具有pH响应性和聚集诱导荧光增强性质的荧光纳米微球及其应用

摘要

一种具有pH响应性和聚集诱导荧光增强性质的荧光纳米微球及其在靶向肿瘤细胞成像中的应用，属于高分子材料技术领域。首先通过无皂乳液聚合方法合成了pH响应性纳米微球，微球表面由分别带有正电和负电性两种单体聚合而成，其中带正电性聚合单体为强电解质，结合带负电性AIE型荧光分子后，实现了荧光分子的聚集诱导荧光增强效应(AIE)；而带负电性聚合单体为弱电解质，在不同pH环境下会发生质子化或去质子化反应，赋予了纳米微球pH响应性。将叶酸分子(FA)通过化学反应修饰到纳米材料表面，实现了靶向癌细胞功能。因此我们合成的FA‑pH响应性荧光探针在体内靶向肿瘤成像和疾病检测等领域具有很广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于高分子材料技术领域，具体涉及一种具有pH响应性和聚集诱导荧光增强性质的荧光纳米微球及其在靶向肿瘤成像和疾病检测中的应用。

背景技术

癌症一直威胁着人类的生命健康，目前最有效的治疗方法是手术切除，但是现阶段医生只能依靠肿瘤组织和正常组织本身形态和颜色的差别来判断病变区域，因此很难彻底切除癌变组织。荧光成像技术通过增加肿瘤组织和正常组织的颜色对比度，帮助医生快速、精准的切除癌变组织，并减少对正常组织的伤害，因此靶向肿瘤组织成像的荧光探针受到人们的广泛关注。

目前纳米材料主要通过两种方法进行靶向：(1)主动靶向：在纳米材料表面修饰上能被细胞特异性识别的分子，如叶酸(FA)、多肽、单克隆抗体和适配体等。其中叶酸被人们广泛使用，主要因为正常组织上的叶酸受体少，而在癌变的肿瘤组织上有较多受体。叶酸能很容易的修饰到诊断或治疗材料上，并且叶酸与细胞上的叶酸受体具有很强的结合力，以达到靶向癌细胞的目的。然而，研究结果表明修饰的靶向配体只能提高细胞对纳米材料的摄取量，并不能提高纳米材料在肿瘤组织处的聚集量，也无法延长纳米材料在肿瘤组织处的滞留时间。(2)被动靶向：利用肿瘤组织特殊微环境的差异使纳米材料在肿瘤组织处聚集，例如低pH或低氧浓度等。肿瘤组织周围血管的内网皮细胞呈无规则排列，内网皮细胞之间的空隙比较大，小尺寸的纳米材料可以通过这些空隙渗透进入肿瘤组织，这种现象称为EPR。然而小尺寸的纳米材料通常会通过血管壁重新返回血管，减少它们在肿瘤组织处的聚集量，大尺寸的纳米材料由于具有低的迁移速率在肿瘤组织处有较长的滞留时间。因此提高荧光探针成像效率和选择性的最有效方法是选择刺激响应性纳米材料为载体并在其表面修饰上靶向分子。刺激响应性纳米材料通过EPR效应进入肿瘤组织，由于肿瘤组织和正常组织的环境差别使纳米材料发生团聚、尺寸变大，从而在肿瘤组织处滞留、聚集，并通过主动靶向快速进入细胞，完成靶向细胞成像的目的。

传统的荧光分子具有聚集导致荧光淬灭效应，合成荧光探针时，只能使用少量的荧光分子以防止浓度淬灭效应。但这并不能彻底的解决这一问题，因为荧光探针通过疏水作用容易在生物大分子表面聚集，使荧光分子局部浓度增加，发生荧光淬灭。并且含有相对少量荧光分子的荧光探针有明显的光漂白现象。AIE型荧光分子很好的解决了这一问题，它在高浓度或聚集态时，荧光增强。基于AIE型的荧光探针，可以通过增加荧光分子的含量增强其荧光信号，降低其光漂白效率。因此设计一个有效载体能实现荧光分子的AIE效应并且能特异性识别肿瘤组织，生物相容性好、生物毒性低，尺寸合适、细胞穿透性好以及防止体内环境对荧光信号产生干扰，在生物成像领域是至关重要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有pH响应性质和聚集诱导荧光增强性质的荧光纳米微球及其在靶向肿瘤成像和疾病检测中的应用。

