMLINTPYVTKDLLQSKRFQAQSLGTTYIYDIPEMFRQSLIKLWESMSTQAFLPSPPLPSDMLTYTELVLDDQGQLVHMNRLPGGNEIGMVAWKMTFKSPEYPEGRDIIVIGNDITYRIGSFGPQEDLLFLRASELARAEGIPRIYVSANSGARIGLAEEIRHMFHVAWVDPEDPYKGYRYLYLTPQDYKRVSALNSVHCEHVEDEGESRYKITDIIGKEEGIGPENLRGSGMIAGESSLAYNEIITISLVTCRAIGIGAYLVRLGQRTIQVENSHLILTGAGALNKVLGREVYTSNNQLGGIQIMHNNGVTHCTVCDDFEGVFTVLHWLSYMPKSVHSSVPLLNSKDPIDRIIEFVPTKTPYDPRWMLAGRPHPTQKGQWLSGFFDYGSFSEIMQPWAQTVVVGRARLGGIPVGVVAVETRTVELSIPADPANLDSEAKIIQQAGQVWFPDSAFKTYQAIKDFNREGLPLMVFANWRGFSGGMKDMYDQVLKFGAYIVDGLRECCQPVLVYIPPQAELRGGSWVVIDSSINPRHMEMYADRESRGSVLEPEGTVEIKFRRKDLVKTMRRVDPVYIHLAERLGTPELSTAERKELENKLKEREEFLIPIYHQVAVQFADLHDTPGRMQEKGVISDILDWKTSRTFFYWRLRRLLLEDLVKKKIHNANPELTDGQIQAMLRRWFVEVEGTVKAYVVVDNNKDLAEWLEKQLTEEDGVHSVIEENIKCISRDYVLKQIRSLVQANPEVAMDSIIHMTQHISPTQRAEVIRILSTMDSPST
SEQ ID NO.2显示可用于Transcreener体外分析的重组人ACC2的序列(SEQ IDNO.2)。
hACC2序列
SEQ.ID NO.2：
MVLLLCLSCLIFSCLTFSWLKIWGKMTDSKPITKSKSEANLIPSQEPFPASDNSGETPQRNGEGHTLPKTPSQAEPASHKGPKDAGRRRNSLPPSHQKPPRNPLSSSDAAPSPELQANGTGTQGLEATDTNGLSSSARPQGQQAGSPSKEDKKQANIKRQLMTNFILGSFDDYSSDEDSVAGSSRESTRKGSRASLGALSLEAYLTTGEAETRVPTMRPSMSGLHLVKRGREHKKLDLHRDFTVASPAEFVTRFGGDRVIEKVLIANNGIAAVKCMRSIRRWAYEMFRNERAIRFVVMVTPEDLKANAEYIKMADHYVPVPGGPNNNNYANVELIVDIAKRIPVQAVWAGWGHASENPKLPELLCKNGVAFLGPPSEAMWALGDKIASTVVAQTLQVPTLPWSGSGLTVEWTEDDLQQGKRISVPEDVYDKGCVKDVDEGLEAAERIGFPLMIKASEGGGGKGIRKAESAEDFPILFRQVQSEIPGSPIFLMKLAQHARHLEVQILADQYGNAVSLFGRDCSIQRRHQKIVEEAPATIAPLAIFEFMEQCAIRLAKTVGYVSAGTVEYLYSQDGSFHFLELNPRLQVEHPCTEMIADVNLPAAQLQIAMGVPLHRLKDIRLLYGESPWGVTPISFETPSNPPLARGHVIAARITSENPDEGFKPSSGTVQELNFRSSKNVWGYFSVAATGGLHEFADSQFGHCFSWGENREEAISNMVVALKELSIRGDFRTTVEYLINLLETESFQNNDIDTGWLDYLIAEKVQAEKPDIMLGVVCGALNVADAMFRTCMTDFLHSLERGQVLPADSLLNLVDVELIYGGVKYILKVARQSLTMFVLIMNGCHIEIDAHRLNDGGLLLSYNGNSYTTYMKEEVDSYRITIGNKTCVFEKENDPTVLRSPSAGKLTQYTVEDGGHVEAGSSYAEMEVMKMIMTLNVQERGRVKYIKRPGAVLEAGCVVARLELDDPSKVHPAEPFTGELPAQQTLPILGEKLHQVFHSVLENLTNVMSGFCLPEPVFSIKLKEWVQKLMMTLRHPSLPLLELQEIMTSVAGRIPAPVEKSVRRVMAQYASNITSVLCQFPSQQIATILDCHAATLQRKADREVFFINTQSIVQLVQRYRSGIRGYMKTVVLDLLRRYLRVEHHFQQAHYDKCVINLREQFKPDMSQVLDCIFSHAQVAKKNQLVIMLIDELCGPDPSLSDELISILNELTQLSKSEHCKVALRARQILIASHLPSYELRHNQVESIFLSAIDMYGHQFCPENLKKLILSETTIFDVLPTFFYHANKVVCMASLEVYVRRGYIAYELNSLQHRQLPDGTCVVEFQFMLPSSHPNRMTVPISITNPDLLRHSTELFMDSGFSPLCQRMGAMVAFRRFEDFTRNFDEVISCFANVPKDTPLFSEARTSLYSEDDCKSLREEPIHILNVSIQCADHLEDEALVPILRTFVQSKKNILVDYGLRRITFLIAQEKEFPKFFTFRARDEFAEDRIYRHLEPALAFQLELNRMRNFDLTAVPCANHKMHLYLGAAKVKEGVEVTDHRFFIRAIIRHSDLITKEASFEYLQNEGERLLLEAMDELEVAFNNTSVRTDCNHIFLNFVPTVIMDPFKIEESVRYMVMRYGSRLWKLRVLQAEVKINIRQTTTGSAVPIRLFITNESGYYLDISLYKEVTDSRSGNIMFHSFGNKQGPQHGMLINTPYVTKDLLQAKRFQAQTLGTTYIYDFPEMFRQALFKLWGSPDKYPKDILTYTELVLDSQGQLVEMNRLPGGNEVGMVAFKMRFKTQEYPEGRDVIVIGNDITFRIGSFGPGEDLLYLRASEMARAEGIPKIYVAANSGARIGMAEEIKHMFHVAWVDPEDPHKGFKYLYLTPQDYTRISSLNSVHCKHIEEGGESRYMITDIIGKDDGLGVENLRGSGMIAGESSLAYEEIVTISLVTCRAIGIGAYLVRLGQRVIQVENSHIILTGASALNKVLGREVYTSNNQLGGVQIMHYNGVSHITVPDDFEGVYTILEWLSYMPKDNHSPVPIITPTDPIDREIEFLPSRAPYDPRWMLAGRPHPTLKGTWQSGFFDHGSFKEIMAPWAQTVVTGRARLGGIPVGVIAVETRTVEVAVPADPANLDSEAKIIQQAGQVWFPDSAYKTAQAIKDFNREKLPLMIFANWRGFSGGMKDMYDQVLKFGAYIVDGLRQYKQPILIYIPPYAELRGGSWVVIDATINPLCIEMYADKESRGGVLEPEGTVEIKFRKKDLIKSMRRIDPAYKKLMEQLGEPDLSDKDRKDLEGRLKAREDLLLPIYHQVAVQFADFHDTPGRMLEKGVISDILEWKTARTFLYWRLRRLLLEDQVKQEILQASGELSHVHIQSMLRRWFVETEGAVKAYLWDNNQVVVQWLEQHWQAGDGPRSTIRENITYLKHDSVLKTIRGLVEENPEVAVDCVIYLSQHISPAERAQVVHLLSTMDSPAST
实验动物的ACC抑制作用的急性体内评估
本发明化合物类的ACC抑制活性可通过体内评估减少来自治疗动物的肝脏和肌肉组织中丙二酰基-CoA含量的能力而确定。
使用下述方法测量对实验动物的丙二酰基-CoA生产的抑制作用。
该方法中，研究之前将维持于任意采食标准饲料和水的雄Sprague-Dawley大鼠(225-275克)随机化。实验开始之前使动物喂食或禁食18小时。2小时进入光周期，使动物口服剂量5毫升/千克的体积(0.5％甲基纤维素；载剂)或适当化合物(制备于载剂中)。包括喂食载剂对照组以测定基线组织的丙二酰基-CoA含量，而包括对禁食动物测定禁食对丙二酰基-CoA含量的影响。给予化合物1小时之后使用CO2使动物窒息并移除组织。明确地，通过心脏穿刺以收集血液并放入包含EDTA(BD>
于液态N2下将组织粉末化以确定取样的均匀性。在FastPrep>
肝脏和肌肉组织中丙二酰基CoA含量的分析可通过下述方法评估。
该方法利用下述的材料：丙二酰基-CoA四锂盐和丙二酰基-13C3-CoA三锂盐，其购自Isotec(Miamisburg,OH,USA)、过氯酸钠(Sigma，目录号410241)、三氯乙酸(ACROS，目录号42145)、磷酸(J.T.Baker，目录号0260-01)、甲酸铵(Fluka，目录号17843)、甲醇(HPLC等级，J.T.Baker，目录号9093-33)和水(HPLC等级，J.T.Baker,4218-03)以制造所需的流动相。Strata-X在线固体相萃取柱，25微米，20毫米×2.0毫米I.D(目录号00M-S033-B0-CB)得自>
