一种两性羧酸四核铜金属配位聚合物及其制备方法

摘要

本发明涉及一种两性羧酸四核铜金属配位聚合物，该两性羧酸四核铜金属配位聚合物是重复结构单元为下式(Ⅰ)所示的铜配位聚合物。所述的铜配位聚合物用N‑(3,5‑二羧基苄基)‑(4‑羧基苯)溴化吡啶与铜盐反应合成。本发明所述的四核铜金属配位聚合物具有良好的水溶性，可检测胃癌患者外周血中高表达的五种miRNA，

说明书

技术领域

本发明涉及化学领域，具体涉及金属配位聚合物。

背景技术

microRNA(miRNA)是一类由18～25个核苷酸组成，并且参与基因调控的内源性RNA分子。miRNA在诸多生物过程(如细胞分化、增值、凋亡以及疾病过程等)中起重要的角色性作用。不同发育阶段、不同组织中miRNA的表达水平有着显著差异。近年来有科学家研究发现，很多疾病的发生与miRNA的表达水平息息相关，如2015年Shu&Liu等发现胃癌患者外周血中有5种miRNA(miR-185，miR-20a，miR-210，miR25和miR-92b)表达显著上调，并推断此5种miRNA很可能作为潜在的胃癌诊断的生物标记物。因此，miRNA作为对疾病预测及诊断的新型生物标记物受到了科研工作者广泛的关注，对不同物种中miRNA表达进行识别对预防和诊断相关疾病具有重要意义。

识别miRNA最常见的方法有特异性强的northern blot(诺瑟杂交法)，高效快速的microarrays(基因芯片)，灵敏度高的qRT-PCR(实时荧光定量PCR)，但这些方法得需经过逆转录过程来识别，过程复杂，成本高且耗时。近年来所报道RCA(滚环扩增法)，LAMP(环介导等温扩增法)及LCR(连接酶链式反应)等方法虽一定程度上提高了识别灵敏度，但仍未克服耗时且高成本等缺点。

Cu(II)作为一种高效的荧光淬灭剂，在荧光光谱学原理作用下，基于Cu(II)构筑的金属有机骨架常被应用于荧光物质的淬灭实验中，但大部分基于Cu(II)的金属有机骨架具有水水溶性差等缺点，限制了这类材料在miRNA检测方面的研究。

众所周知，季铵盐官能团因其较大的极性，使得此类化合物具有较好的水溶性。将季铵盐官能团引入到金属配位聚合物中能够显著的增强此类金属配位聚合物的水溶性。将季铵盐基团和羧酸基团同时引入构筑两性羧酸配体，不仅能发挥羧酸较强的配位能力和多样的配位模式的优势，而且也能有效的克服羧酸金属配位聚合物溶解性较差的缺陷。目前，含有羧酸和季铵盐基团的配体研究较少，而关于此类金属配位聚合物作为荧光探针识别miRNA的研究更是鲜见文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种两性羧酸四核铜金属配位聚合物，该金属配位聚合物具有良好的水溶性，可检测胃癌患者外周血中高表达的miRNA。

本发明解决上述问题的技术方案是：

一种两性羧酸四核铜金属配位聚合物，该两性羧酸铜金属配位聚合物是重复结构单元为下式(Ⅰ)所示的铜配位聚合物，该铜配位聚合物的红外光谱数据(KBr)为：3429(s)，1632(s)，1564(s)，1394(s)，1156(m)，847(w)，778(w)，720(w)，607(w)cm^-1，晶胞参数分别为：α＝90°，β＝93.155(2)°，γ＝90°，

本本发明所述的两性羧酸四核铜金属配位聚合物的的重复结构单元的分子式为[Cu₄(Dcbcbp)₄(H₂O)₁₂，式中的Dcbcbp为N-(3,5-二羧基苄基)-(4-羧基苯)吡啶，上述四核铜金属配位聚合物在常温下为蓝色块状晶体，其重复结构单元中含有四个Cu(II)离子和四个N-(3,5-二羧基苄基)-(4-羧基苯)吡啶。四个3,5-二羧基苄形成矩形的四个角，一个铜离子与两个配体上3,5-二羧基苄部分的羧基单齿配位构成的矩形的短边，长边是由一个铜离子与两个配体上苯甲酸吡啶部分的羧基单齿配位形成。每个铜(II)原子与三个水分子配位，与不同羧基上的两个氧形成四角锥的几何结构。

