一种自组装蛋白纳米复合胶束的制备方法

摘要

本发明属于化学工艺领域，涉及一种复合胶束的制备方法，具体涉及一种自组装蛋白纳米复合胶束的制备方法。步骤如下：配制质量浓度为1‑5%的角蛋白水溶液和质量浓度为1‑5%的丝素蛋白水溶液；将相同浓度的丝素蛋白水溶液和角蛋白水溶液按2‑6:1的体积比混合后，搅拌均匀后，调pH至3.5，搅拌均匀后在25℃的条件下，静置组装6‑12小时；取出组装完成的胶束溶液，并向溶液中加入双氧水，在转速500转/min的转速下磁力搅拌10min，随后在25℃的条件下，静置固定5‑10小时，制得经过固定后的自组装纳米胶束。本发明制备方法简单，没有加入有毒的固定试剂，是一种绿色高效的制备蛋白纳米胶束的方法。

说明书

技术领域

本发明属于化学工艺领域，涉及一种复合胶束的制备方法，具体涉及一种自组装蛋白纳米复合胶束的制备方法。

背景技术

蛋白质属于天然生物可降解型高分子聚合物，近年来做为一种优良的药物及营养物质载体越来越受到人们的关注。与人工合成聚合物相比，它可以被生物体吸收利用，因此在消化器官及循环系统可以发挥缓释及控释药物的作用。另外，蛋白质聚合物制备过程安全无毒，并且在生物机体内具有良好的吸收及可代谢性，生物降解产物毒性非常小。它还可以与氨基酸功能基团或者活性物质相结合，实现特定药物的靶向释放。正因为天然蛋白质具有诸如此类的优良特性，科学工作者已经利用其研制出了不同结构，适用于不同范围的多种载体形式，包括胶束、凝胶、纳米粒、微球、生物膜、蛋白多糖复合体等。

丝素蛋白无害且无毒，具有良好的生物相容性及可自然降解的特点，是一种天然优良的高分子材料。其在化工、医药、食品领域有着广泛的应用前景。羊毛角蛋白是一种产量巨大，具有优良特性的天然高分子聚合物，其在生物材料、医学、纺丝、皮革领域有着较为广泛的应用。角蛋白与其它蛋白的不同之处在于其含有大量的半光氨酸残基，占到氨基酸残基总量的7-20%，这些位于分子内及分子之间的半光氨酸残基通过二硫键将角蛋白连接成一个紧密的具有三维结构的稳定蛋白。本发明主要是利用这两种天然蛋白质的生化特性及结构特点，通过自组装的方法制备丝素蛋白/角蛋白纳米复合胶束，此种纳米复合胶束在医药缓释、食品、生物材料等领域有着广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于使用丝素蛋白与角蛋白通过自组装制备纳米复合胶束。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种自组装蛋白纳米复合胶束的制备方法，步骤如下：

（1）配制质量浓度为1-5%的角蛋白水溶液和质量浓度为1-5%的丝素蛋白水溶液；

（2）将相同浓度的丝素蛋白水溶液和角蛋白水溶液按2-6:1的体积比混合后，搅拌均匀后，调pH至3.5，搅拌均匀后在25℃的条件下，静置组装6-12小时；

（3）取出组装完成的胶束溶液，并向溶液中加入双氧水，在转速500转/min的转速下磁力搅拌10min，随后在25℃的条件下，静置固定5-10小时，制得经过固定后的自组装纳米胶束。

所述步骤（1）中角蛋白水溶液通过等电聚焦的方法制得，等电点为3.0；丝素蛋白水溶液通过CaCl₂-CH₃CH₂OH-H₂O>

所述步骤（2）中调pH是通过添加1M的HCL水溶液和1M的NaOH水溶液实现的。

所述步骤（3）中双氧水的加入量与角蛋白的质量比为2:1。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明所用的制备丝素蛋白的原料为桑蚕丝，所使用的羊毛角蛋白的来源主要为普通羊毛，对羊毛的来源品种没有特殊的限制。