该方法可利用下述装置进行。二维层析使用Agilent 1100二元泵、Agilent 1100四元泵和二个Valco Cheminert 6-通口二位置阀。样品是经由具有保持于10℃的Peltier冷却堆栈和20微升取样环的LEAP HTC PAL自动取样器引入。用于自动取样器的针洗液为10％三氯乙酸的水溶液(w/v)用于洗涤1和90：10甲醇：水用于洗涤2。分析型柱(Sunfire)使用MicroTech Scientific Micro-LC柱烘箱维持在35℃。洗脱液是在具有涡轮离子喷雾的ABI Sciex API3000三重四极子质谱仪上分析。
二维层析是使用在线固相萃取和反相层析的不同梯度洗脱条件平行实施。方法的一般设计为致使第一维被利用于样品清除和感兴趣的分析物捕取，接着用于来自第一维的洗脱在第二维上的二个维度的简单结合。随后不结合这些维度以允许来自用于定量的第二维的分析物的梯度洗脱而同时地按顺序制备用于下个样品的第一维。当二维简单结合时，在第一维中流动相的流动与在第二维上的分析物洗脱逆向，允许最佳的峰宽、峰形和洗脱时间。
HPLC系统的第一维利用Phenomenex strata-X在线固体相萃取柱和流动相由溶剂A的100mM过氯酸钠/0.1％(v/v)磷酸和溶剂B的甲醇组成。
HPLC系统的第二维利用Waters SunFire C18反相柱和流动相由100mM溶剂A的甲酸铵和溶剂B的甲醇组成。梯度的开始条件维持2分钟和此时间期间将分析物转移到分析柱。重要的是开始条件在足够强度以从在线SPE柱洗脱分析物而将其保持在分析性的。然后，在洗涤和再平衡步骤之前于4.5分钟内将梯度线性增加至74.5％A。
质谱法当与HPLC相结合时可为用于定量测定复杂矩阵(complex matrices)中的分析物的高选择性和敏感的方法但仍受到干扰和抑制。 通过给合二维HPLC与质谱仪，这些干扰被显着减少。此外，通过利用三元组四极质谱仪的多重反应检测(MRM)部件，显著地改善信噪比。
用于这个测试，以正离子模式具有TurboIonSpray电压2250V操作质谱仪。喷雾气体加热到450℃。去簇电压(Declustering Potential)(DP)、调焦电压(FocusingPotential)(FP)和碰撞能(CE)分别设置在60、340和42V。四极杆1(Q1)解析设置在单位解析，四极杆3(Q3)设置在低。CAD气体设置在8。监测的MRM转变用于丙二酰CoA:854.1→347.0m/z(L.Gao et al.(2007)J.Chromatogr.B853,303–313)；并且用于丙二酰-13C3-CoA:857.1→350.0m/z具有采样时间200ms。在接近分析物的预期洗脱时间将洗脱液转换至质谱仪，另外地将其转移至废料以帮助保护来源和改良使用仪器的耐久性。使用分析家软件(Applied>
将包含用于定量组织萃取物中的丙二酰基-CoA的标准曲线的样品制备于10％(w/v)三氯乙酸(TCA)中且范围从0.01至1皮摩尔/微升。将丙二酰基-13C3-CoA(0.4皮摩尔/微升的最后浓度)加至各标准曲线成分和样品作为内标准物。
制备6个分析内质量对照组；3个从禁食动物制备的集中萃取物和3个从喂食动物制造的集中萃取物。这些独立样品掺入0、0.1或0.3皮摩尔/微升12C-丙二酰基-CoA及丙二酰基-13C3-CoA(0.4皮摩尔/微升)。各分析内质量对照组包含85％的组织萃取水溶液及以内标准物(0.4皮摩尔/微升)和12C-丙二酰基-CoA分布的其余部分。分析内对照组包括在各操作中；其是由四头肌(quadriceps)的禁食和喂食集中样品及/或肝脏的禁食和喂食集中样品所组成。所有这些对照组掺入丙二酰基-13C3-CoA(0.4皮摩尔/微升)。
本申请案所列示的所有文献(其包括但不限于颁发专利、专利申请案及期刊文章)是以各自全文引用的方式并入本文。
虽然本发明已通过参考所揭露的实施方式加以说明，但是本领域技术人员将能容易了解所述的具体实验仅用于说明本发明。应了解在 不偏离本发明的精神下可进行各种修改。因此，本发明仅受限于下述的权利要求书。
机译： 用作乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的吡唑并螺酮衍生物
机译： 用作乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的吡唑并螺乙酮衍生物
机译： 用作乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的吡唑并螺酮衍生物