本发明所述的两性羧酸铜金属配位聚合物采用本领域常用的制备方法，如，将N-(4-羧基苄基)-(3,5-二羧基苯)溴化吡啶与铜盐反应得到。本发明人推荐的方法，由以下步骤组成：

(1)将N-(3,5-二羧基苄基)-(4-羧基苯)溴化吡啶溶解在体积浓度为99％的甲醇中，调整溶液pH为6.0～7.0，得到配体溶液；

(2)将与N-(3,5-二羧基苄基)-(4-羧基苯)溴化吡啶等摩尔量的硝酸铜溶解于体积浓度为99％的甲醇中，得到铜盐溶液；

(3)将步骤(2)得到的铜盐溶液加入到步骤(1)得到配体溶液中，室温搅拌反应0.5～1h，过滤，收集沉淀并用体积浓度为99％的甲醇溶液洗涤得到蓝色沉淀物；

(4)将步骤(3)得到的蓝色沉淀物溶解在蒸馏水中，溶液室温静置至有蓝色晶体析出，过滤，收集蓝色晶体，乙醚洗净并真空干燥得到所述的两性羧酸四核铜金属配位聚合物。

本发明的所述的两性羧酸铜金属配位聚合物具有检测胃癌患者外周血中5种高表达microRNA的性能。检测原理如下：化合物首先通过静电、π-π堆积和(或)氢键作用与P-DNA(带有荧光标记物质的miRNA的逆转录DNA)结合形成复合体系并产生荧光淬灭现象。在加入miRNA后，miRNA与P-DNA通过碱基互补配对的作用形成结构稳定的杂化双链DNA/RNA。由于杂化双链变大的横截面和螺旋骨架的保护作用，使得杂化双链与化合物的相互作用减弱，并与化合物分离开来，体系的荧光也随着PET机制消失而复苏，实现了对miRNA的检测。

本发明的所述的四核铜金属配位聚合物可以用于检测胃癌患者外周血中5种高表达microRNA，具体检测方法包括以下步骤：

(1)化合物结合P-DNA的荧光淬灭性能

用100nM Tris-HCl缓冲溶液将100μM的P-DNA溶液稀释成50nM，作为待滴定液；将化合物溶解在100nM Tris-HCl缓冲溶液配成500μM(含50nM P-DNA)的溶液为滴定液。取P-DNA待滴定液2mL于荧光比色皿中，将滴定液按体积梯度加入比色皿中，记录体系荧光强度的变化(λ_ex＝480nm)直到荧光淬灭达到饱和。荧光淬灭效率Q_E用公式1.1计算。

Q_E＝(1-F_M/F₀)×100％>

其中F₀为P-DNA初始荧光强度；F_M是加入化合物1后体系荧光淬灭达到饱和时的荧光强度。

配体和金属离子结合P-DNA的荧光淬灭实验采用此方法完成。

(2)复合体系在miRNA存在时的荧光复苏能力

荧光复苏时间的确定：在上述实验基础上，将稀释后的miRNA溶液(10μM)加入到荧光淬灭达到饱和的复合体系中，使miRNA在体系中达到最小浓度25nM，监测荧光强度随时间的变化，确定体系荧光复检测miRNA的时间。

荧光复苏效率的测定：以复合体系的检测时间为标准，记录复合体系荧光强度随miRNA浓度增加而复苏的程度，直到荧光复苏达到饱和。荧光复苏效率R_E用公式1.2计算。

R_E＝F_T/F_M-1>

其中F_T为加入miRNA后复苏达到饱和时的荧光强度。

检测限的计算：用公式1.3计算复合体系对miRNA的检测限(Limit of Detection，LOD)。

LOD＝3σ/S (2.3)

其中σ为未加入miRNA前的荧光强度标准偏差，S为校正荧光复苏曲线斜率。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明产物原料来源广泛，容易获得；

(2)本发明产物合成方法的反应条件温和，时间短，可在一般溶剂中合成，无需惰性气体保护；产率为80％以上，纯度达100％；

(3)本发明所述的四核铜金属配位聚合物中季铵盐的引入显著增强了金属配位聚合物的水溶性，为金属配位聚合物活性的研究提供了前提条件，结构中出现的孔洞对金属配位聚合物具有miRNA识别能力具有较大的影响。实验结果证明，本发明所述的四核铜金属配位聚合物对胃癌患者外周血中miR-185、miR-20a、miR-210、miR25和miR-92b五种高表达microRNA具有良好的检测作用。