（2）本发明主要利用两种天然高分子聚合物丝素蛋白及角蛋白制备自组装纳米复合胶束。使用的角蛋白其等电点为3.0，而制备的丝素蛋白的等电点为4.5。本发明的原理是利用这两种蛋白不同的等电点，在其混合溶液中将溶液的pH值调节至两种蛋白的等电点之间，此时丝素蛋白分子质子化带正电荷，而角蛋白分子去质子化带负电荷，两种带不同电荷的蛋白分子通过静电相互作用发生自组装，聚集形成具有一定的形貌的复合胶束。组装过程中，静电相互作用是发生自组装的主要推动力，另外还有疏水相互作用、氢键、范德华力也起到了一定的作用。此种制备蛋白纳米胶束的方法制备方法简单，没有加入有毒的固定试剂，是一种绿色高效的制备蛋白纳米胶束的方法。

附图说明

图1为实施例1制备的纳米胶束扫描电镜图。

图2为实施例2制备的纳米胶束扫描电镜图。

图3为实施例3制备的纳米胶束扫描电镜图。

图4为实施例4制备的纳米胶束扫描电镜图。

具体实施方式

羊毛角蛋白的制备：本发明所使用的角蛋白为等电点为3.0的羊毛角蛋白，此种羊毛角蛋白通过等电聚焦的方法获取，具体步骤为：

1. 还原法制备角蛋白溶液：将脱脂洗净的羊毛与Na₂S按照质量比4:3加入密闭玻璃容器中，加入羊毛质量20倍的水，避光放置7-10天。对角蛋白原溶液进行过滤得到还原法制备的角蛋白溶液。

2. 酸沉淀分级角蛋白：在以上制备的角蛋白溶液中快速加入浓盐酸，使体系pH值在较短时间内达到2.5，使羊毛角蛋白迅速沉淀。将上层所漂浮的色素蛋白取出，弃去上层液体，离心，转速为3000转/min。收集下层的羊毛角蛋白沉淀，低温真空干燥得到白色角蛋白固体。

3. 等电聚焦法制备等电点为3.0角蛋白：将5M的硫脲溶液、3M的尿素溶液和4%的β–巯基乙醇溶液加入超纯水中搅拌均匀，制备出角蛋白等电聚焦溶解液。将以上步骤制备的1g羊毛角蛋白粉末加入到1000mL羊毛角蛋白等电聚焦溶解液中，搅拌至其完全溶解，得到浓度为1mg/mL羊毛角蛋白等电聚焦上样溶液，加入体积分数2%的两性电解质溶液，搅拌均匀。使用Bio-rad等电聚焦系统对其进行持续等电聚焦，按照上述等电聚焦方法聚焦若干次，持续收集等电点为3.0角蛋白样品。

4. 等电点为3.0角蛋白样品的纯化：将收集到的等电点为3.0的角蛋白首先使用Sartocon Slice 200切向流超滤系统进行超滤，使用膜包的截留分子量为50KD及8KD。超滤完毕后再用截留分子量为1KD的透析袋在无氧水中进行透析，将得到的等电点为3.0的角蛋白在真空干燥，低温密封保存。

丝素蛋白的制备：本发明所使用的丝素蛋白通过CaCl₂-CH₃CH₂OH-H₂O>

1. 蚕丝的脱胶：将剪碎的蚕茧放入0.5%的NaHCO₃溶液中，加入100倍质量的水，在100℃的条件下沸煮50分钟，用去离子水冲洗3-4次。将蚕丝取出放入恒温干燥箱中在40℃下烘干。

2. 丝素蛋白的溶解：配置丝素蛋白溶解体系，按照CaCl₂:CH₃CH₂OH:H₂O摩尔比为1:2:8的比例配置丝素蛋白溶解液，将上步骤脱胶后的丝素蛋白加入配置好的溶解液中，在60℃的水浴中持续溶解2小时。

