用于基因组编辑的CRISPR‑CAS系统和组合物的递送、用途和治疗应用

摘要

本发明提供了用于操纵靶序列的序列和/或活性的系统、方法和组合物的递送、工程化和优化。提供了递送系统和被靶向作为用于递送的部位的组织或器官。还提供了载体和载体系统以及用于设计和使用此类载体的方法，其中这些载体和载体系统中的一些编码CRISPR复合物的一种或多种组分。还提供了指导在真核细胞中形成CRISPR复合物的方法，以确保对于靶标识别的增强特异性和避免毒性，并且以编辑或修饰在感兴趣基因组座位中的靶位点以便改变或改善疾病或病症的状态。

说明书

相关应用和引用参考

本申请要求各自提交于2013年12月12日的美国临时专利申请61/915,176；61/915,192；61/915,215；61/915,107；61/915,145；61/915,148；和61/915,153的权益。

前述申请、以及在其中或在它们的审查程序期间引用的所有文献或(“申请引用文献”)以及在这些申请引用文献中引用或参考的所有文献、以及在本文中引用或参考的所有文献(“本文引用的文献”)、在本文中引用的文献中引用或参考的所有文献，连同针对在本文中提及或通过引用结合在本文中的任何文献中的任何产品的任何制造商的说明书、说明、产品规格、和产品表，特此通过引用并入本文，并且可以在本发明的实践中采用。更具体地说，所有参考的文献均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的文献被确切地并单独地指明通过引用而并入本文。

发明领域

本发明总体上涉及用于控制涉及序列靶向的基因表达的系统、方法、和组合物的递送、工程化、优化和治疗应用，该序列靶向例如涉及规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)及其组分的基因组干扰或基因编辑。具体而言，本发明涉及用于递送CRISPR-Cas系统以在动物(包括哺乳动物)体内经由基因组编辑实现治疗益处的体外、离体和/或体内系统、方法和组合物。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在由美国国立卫生研究院颁发的NIH先锋奖(Pioneer Award)(1DP1MH100706)以及同样由美国国立卫生研究院提供的基金1DP1OD009552的政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。

发明背景

在基因组测序技术和分析方法中的最新进展显著加速了对与范围广泛的生物功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。精确的基因组靶向技术对于通过允许个体遗传元件的选择性干扰而使得因果性遗传变异的统性逆向工程成为可能、以及推进合成生物学、生物技术应用、和医学应用是需要的。虽然基因组编辑技术，如设计师锌指(ZFN)、转录激活子样效应因子(TALE)、或归巢大范围核酸酶(homing meganuclease)对于产生靶向的基因组干扰是可得的，但是仍然需要负担得起的、易于建立的、可扩展的、并且便于靶向真核基因组内的多个位置的新的基因组工程技术。

发明概述

尽管在药物开发中提出了有效的治疗假设并且做出了强有力的努力，但是使用小分子治疗具有强遗传贡献的疾病仅取得了数目有限的成功。因此，迫切需要能够修饰受疾病影响的细胞和组织内的核酸的治疗策略的具替代性且稳健的系统。将CRISPR-Cas系统加入治疗性基因组工程化方法的组库中显著简化了方法学并且加速了对与范围广泛的生物功能和疾病相关的遗传因子进行编目和映射，开发遗传疾病的动物模型以及开发安全的、有效的治疗替代方案的能力。为了有效而无有害作用地利用CRISPR-Cas系统用于基因组编辑，了解这些基因组工程工具的工程化、优化和细胞类型/组织/器官特异性递送等方面是至关重要的，这些方面是所要求的本发明方面。本发明的多个方面着手解决这种需要并且提供了相关优点。

示例性CRISPR复合物可以包括与指导序列复合的CRISPR酶(例如，Cas9)，该指导序列与靶多核苷酸内的靶序列杂交。该指导序列与tracr配对序列连接，该tracr配对序列进而与tracr序列杂交。申请人已经优化了CRISPR-Cas基因组工程化系统的组分，包括使用来自金黄色葡萄球菌的SaCas9。不同递送手段可以用于将CRISPR-Cas系统的组分离体和/或体内地递送至细胞、组织和器官。申请人已经将CRISPR-Cas系统组分(例如，包含SaCas9)有效地包装进病毒递送载体(例如，AAV)中，并且已经证明它可以用于体内地修饰哺乳动物细胞中的内源基因组序列。申请人发明的关键特征在于它有效地解决了(治疗组分的)体内递送效率低和同源定向修复(HDR)效率低的挑战，并且具体而言，与共递送相关联的挑战通过小Cas9(来自金黄色葡萄球菌的SaCas9)得到了解决，该小Cas9可以被容易地包装进单个腺相关病毒(AAV)载体中来表达Cas9蛋白及其相应的一种或多种sgRNA两者。此外，重要的是，申请人已经表明引入小SaCas9已经将进行HDR所需的病毒载体数目从3个载体降至2个载体。在本发明的方面中，粒子可以用于递送CRISPR-Cas系统的一种或多种组分。并且有待接触的粒子的数目可以是一或二。在一方面，本发明提供了使用CRISPR-Cas系统的一个或多个元件的方法。本发明的CRISPR复合物为修饰基因组座位中的靶多核苷酸提供了有效手段，其中该基因组座位与突变相关，包括与异常蛋白质表达或与疾病状况或状态相关联的突变。本发明的CRISPR复合物具有多种多样的实用性，包括修饰(例如，缺失、插入、转位、失活、激活)基因组座位内的靶多核苷酸，包括这样的靶座位的编码、非编码或调节元件内的靶多核苷酸。正因为如此，本发明的CRISPR复合物在例如基因或基因组编辑、基因治疗、药物发现、药物筛选、疾病诊断、以及预后中具有广阔的应用谱。本发明的方面涉及在具备具有优化活性的指导RNA的CRISPR-Cas9系统中的、具有改进的靶向特异性的、在长度上小于野生型Cas9酶的Cas9酶和编码它的核酸分子、和嵌合的Cas9酶、以及改进Cas9酶的靶特异性或设计CRISPR-Cas9系统的方法，所述方法包括设计或制备具有优化活性的指导RNA和/或选择或制备具有比野生型Cas9更小的尺寸或长度的Cas9酶，由此将编码它的核酸包装到更高级的递送载体(因为在该递送载体中对它的编码少于野生型Cas9)中，和/或产生嵌合Cas9酶。还提供了本发明的序列、载体、酶或系统在医学中的用途。还提供了它们在基因或基因组编辑中的用途。