本发明中，我们设计制备了叶酸修饰的pH响应性荧光纳米微球(FA-pH响应性荧光纳米微球)体系。首先通过无皂乳液聚合方法合成了pH响应性纳米微球，微球表面由分别带有正电和负电性两种单体聚合而成，其中带正电性聚合单体为强电解质，结合带负电性AIE型荧光分子后，实现了荧光分子的聚集诱导荧光增强效应(AIE)；而带负电性聚合单体为弱电解质，在不同pH环境下会发生质子化或去质子化反应，赋予了纳米微球pH响应性。将叶酸分子(FA)通过化学反应修饰到纳米材料表面，实现了靶向癌细胞功能。该种FA-pH响应性荧光纳米微球在正常生理环境pH＝7.4中稳定存在、均匀分散，并具有良好的抗非特异性蛋白吸附的性能和较长的血液循环时间；当pH降低到6.5的肿瘤环境时，FA-pH响应性荧光纳米微球发生聚集，尺寸变大，通过增强渗透滞留效应(EPR)在肿瘤组织处聚集获得被动靶向，并延长其在肿瘤组织处的滞留时间。同时微球表面的叶酸可加速纳米微球主动靶向进入癌细胞。利用库仑力作用结合的FA-pH响应性荧光纳米微球荧光强度高，并具有良好的pH荧光稳定性，优越于利用传统物理吸附或掺杂的方法合成的荧光探针。细胞毒性测试结果表明FA-pH响应性荧光纳米微球具有较低的生物毒性，并且细胞成像实验表明FA-pH响应性荧光纳米微球具有高效的选择性。因此我们合成的FA-pH响应性荧光探针在体内靶向肿瘤成像和疾病检测等领域具有很广泛的应用前景。

本发明所述的具有pH响应性和聚集诱导荧光增强性质的的荧光纳米微球，其由如下步骤制备得到：

(1)量取1.5～5mL聚合单体1分散于50～100mL去离子水中，加入0.125～0.33g聚合单体2和0.057～0.127mL聚合单体3；在室温、氮气保护下，机械搅拌(300～500rpm)20～40min，除去反应体系中的氧气，然后逐渐升温至70～80℃，再加入10mL浓度为0.03～0.05mmol/mL的引发剂水溶液，聚合反应在搅拌下进行8～10h结束，制备得到聚合物纳米微球；通过高速离心(15000～19000rpm)的方法获得纳米微球沉淀，把沉淀重新分散于25～50mL的去离子水中，得到具有pH响应性的聚合物纳米微球乳液；

(2)量取5～10mL步骤(1)所得的乳液，超声分散于5～10mL二甲基亚砜中，然后加入0.0126～0.021g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.024～0.06g的N-羟基琥珀酰亚胺，在低温避光条件下，磁力搅拌反应20～30min；称取0.02～0.05g叶酸分子(FA)溶解于5～10mL二甲基亚砜中，然后加入其中，反应4～6h；通过高速离心(15000～19000rpm)的方法获得沉淀，将沉淀重新分散于10～20mL的去离子水中，得到表面修饰叶酸分子的pH响应性纳米微球乳液，即FA-pH响应性纳米微球；

(3)量取5～10mL上述步骤(2)所得FA-pH响应性纳米微球，量取30～50μL浓度为500μg/mL的AIE型荧光分子水溶液加入到FA-pH响应性纳米微球乳液中；在氮气保护、20～30℃下，磁力搅拌反应4～6h，再通过高速离心(15000～19000rpm)的方法得到荧光纳米微球沉淀，将其重新分散于5～10mL去离子水中，从而获得本发明所述的具有pH响应性和聚集诱导荧光增强性质的靶向肿瘤组织成像的荧光纳米微球。

上述方法中，聚合单体1是苯乙烯(St)、氟代苯乙烯(F-St)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸乙酯、氯乙烯、丙烯酸叔丁酯、二乙烯基苯或α-甲基苯乙烯或甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)；

上述方法中，聚合单体2是N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化铵(VBTAC)、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(DMC)、2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(DPA)或2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐(AMA)；

上述方法中，聚合单体3是丙烯酸(AAc)、甲基丙烯酸(MAAc)、2-乙基丙烯酸；

上述方法中，引发剂是偶氮二异丁脒盐酸盐(V₅₀)，偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐(AIBI)，偶氮异丁氰基甲酰胺(V₃₀)；

上述方法中，AIE型的荧光分子是9,10-二(苯乙烯基)蒽磺酸盐(SDSA)、1,2-二[4-(3-磺酸丙氧基)苯基]-1,2-二苯基乙烯二钠盐(BSTPE)或1,1,2,2-四[4-(3-磺酸丙氧基)苯基]乙烯四钠盐(TSTPE)。

本发明具有以下优点：

1、该FA-pH响应性荧光纳米微球合成方法简单，合成的纳米微球尺寸均一、单分散性好(图1)；

2、该纳米微球具有pH响应性，调节聚合单体2和聚合单体3的比例，可以获得不同pH响应范围的聚合物纳米微球(图2)；

3、pH响应性荧光纳米微球具有优良的聚集诱导荧光增强AIE效应，当荧光分子复合到聚合物微球上，其荧光强度比复合前增强了70倍(图3)；

4、荧光纳米微球具有优良的pH响应性，在正常生理环境pH＝7.4中能稳定存在、均匀分散，粒径保持在50～150nm(图4)，使其具有较长的血液循环时间，适用于进行体内细胞成像。