3. 丝素蛋白的提纯：将溶解得到的丝素蛋白溶液使用多层医用纱布过滤以去没有溶解的丝素蛋白及杂质，再将过滤后的丝素蛋白溶液装入透析袋中（截留分子量为14000）在去离子水中透析48小时以上，持续透析直到透析液的电导率不在变化为止，得到丝素蛋白的稀水溶液。

为对本发明做进一步的解释，以上述原料制备自组装蛋白纳米胶束的具体实施方式如下：

实施例1

本发明所述的制备自组装蛋白纳米胶束的方法包括下述步骤：

1. 将制备的等电点为3.0的角蛋白配制成浓度为1%的角蛋白水溶液，同时将丝素蛋白的稀水溶液的浓度调节至1%。

2. 将浓度都为1%的丝素蛋白及角蛋白溶液按照体积比6:1混合后搅拌均匀，使用1M的HCL和1M的NaOH将混合溶液的pH值调节至3.5，搅拌均匀后在25℃的条件下静置组装6小时。

3. 将组装完成后的胶束溶液取出，向溶液中加入与角蛋白质量比为1:2的双氧水，磁力搅拌10min。在25℃的条件下静置固定5小时，得到经过固定后的自组装纳米胶束。

所制备的纳米复合胶束经扫描电镜观测其形貌见图1。

实施例2

本发明所述的制备自组装蛋白纳米胶束的方法包括下述步骤：

1. 将制备的等电点为3.0的角蛋白配制成浓度为2%的角蛋白水溶液，同时将丝素蛋白的稀水溶液的浓度调节至2%。

2. 将浓度都为2%的丝素蛋白及角蛋白溶液按照体积比4:1混合后搅拌均匀，使用1M的HCL和1M的NaOH将混合溶液的pH值调节至3.5，搅拌均匀后在25℃的条件下静置组装10小时。

3. 将组装完成后的胶束溶液取出，向溶液中加入与角蛋白质量比为1:2的双氧水，磁力搅拌10min。在25℃的条件下静置固定8小时，得到经过固定后的自组装纳米胶束。

所制备的纳米复合胶束经扫描电镜观测其形貌见图1。

实施例3

本发明所述的制备自组装蛋白纳米胶束的方法包括下述步骤：

1. 将制备的等电点为3.0的角蛋白配制成浓度为3.5%的角蛋白水溶液，同时将丝素蛋白的稀水溶液的浓度调节至3.5%。

2. 将浓度都为3.5%的丝素蛋白及角蛋白溶液按照体积比3:1混合后搅拌均匀，使用1M的HCL和1M的NaOH将混合溶液的pH值调节至3.5，搅拌均匀后在25℃的条件下静置组装8小时。

3. 将组装完成后的胶束溶液取出，向溶液中加入与角蛋白质量比为1:2的双氧水，磁力搅拌10min。在25℃的条件下静置固定7小时，得到经过固定后的自组装纳米胶束。

所制备的纳米复合胶束经扫描电镜观测其形貌见图1。

实施例4

本发明所述的制备自组装蛋白纳米胶束的方法包括下述步骤：

1. 将制备的等电点为3.0的角蛋白配制成浓度为5%的角蛋白水溶液，同时将丝素蛋白的稀水溶液的浓度调节至5%。

2. 将浓度都为5%的丝素蛋白及角蛋白溶液按照体积比2:1混合后搅拌均匀，使用1M的HCL和1M的NaOH将混合溶液的pH值调节至3.5，搅拌均匀后在25℃的条件下静置组装12小时。

3. 将组装完成后的胶束溶液取出，向溶液中加入与角蛋白质量比为1:2的双氧水，磁力搅拌10min。在25℃的条件下静置固定10小时，得到经过固定后的自组装纳米胶束。

所制备的纳米复合胶束经扫描电镜观测其形貌见图1。

从图1-图4可以看出，丝素蛋白与羊毛角蛋白（pI3.0）所形成的胶束在实施例1、2、3、4中都为球形，且直径都在100nm以下，是一种纳米胶束。此种纳米胶束分散性较好，形貌固定。