一种基于INDEL‑SNP连锁关系分析混合样本DNA的方法

摘要

本发明一种基于INDEL‑SNP连锁关系分析混合样本DNA的方法，属于法医学检测技术领域。所述方法包括(1)、对混合样本DNA进行RT‑PCR扩增，得到包含INDEL+SNP两个连锁位点的PCR产物；(2)、对步骤(1)中得到的扩增产物中所含有的SNP进行分型。本发明所述的方法具有以下优点：设计的INDEL‑SNP引物有种属特异性，适合法医学检测，可用于法医学常见混合斑的DNA检测分析，不论这些混合斑是否是同种细胞类型的还是有不同种的细胞类型构成；还可能用于骨髓移植手术或其他器官移植手术后外周血的移植物成分的监测，也将鉴定的时限大大提前。

说明书

技术领域

本发明属于法医学检测技术领域，具体涉及一种基于INDEL-SNP连锁关系分析混合样本DNA的方法，对混合样本DNA(即混合斑)的分析包括确认混合斑、对混合斑进行个体识别。

背景技术

两个或多个个体的混合样本可见于以下情况：(1)法医学混合样本包括多个个体混合的血样、唾液斑、精斑、阴道分泌物等体液的混合斑；(2)患者进行骨髓移植或者器官移植以后的外周血样本或者器官等；(3)检测肿瘤患者的早期突变或者肿瘤的异质性；(4)嵌合体个体或者孕妇的外周血中混合的胎儿样本等等。随着DNA检测技术的发展，DNA混合样本的检测灵敏度有了很大的提高，但是还不能一一区分构成混合斑中的每一个个体。

检测混合斑的DNA常用技术可大致分为两种策略：(一)首先分离不同类型或不同个体的细胞，再针对细胞的DNA分型法。如针对含有精斑的混合斑采用二步提取法；分离单细胞后进行DNA分型法；利用针对某一类细胞的抗体分离细胞后的DNA分型法等。(二)第二个策略是直接针对提取到的混合样本的DNA进行分型。如(1)直接的STR分析；(2)SNP包括INDEL的直接分析：包括RT-PCR技术，测序技术，连接酶分析法等；(3)ID-STR分析；(4)测序分析，主要是第二代DNA测序分析等。

上述分析中的不足之处如下：

1：直接的STR分析：STR具有极高的多态性，是法医学DNA分析的主流方法。其主要缺点是(1)对于混合斑的分析灵敏度很低，不能检测到构成含量低于5-10％的混合斑；(2)STR分析由于是属于PCR后的分析，虽然可以分析出优势峰和非优势峰，但是由于PCR后期的平台效应，使得该方法定量欠准确；(3)混合斑的DNA使得每一个STR位点产生了多个峰，无法确定其中的个体，一般采用排除法去排除个体，似然比计算较为复杂。

2：二代DNA测序技术：该技术可以通过软件等连接每一个测得的片段，从而合成分析的序列。但是该技术有以下缺点(1)仪器和试剂等造成方法昂贵且需要专业人员分析，难以普及；(2)较STR分析而言，该方法可以得到一条DNA链上的所有信息，多态性大大提高，灵敏度较STR法有所提高(可以检测构成在1％的DNA)，但有一定的错误率(一般在2％以内)，法医学分析要求准确度是第一位的，任何一个碱基序列的误读都会对于检案造成难以弥补的损失。因此，该方法对于法医学分析而言，尚需要仔细评估。

3：SNP分析：SNP分析技术有很多种，由于单个SNP的多态性远低于STR分析，因此，很少用直接测序或者电泳的方法检测混合斑；INDEL可以看作一种特殊的SNP，目前国外已有相应的试剂盒，除了用于法医学多态性分析外，还用于分析骨髓移植后的外周血DNA的构成比例，但未见法医学混合斑的分析。由于采用了差别化扩增技术，该方法具有较高的灵敏度，可以检测到构成比大于0.1-0.01％的混合斑样本。但是由于该方法只用到了INDEL，没有用到其连锁的多态性信息，使得该分析的效率低下。本方法则利用INDEL进行差别化扩增，重点是利用与INDEL连锁的SNP进行个体区分，分析效率大大提高。且本方法重点应用领域是混合斑的分析领域。4：连接酶分析法：该方法采用了DNA连接酶，主要用于分析点突变，该方法具有极高的灵敏度，可检测到千分之一乃至万分之一的细胞突变。由于其利用单个SNP的信息，多态性较低，并且有一定程度的假阳性，对于实验条件要求很严格，很少用于法医学混合斑分析和骨髓移植后的DNA分析。