附图说明

图1是本发明所述两性羧酸四核铜金属配位聚合物的重复结构单元的X-射线单晶衍射表征的分子结构图。

图2是本发明所述两性羧酸四核铜金属配位聚合物浓度与荧光标记的不同miRNA的荧光强度变化曲线图，图中，(a)为P₁₈₅-DNA，(b)为P₂₁₀-DNA，(c)为P₂₅-DNA，(d)为P_20a-DNA，(e)为P_92b-DNA。

图3是本发明所述两性羧酸四核铜金属配位聚合物形成的复合体系与荧光标记的不同miRNA(25nM)在不同时间的荧光强度变化曲线图，(a)为P₁₈₅-DNA，(b)为P₂₁₀-DNA，(c)为P₂₅-DNA，(d)为P_20a-DNA，(e)为P_92b-DNA。

图4是本发明所述两性羧酸四核铜金属配位聚合物形成的复合体系与荧光标记的不同miRNA在不同浓度的存在下的荧光强度变化曲线图，图中，(a)为P₁₈₅-DNA，浓度为T₁₈₅；(b)为P₂₁₀-DNA，浓度为T₂₁₀；(c)为P₂₅-DNA，浓度为T₂₅；(d)为P_20a-DNA，浓度为T_20a；(e)为P_92b-DNA，浓度为T_92b。

具体实施方式

实施例1

1、两性羧酸四核铜金属配位聚合物的制备

(1)将0.2mmol(76.2mg)N-(4-羧基苄基)-(3,5-二羧基苯)溴化吡啶加入5mL体积浓度为99％的甲醇中，用0.1mmol/L的NaOH溶液将pH调至7.0，得到配体溶液；

(2)将0.2mmol(48.2mg)Cu(NO₃)₂·3H₂O溶解于体积浓度为99％的甲醇溶液(5mL)中，得到铜盐溶液；

(3)将步骤(2)得到的铜盐溶液逐滴加入到步骤(1)得到的配体溶液中，室温搅拌反应0.5h，反应出现大量蓝色沉淀物，过滤，收集沉淀物并用体积浓度为99％的甲醇溶液洗涤，得到蓝色沉淀物；

(4)将步骤(3)得到的蓝色沉淀物溶解在30mL蒸馏水中，过滤，收集滤液，室温静置一周，有蓝色晶体析出，过滤，收集蓝色晶体，乙醚洗净并真空干燥，得到71mg蓝色块状晶体(经测算产率：86％)。

2、两性羧酸四核铜金属配位聚合物的鉴定

通过下述元素分析、IR光谱和X-射线单晶衍射分析鉴定，上述步骤1所得到的蓝色块状晶体为本发明所述的两性羧酸四核铜金属配位聚合物，其重复单元的分子式为[Cu₄(Dcbcbp)₄(H₂O)₁₂]·24H₂O，式中的Dcbcbp为N-(4-羧基苄基)-(3,5-二羧基苯)吡啶，所述重复单元的化学结构式如(Ⅰ)所示。鉴定结果如下：

(1)元素分析：理论值：C 41.97，H 5.20，N 2.33；实验值：C 41.52，H 5.16，N 2.72。

(2)红外光谱(KBr disk，cm-1)：3429(s)，1632(s)，1564(s)，1394(s)，1156(m)，847(w)，778(w)，720(w)，607(w)。

(3)X-射线单晶衍射：晶体学参数和部分键长如表1和表2所示。X-射线单晶衍射结果表明，上述四核铜金属配位聚合物在常温下为蓝色块状晶体，其重复结构单元中含有四个Cu(II)离子，四个3,5-二羧基苄形成矩形的四个角，一个铜离子与两个配体上3,5-二羧基苄部分的羧基单齿配位构成的矩形的短边，长边是由一个铜离子与两个配体上苯甲酸吡啶部分的羧基单齿配位形成。每个铜(II)原子与三个水分子配位，与不同羧基上的两个氧形成四角锥的几何结构。晶胞参数分别为：α＝90°，β＝93.155(2)°，γ＝90°。X-射线单晶衍射表征结果如图1所示。

表1.[Cu₄(Dcbcbp)₄(H₂O)₁₂]·24H₂O的晶体学参数

^a>o|-|F_c|/|F_o|.^b>o²-F_c²)²/w(F_o²)²}^1/2.^c>o²-F_c²)²)/(n-p)}^1/2,

表2.[Cu₄(Dcbcbp)₄(H₂O)₁₂]·24H₂O的部分键长

利用对称变换生成的原子:#1-x,-y+2,-z+1.