5、pH响应性荧光纳米微球在肿瘤组织pH＝6.5环境时发生聚集、尺寸变大至500～1200nm，防止纳米微球再次进入血管(图4)，实现被动靶向癌细胞；同时微球表面修饰的叶酸分子可以主动靶向癌细胞和荧光成像。

6、FA-pH响应性荧光纳米微球在pH＝4-8范围内具有良好的荧光稳定性(图5)。

7、该FA-pH响应性荧光纳米微球具有较低的生物毒性，利于其生物应用(图6)。

9、该FA-pH响应性荧光纳米微球具有优良的靶向肿瘤细胞成像功能(图7)。

附图说明

图1：为实施例1制备的pH响应性纳米微球扫描电子显微镜照片(SEM)，微球粒径约为50nm；

图2：为实施例1制备的pH响应性纳米微球在不同pH环境下的表面电势；

图3：为实施例1制备的FA-pH响应性荧光纳米微球与荧光分子复合前后荧光谱图(荧光分子浓度相同，λex＝420nm)，表明复合后荧光强度增强约70倍，显示AIE效应；

图4：为实施例1制备的pH响应性纳米微球在不同pH环境下动态光散射粒径图，表明在pH＝7.4时粒径约为65nm，而在pH＝6.5下粒径约为680nm发生聚集；

图5：为实施例1制备的FA-pH响应性荧光纳米微球在不同pH磷酸缓冲溶液下的荧光谱图，表明微球在不同pH条件下具有荧光稳定性；

图6：为实施例1制备的FA-pH响应性荧光纳米微球对人肾上皮细胞(293T)和子宫颈癌细胞(HeLa)的细胞毒性测试图，细胞存活率均大于90％，表明聚合物微球具有较低毒性；

图7：为实施例1制备的FA-pH响应性荧光纳米微球与人肾上皮细胞(293T)和子宫颈癌细胞(HeLa)分别共培养4h、8h和12h的荧光共聚焦荧光场照片表明微球能靶向癌细胞和荧光成像。

具体实施方式

实施例1：

(1)量取5mL苯乙烯(分析纯，经减压蒸馏除去阻聚剂)分散于100mL去离子水中，加入0.167g N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化铵(VBTAC)和0.113mL的丙烯酸(AAc)。在室温、氮气保护下，机械搅拌(400rpm)30min，除去反应体系中的氧气。然后逐渐升温至70℃，加入10mL浓度为0.037mmol/mL的偶氮二异丁脒盐酸盐水溶液，引发聚合，反应在氮气保护下进行8h结束，获得聚合物纳米微球。通过高速离心(18900rpm)的方法获得沉淀，把沉淀的纳米微球重新分散于50mL的去离子水中，得到具有pH响应性的聚合物纳米微球乳液。

(2)量取5mL步骤(1)所得的乳液，加入5mL二甲基亚砜，超声10min。乳液在二甲基亚砜中均匀分散后，加入0.0126g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.036g的N-羟基琥珀酰亚胺，在低温避光条件下，磁搅拌30min。称取0.03g叶酸分子溶解于5mL二甲基亚砜中，然后加入上述纳米微球乳液中，反应6h。通过高速离心(18900rpm)的方法获得沉淀，将沉淀重新分散于10mL的去离子水中，得到表面修饰叶酸分子的pH响应性纳米微球(FA-pH响应性纳米微球)。

(3)量取5mL上述步骤(2)所得的FA-pH响应性纳米微球，量取50μL浓度为500μg/mL的AIE型荧光分子SDSA水溶液加入到上述微球乳液中。在氮气保护、30℃下，磁力搅拌反应4h。通过高速离心的方法获得沉淀，将得到的荧光纳米微球沉淀重新分散于5mL，从而获得本发明所述的具有pH响应性和聚集诱导荧光增强性质的靶向肿瘤组织成像的荧光纳米微球。