5：ID-STR分析：是今年来出现的一种DNA混合斑分析方法：该方法采用了INDEL进行差异化扩增，再利用INDEL后的STR的多态性去区别个体来源，是一种较完美的解决方案，具有较高的灵敏度和多态性。然而该方法采用的INDEL和STR位点的多态性是否能适合中国人群尚需要进一步明确。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种基于INDEL-SNP连锁关系分析混合样本DNA的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种基于INDEL-SNP连锁关系分析混合样本DNA的方法，其中，所述方法包括下述步骤：

(1)、对混合样本DNA进行RT-PCR扩增，得到包含INDEL和SNP两个位点的RT-PCR扩增产物；

(2)、对步骤(1)中得到的扩增产物中所含有的SNP进行分型。

上述技术方案所述的一种基于INDEL-SNP连锁关系分析混合样本DNA的方法，其中，步骤(1)的具体步骤为：对提取的DNA样本分别用22对引物进行RT-PCR，其中反应体系为10ul体系：SYBR 5ul、PRIMER 1ul、DNA 100ng，补水至10ul；

RT-PCR的扩增条件：95℃30s；95℃5s，58℃30s，共40个循环；为了建立PCR产物的溶解曲线，扩增反应结束后，继续从60℃按每5s升高1℃缓慢加热到95℃；

所述22对引物为：P1：SEQ No.1、SEQ No.2；P2：SEQ No.3、SEQ No.2；P3：SEQ No.4、SEQ No.5；P4：SEQ No.6、SEQ No.5；P5：SEQ No.7、SEQ No.8；P6：SEQ No.9、SEQ No.8；P7：SEQ No.10、SEQ No.11；P8：SEQ No.12、SEQ No.11；P9：SEQ No.13、SEQ No.14；P10：SEQNo.15、SEQ No.14；P11：SEQ No.16、SEQ No.17；P12：SEQ No.18、SEQ No.17；P13：SEQNo.19、SEQ No.20；P14：SEQ No.21、SEQ No.20；P15：SEQ No.22、SEQ No.23；P16：SEQNo.24、SEQ No.23；P17：SEQ No.25、SEQ No.26；P18：SEQ No.27、SEQ No.26；P19：SEQNo.28、SEQ No.29；P20：SEQ No.30、SEQ No.29；P21：SEQ No.31、SEQ No.32；P22：SEQNo.33、SEQ No.32。

上述技术方案所述的一种基于INDEL-SNP连锁关系分析混合样本DNA的方法，其中，步骤(2)中对步骤(1)中得到的扩增产物中所含有的SNP进行分型的方法为直接测序法、连接酶法、SSCP法、单碱基延伸微测序法、质谱法或液相色谱分析法中的一种。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明对于两样本的混合DNA样本的分析：混合斑灵敏度的检测：主要依赖于INDEL，后续SNP的检测则与检测手段有关，可成功分析混合斑，用于排除或者确认个体。

2、本发明中设计的INDEL-SNP引物有种属特异性，适合法医学检测。

3、本发明还有可能用于骨髓移植手术或其他器官移植手术后外周血的移植物成分的监测。

4、本发明有可能用于所有涉及到混合样本时候需要区分个体的情况，如孕妇外周血中胎儿有利DNA的检测和分型，用该方法进行亲子鉴定时只需采取孕妇外周血即可，无需羊水穿刺或绒毛膜提取技术，保护胎儿和孕妇安全，也将鉴定的时限大大提前。

5、本发明还可以用于无创的亲子鉴定，即从孕妇血中即可测定胎儿游离DNA的DNA分型，从而用于亲子鉴定；既保护胎儿的安全，避免羊水或者绒毛膜穿刺等有创技术，又将鉴定的时限大大提前。

附图说明：

1、图1为人群中将出现的8种基因型；

2、图2为RT-PCR方法进行的灵敏度检测结果；

3、图3为rs397844074位点的三个正常样本LL、LS和SS的分型；

4、图4为琼脂糖凝胶电泳结果；

5、图5为rs397897239位点的INDEL连锁的SNP的分型；

6、图6为rs397696936位点连锁的SNP的多态性图；

7、图7为rs397897214位点连锁的SNP的多态性图。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例和试验例对本发明一种基于INDEL-SNP连锁关系分析混合样本DNA的方法作进一步的说明，本发明中所述的混合样本DNA(即混合斑)的分析包括混合斑的确认和个体区分。