实施例2

本实施例采用实施例1中得到的两性羧酸四核铜金属配位聚合物对五种miRNA识别作用进行研究。

本发明所述的金属配位聚合物溶解性：在25℃条件下，金属配位聚合物在16mL水中的达到饱和状态时溶解了2.4mg。

(1)通过miRBase数据库确认与胃癌外周血中表达异常的5种miRNA的成熟序列，人工合成作为待检序列，即target RNAs。考虑到RNA相对的不稳定性，我们将target RNAs各自对应的互补链置换成其互补DNA(complementary DNA，cDNA)，并对cDNAs序列进行荧光标记，即probe DNAs。5种miRNA相互作为干扰序列。考察金属配位聚合物能否选择性识别5种miRNA。

①miR-185:

Target RNA序列(T₁₈₅)：5’-UGG>

Probe DNA序列互补链(P₁₈₅-DNA)：5’-TCA>

②hsa-miR-20a

Target RNA序列(T_20a):5'-UAA>

Probe DNA序列互补链(P_20a-DNA)：5'-CTA>

③hsa-miR-92b

Target RNA序列(T_92b):5'-UAU>

Probe DNA序列互补链(P_92b-DNA)：5'-GGA>

④hsa-miR-25

Target RNA序列(T₂₅):5'-CAU>

Probe DNA序列互补链(P₂₅-DNA)：5'-TCA>

⑤hsa-miR-210

Target RNA序列(T₂₁₀):5'-CUG>

Probe DNA序列互补链(P₂₁₀-DNA)：5'-TCA>

(2)本发明所述金属配位聚合物检测miR-185，miR-20a，miR-210，miR25和miR-92b

(a)配制金属配位聚合物水溶液

将金属配位聚合物溶于蒸馏水中配制成浓度为62.5μM的溶液并用无菌过滤器对溶液进行除菌，密封保存待用。

(b)检测的步骤

(I)化合物结合P-DNA的荧光淬灭性能

用100nM Tris-HCl缓冲溶液将100μM的P-DNA溶液稀释成50nM，作为待滴定液；将化合物溶解在100nM Tris-HCl缓冲溶液配成500μM(含50nM P-DNA)的溶液为滴定液。取P-DNA待滴定液2mL于荧光比色皿中，将滴定液按体积梯度加入比色皿中，记录体系荧光强度的变化(激发波长＝480nm，发射波长＝518nm))直到荧光淬灭达到饱和。荧光淬灭效率Q_E用公式1.1计算。

Q_E＝(1-F_M/F₀)×100％>

其中F₀为P-DNA初始荧光强度；F_M是加入化合物1后体系荧光淬灭达到饱和时的荧光强度。

配体和金属离子结合P-DNA的荧光淬灭实验采用此方法完成。

(II)复合体系在miRNA存在时的荧光复苏能力

荧光复苏时间的确定：在上述实验基础上，将稀释后的miRNA溶液(10μM)加入到荧光淬灭达到饱和的复合体系中，使miRNA在体系中达到最小浓度25nM，监测荧光强度随时间的变化，确定体系荧光复检测miRNA的时间。

荧光复苏效率的测定：以复合体系的检测时间为标准，记录复合体系荧光强度随miRNA浓度增加而复苏的程度，直到荧光复苏达到饱和。荧光复苏效率R_E用公式1.2计算。

R_E＝F_T/F_M-1>

其中F_T为加入miRNA后复苏达到饱和时的荧光强度。

检测限的计算：用公式1.3计算复合体系对miRNA的检测限(Limit of Detection，LOD)。

LOD＝3σ/S (2.3)

其中σ为未加入miRNA前的荧光强度标准偏差，S为校正荧光复苏曲线斜率。

(5)实验结果

如下表3所示，金属配位聚合物对目标miRNA逆转录的荧光标记DNA P₁₈₅-DNA，P₂₁₀-DNA，P₂₅-DNA，P_20a-DNA和P_92b-DNA的荧光淬灭能力(图2)，形成的复合体系对miR-185，miR-210，miR-25，miR-20a和miR-92b的检测时间分别为5.3，8.3，9.0，8.7，8.0min(见图3)；荧光复苏率(R_E)分别为1.72，1.93，2.91，1.82，1.04；检测限为0.71，0.32，0.61，0.63，0.92nM(见图4)。该结果表明本发明所述的四核铜金属配位聚合物对五种胃癌病人外周血中过表达的miRNA具有较好的检测作用。

表3.四核铜金属配位聚合物对五种胃癌患者外周血中高表达的五种miRNA检测效果