从纳米微球扫描电子显微镜照片(图1)可以看出纳米微球尺寸为50nm，尺寸均一、单分散性好。通过动态光散射(DLS)测得纳米微球在不同pH环境下的表面电势(图2)，从图中可以看出我们设计的纳米微球具有pH响应性，随着pH的升高纳米微球表面由正电性变成负电性，pH＝6左右为其等电点，纳米微球在pH＝6.5环境下的表面电势为-8.57mV，在pH＝7.4环境下的表面电势为-19mV。制备的FA-pH响应性荧光纳米微球与荧光分子复合前后荧光谱图(图3)结果表明，荧光分子复合到聚合物纳米微球后其荧光强度比复合前增强约70倍，显示聚集诱导荧光增强的AIE效应。通过动态光散射粒度分析仪测得pH响应性纳米微球在pH＝7.4环境下的水合半径为65nm，在pH＝6.5环境下的水合半径为683nm(图4)。以上结果表明此pH响应性纳米颗粒在正常生理环境(pH＝7.4)下表面显示负电性、均匀分散，在癌组织微酸性环境(pH＝6.5)下负电性减弱、发生聚集，这种特性使纳米微粒能通过增强渗透滞留效应(EPR)特异性地在肿瘤组织聚集，并延长其在肿瘤组织处的滞留时间，获得被动靶向癌细胞功能。叶酸分子(FA)通过化学反应修饰到pH响应性纳米微球表面，获得主动靶向癌细胞功能。测试了FA-pH响应性荧光纳米微球在不同生物环境下的荧光稳定性，当荧光纳米微球在不同的pH磷酸缓冲溶液中时，荧光强度并没有明显的变化(图5)，因此FA-pH响应性荧光纳米微球具有良好的荧光稳定性，降低了生物体内环境对其成像信号的干扰。细胞毒性测试结果显示FA-pH响应性荧光纳米微球存在下，细胞存活率大于90％，表明具有较低的生物毒性(图6)。FA-pH响应性纳米微球利用正常组织和肿瘤组织的pH差别，特异性地在肿瘤组织处聚集，并通过叶酸和细胞表面受体的作用快速地进入细胞，因此其可作为载体帮助荧光分子和其它功能型分子在肿瘤组织处聚集，提高对癌症诊断和治疗的效果。

实施例2：

(1)量取5mL苯乙烯(分析纯，经减压蒸馏除去阻聚剂)分散于100mL去离子水中，加入0.125g N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化铵(VBTAC)和0.127mL的丙烯酸(AAc)。在室温、氮气保护下，机械搅拌(400rpm)30min，除去反应体系中的氧气。然后逐渐升温至70℃，加入10mL浓度为0.037mmol/mL的偶氮二异丁脒盐酸盐水溶液，引发聚合。反应在氮气保护下进行8h结束，获得聚合物纳米微球。通过高速离心(18000rpm)的方法得到沉淀，把沉淀的纳米微球重新分散于50mL的去离子水中，得到具有pH响应性的聚合物纳米微球乳液。

我们发现此实验中合成的pH响应性纳米微球和实施例1中合成的pH响应性纳米微球性质相似，但其pH响应范围略有变化，调整到pH5.0～6.5。为了获得pH响应性纳米微球，在聚合过程中我们选用了含有季铵盐的强电解质聚合单体三甲基乙烯苄基氯化铵(VBTAC)和含有羧酸根的弱电解质聚合单体丙烯酸(AAc)。羧酸根为弱电解质，在不同pH环境下羧酸根会发生质子化或去质子化反应，赋予了纳米微球pH响应性。因此当AAc的含量发生变化时，其发生质子化或去质子化时所需酸和碱的量也发生变化，导致其pH响应范围发生变化。实施例2中AAc的含量比实施例1的高，达到等电点时所需反应的羧酸根数量比实施例1多，质子化所需酸的量比实施例1多，因此实施例2的等电点比实施例1小。

实施例3：

(1)量取5mL苯乙烯(分析纯，经减压蒸馏除去阻聚剂)分散于100mL去离子水中，加入0.25g N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化铵(VBTAC)和0.085mL的丙烯酸(AAc)。在室温、氮气保护下，机械搅拌(400rpm)30min，除去反应体系中的氧气。然后逐渐升温至70℃，加入10mL浓度为0.037mmol/mL的偶氮二异丁脒盐酸盐水溶液，引发聚合。反应在氮气保护下进行8h结束，制备得到聚合物纳米微球。通过高速离心(18900rpm)的方法获得沉淀，把沉淀的纳米微球重新分散于50mL的去离子水中，得到具有pH响应性的聚合物纳米微球乳液。

我们发现此实验中合成的pH响应性纳米微球和实施例1中合成的pH响应性纳米微球性质相似，但其pH响应范围略有升高，为pH＝6.0～8。为了获得pH响应性纳米微球，在聚合过程中我们选用了含有季铵盐的强电解质聚合单体三甲基乙烯苄基氯化铵(VBTAC)和含有羧酸根的弱电解质聚合单体丙烯酸(AAc)。羧酸根为弱电解质，在不同pH环境下羧酸根会发生质子化或去质子化反应，赋予了纳米微球pH响应性。因此当AAc的含量发生变化时，其发生质子化或去质子化时所需酸和碱的量也发生变化，导致其pH响应范围发生变化。实施例3中AAc的含量比实施例1的低，达到等电点时所需反应的羧酸根数量比实施例1少，质子化所需酸的量比实施例1少，因此实施例3的等电点比实施例1大。