以下实施例和试验例中的技术术语解释如下：

1、INDEL：插入缺失型多态性。

2、L引物：对应INDEL插入序列的引物。

3、S引物：对应INDEL缺失序列的引物。

4、R引物：对应INDEL多态性的下游引物。

5、SNP：单碱基多态性。

6、RT-PCR：即实时定量PCR。

7、Cq值：RT-PCR时，荧光产物达到阈值时经历的循环数。

8、LL型产物：指对同一个样本分型时，用L/R引物有扩增产物，而S/R引物扩增无产物的样本。在本专利中对应在RT-PCR上表现为L/R的Cq值比S/R的Cq值小6-12个循环以上。

9、SS型产物：指对同一个样本分型时，用S/R引物有扩增产物，而L/R引物扩增无产物的样本。在本专利中对应在RT-PCR上表现为S/R的Cq值比LR的Cq值小6-12个循环以上。

10、LS型产物：指对同一个样本分型时，用S/R引物有扩增产物，L/R引物有扩增产物。在本专利中对应在RT-PCR上表现为S/R的Cq值比LR的Cq值的差值在0-0.71以内。

11、Cq(L型)：指用L引物和R引物扩增，荧光产物达到阈值时经历的循环数。

12、Cq(S型)：指用S引物和R引物扩增，荧光产物达到阈值时经历的循环数。

实施例1：

本发明所述的一种基于INDEL-SNP连锁关系分析混合样本DNA的方法采用的是INDEL+SNP的方法来解决混合斑的分析问题，其过程如下：

首先选取中国人群中频率分布良好的INDEL位点(INDEL的碱基差异数为2bp-10bp)，这种INDEL位点的下游或者上游300bp内具有另外一个多态性良好的SNP位点(选取标准HET>3.0)。首先扩增出包含INDEL+SNP两个位点的PCR产物，其中上游引物对于INDEL位点具有特异性，下游引物的设计包含了SNP，在人群中共将出现8种基因型如图1所示，图1为人群中将出现的8种基因型。长短方框分别表示IN型和DEL型的INDEL多态性，椭圆形和三角形分别表示两种含SNP的单碱基改变的多态性。人群中除了同种型别相互混合外(即A混合A；B混合B；C混合C等等)，不同种基因型的混合都可用本方法进行区分(如A混合B；A混合F等等)。

首先利用INDEL的特异性扩增分别扩增出DNA样本的父源或者母源的DNA，再利用其下游紧密连锁的SNP位点的多态性区分该个体。对于混合DNA样本，其分型原理结合了INDEL的特异性扩增的技术分拣出个体的一条DNA分子，利用该分子上的SNP标记说明其来源，从而分析混合斑的来源，用于排除和确定混合斑的个体构成。该方法为首创，本发明中暂命名为ID-SNP法。

(一)、ID-SNP的基本信息和引物设计：

选取11对ID-SNP，引物序列见表1：

表1：选取的11对ID-SNP的位点信息

序号名称位置INDEL多态信息SNP多态性1rs397844074chr 1-/ATC/G2rs397832665chr5-/CATAGGG/T3rs397782455chr10-/TTCTA/C4rs397832994chr13-/AATCCAAAATC/G5rs397696936chr14-/TAGTTC/T6rs397688301chr15-/CTAGCCAT/G7rs397822382chr19-/ATTT/C8rs397897230chr20-/CAACTAA/C9rs397897239chr11-/TAGTTC/T10rs397897238chr19-/CAGA/G11rs397897214chr20-/CATTT/A

表2 选择的11对ID-SNP的引物设计

(二)、实验条件和INDEL分型：

1、DNA提取：采用OMEGA全血基因组DNA试剂盒提取人体静脉血DNA，具体步骤参见说明书，简言之，就是将样品中的DNA特异性结合到硅胶膜上，通过两次洗涤可以将PCR抑制剂，如：二价阳离子和蛋白完全去除，最后结合在离心柱上的纯核酸可用水或试剂盒中的缓冲液进行洗脱收集。对于提取的DNA按照光密度值法(OD值法)进行定量分析，确定基因组DNA的含量和浓度。

2、灵敏度检测：灵敏度实验采用real-time PCR(RT-PCR)的方法进行，将DNA按照下列浓度进行分组，24ng，6ng，3ng，1ng，0.5ng，0.2ng，0.1ng，0ng分成各组。RT-PCR的组成成分，体积和扩增条件如下：

RT-PCR的组成成分：10ul体系：SYBR Green 5ul、PRIMER 1ul、DNA 100ng，补水至10ul。

RT-PCR的扩增条件：95℃30s；95℃5s，58℃30s，共40个循环；为了建立PCR产物的溶解曲线，扩增反应结束后，继续从60℃缓慢加热到95℃(每5s升高1℃)。针对每一组对上述11对引物进行RT-PCR进行灵敏度检验。结果如图2所示，发现上述引物中，灵敏度在0.2ng以上才能有效区分，0.1ng的模板DNA与空白对照几乎无差别。因此，我们把DNA检测的灵敏度定位为需要0.2ng以上的DNA模板；即需要对于DNA含量在0.2ng以上的DNA扩增，本方法才可以有效区分。本方法建议采用100ng以上DNA。低于0.1ng的模板DNA不建议采用本方法。

3、正常样本的DNA的INDEL分型，采用80例山西人群的DNA样本(健康个体，男女不限)。提取DNA后按照100ngDNA为模板进行RT-PCR。运行RT-PCR可在以下仪器但不限制于这些仪器：STRATAGENE Mx3000P、BioRad IQ5。正常样本的LL型、LS型、SS型如图3所示，图3为rs397844074位点的三个正常样本LL、LS和SS的分型；Cq指荧光信号达到阈值时所经历的循环数；图中纵坐标表示荧光强度，横坐标表示循环数；1-1L和1-1S同时扩增同一样本，Cq差值为0.6，判断为LS型；1-2L和1-2S扩增同一样本时Cq值差为12，判断为SS型，同理1-3L和1-3S扩增样本时Cq值差距为12，判断为LL型。

将表2中的L和R引物或者S和R引物，分别对一个样本进行扩增。INDEL的分型可分别分LL型(即只有L和R引物有扩增产物)；SS型(只有S和R有扩增产物)以及LS型(即LR引物和SR引物均有扩增产物)。在100ngDNA模板下，正常LL型、LS型、SS型样本的Cq差值(|Cq(L型)-Cq(S型)|)见表3。

表3 各ID-SNP位点在中国山西人群中常见的分型及Cq差值

上述结果均经过2％的琼脂糖凝胶验证以确认其分型,琼脂糖凝胶电泳结果见图4所示。

4、混合斑的INDEL分型：本方法用两个人的DNA进行不同比例的混合：混合比例分别是：1:0；0:1；1:1；1:10；1:50；1:100；1:500。当不同的模板DNA量(100ng)按照上述比例混合后分别进行RT-PCR。扩增体系和扩增条件同上。当两个样本混合时，不同类型的INDEL的Cq差值远高于正常样本；见表4和表5，表4和表5均为两个不同类型的INDEL混合时候Cq差值，其中表4为rs397832665位点LL分型与SS分型混合时Cq差值，表5为rs397832994位点LS分型与SS分型混合时Cq差值。

表4 rs397832665位点LL分型与SS分型混合时Cq差值

表5 rs397832994位点LS分型与SS分型混合时Cq差值

5、种属特异性分析数据：动物DNA用QIAGEN DNeasy Tissue Kit提取试剂盒提取。保证扩增体系内DNA含量在100ng。

上述INDEL-SNP位点在以下动物：牛、鸡、兔、鼠、狗、羊、鱼、猪的样本DNA中均没有扩增产物。

表现在RT-PCR结果就是：LR和SR的Cq值均高于28.90(上述8种动物在做RT-PCR时的最小值)，与阴性对照相同，说明这些引物有种属特异性。

(三)、混合斑的确认：

要确认一个混合斑，单单用一个INDEL-SNP位点可能导致信息含量不足。因此需要联合利用表2中的11个INDEL-SNP位点。联合利用上述11个位点的个体识别率为0.996313804。

法医上或者骨髓移植的患者往往有嫌疑人或者预知病人的DNA分型。当体系内有100ngDNA模板时，如果发现上述位点中的LS型别中LR与SR两种扩增的Cq值差别在正常范围(见表3)外既要考虑混合斑。如LL与SS型的Cq差值在0.71以上即要考虑混合斑，其构成比可以参考表4。如果是两个人的混合斑是LL与LS，Cq差值在2以上即可确认混合斑，其构成比可参考表4。

(四)、进行个体的区分：

INDEL连锁的SNP的分型，对于每一个个体均有LR和SR两管扩增产物，每一管扩增产物可通过直接测序法确定INDEL后面连锁的SNP。

图5中位于上面的图例是在rs397897239位点INDEL连锁的SNP的分型，红色箭头所指连锁的SNP多态性表现为G，图5中位于下面的图例是在rs397897239位点INDEL连锁的SNP的分型，红色箭头所指连锁的SNP多态性表现为A。

在图6和图7中还列举了两个INDEL位点连锁的SNP的多态性，其中：图6为rs397696936位点连锁的SNP的多态性图，碱基下方的横向双箭头指示相同碱基，竖箭头指示rs397696936位点连锁的SNP的多态性，左图表现为C，右图表现为T；图7为rs397897214位点连锁的SNP的多态性，碱基下方的横向双箭头指示相同碱基，竖箭头指示rs397897214位点连锁的SNP的多态性，左图表现为A，右图表现为T。

实施例2：

如在现场床单上提取到一个斑痕物证，对该斑痕进行11个ID-SNP分型。发现rs397832665、rs397832994位点的△Cq＞8，分型可分别判定为LL型、SS型。其余9个位点△Cq均＜0.5，分型可判定为LS型。受害人在rs397832665、rs397832994两个位点的分型为LL型、SS型。该现场共有四个嫌疑人A、B、C、D，在rs397832665位点，他们的分型分别为LL型、LS型、SS型、LL型，考虑到斑痕和受害人的分型，嫌疑人B和C可以排除。在rs397832994位点，嫌疑人A和D的分型分别为LS型、SS型，结合现场斑痕和受害人的分型，嫌疑人A可以排除。在其余9个LS型的位点中，以rs397844074举例，受害人的分型为SS型，嫌疑人D的分型为LL型，所以嫌疑人D不可以排除。

本发明所述的分析方法可以用于以下领域：

一、法医学对于混合斑的个体排除和个体确认方法：

混合斑对于无关个体的排除方法：

(1)、主要考虑三种混合方式：LS型混合LL型；LS型混合SS型，LL型混合SS型。见图1。如果发现Cq值超出了正常样本的DNA的Cq值容许范围，即要考虑混合斑。在11个INDEL-SNP中，如果混合斑的INDEL-SNP分型与已知个体不一致，即可排除该个体。

这种情况也见于同种INDEL的混合样本，如LL型混合LL型,LS型混合LS型，SS型混合SS型，但是这时候需要与INDEL连锁的SNP在这两个个体的分型时不同的。值得注意的是在同类型的INDEL混合时，我们难以用Cq差值辨认出混合斑。

(2)、确认个体的方法：主要指LL型与SS型的混合样本：

这种情况下，L/R管中为LL型个体的扩增产物，S/R管中为SS型个体的扩增产物，把两管产物测序，确定了SNP的分型，即可确认个体。对于个案的匹配概率等于与INDEL连锁的所有SNP的表型频率的乘积，即∏(P1P2P3...Pi)，Pi为SNP的表型频率。

对于LL型与LS型混合或者SS型与LS型混合的情况，也可以确认个体，但是计算公式复杂，本发明中不展开讨论。

二、骨髓移植：首先对骨髓移植的患者和供者的DNA进行INDEL-SNP分型，找到差别的INDEL位点，由于本专利有着很高的个体识别率，因此，总能找到有差别的INDEL分型，在不同的INDEL混合分型中，可以确认患者DNA在外周血中的比例，从而确认是否移植成功，由于本方法可以比STR法有更高的灵敏度(STR法检测混合斑的灵敏度为10％，低于该比例则无法检测)。该方法有望为移植物监测提供有力的工具。在骨髓移植监测时，只利用INDEL的多态性信息即可，无需对INDEL连锁的SNP进行分型。本方法采用的INDEL位点在中国人群中有很高的多态性和个体识别率。

三、得到与INDEL连锁SNP多态性的方法：对于每一对INDEL-SNP，可以有多种方法得到其下游SNP的多态性，直接测序法：得到的产物经过PCR产物纯化后，直接进行PCR产物测序，一般可委托测序公司进行。如本发明中介绍的方法。此外，连接酶法、SSCP法、单碱基延伸微测序法、质谱法、液相色谱分析法等等均可对INDEL得到的扩增产物中所含有的SNP进行分型。本发明中仅仅列出了直接测序法。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。