在本发明中，该Cas酶可以是野生型Cas9，包括任何天然存在的细菌Cas9。Cas9直向同源物典型地共享3-4个RuvC结构域和一个HNH结构域的通用结构。最5’的RuvC结构域切割非互补链，而HNH结构域切割互补链。所有符号都是就指导序列而言的。在5’RuvC结构域中的催化残基是通过该感兴趣的Cas9与其他Cas9直向同源物(来自化脓链球菌II型CRISPR位点、嗜热链球菌CRISPR位点1、嗜热链球菌CRISPR位点3、以及凶手弗朗西斯菌(Franciscilla novicida)II型CRISPR位点)的同源性比较而鉴定的，并且保守性Asp残基(D10)被突变为丙氨酸以将Cas9转化成互补链切口酶。类似地，在HNH结构域中的保守性His和Asn残基被突变为丙氨酸以将Cas9转化为非互补链切口酶。在一些实施例中，这两组突变都可以进行，将Cas9转化为非切割酶。因此，该Cas酶可以是野生型Cas9，包括任何天然存在的细菌Cas9。该CRISPR、Cas或Cas9酶可以针对人类细胞(包括特定类型的人类细胞)进行密码子优化，或是修饰形式，包括任何嵌合体、突变体、同源物或直向同源物。在本发明的另外方面，Cas9酶可以包含一个或多个突变，并且可以用作具有或不具有与功能结构域融合的通用DNA结合蛋白。这些突变可以是人工引入的突变或获得性和丢失性功能突变。这些突变可以包括但不限于分别在RuvC和HNH催化结构域中的催化结构域(D10和H840)之一中的突变。已经表征了其他的突变。在本发明的一个方面，该转录激活结构域可以是VP64。在本发明的其他方面，该转录阻遏物结构域可以是KRAB或SID4X。本发明的其他方面涉及融合到结构域上的突变的Cas 9酶，这些结构域包括但不限于，转录激活剂、阻遏物、重组酶、转座酶、组蛋白重塑剂(histone remodeler)、脱甲基酶、DNA甲基转移酶、隐花色素、光可诱导/可控制结构域或化学可诱导/可控制结构域。本发明可以涉及允许增强这些RNA在细胞中的性能的sgRNA或tracrRNA或指导序列或嵌合指导序列。该CRISPR酶可以是I型或III型CRISPR酶，优选II型CRISPR酶。这种II型CRISPR酶可以是任何Cas酶。优选的Cas酶可以被鉴定为Cas9，因为这可以是指与来自II型CRISPR系统的具有多个核酸酶结构域的最大核酸酶共享同源性的酶的通用类别。最优选地，该Cas9酶来自或衍生自spCas9或saCas9。关于衍生，申请人意指该衍生的酶在很大程度上是基于与野生型酶具有高度序列同源性的含义，但是如本文所述它在某些方面已经被突变(修饰)。

应当理解的是，术语Cas和CRISPR酶在本文中通常可互换地使用，除非另外说明。如上提及的，在本文中使用的许多残基编号是指来自化脓链球菌中的II型CRISPR座位的Cas9酶。然而，应当理解的是，本发明包括更多的来自其他微生物物种的Cas9，如SpCas9、SaCas9、St1Cas9等等。在本文中提供了另外的实例。熟练的技术人员将能够通过比较相关氨基酸序列而确定在除了SpCas9之外的Cas9酶中的适当的相应残基。因此，在特异性氨基酸置换是指使用SpCas9编号的情况下，那么，除非上下文清楚说明，这并不预期是指其他Cas9酶，本披露预期涵盖在其他Cas9酶中的相应修饰。本文中提供了在这种情形下针对人类进行优化(即，针对在人类中表达进行优化)的密码子优化序列的实例，参见SaCas9人类密码子优化序列。在这被优化的同时，应当理解其他实例是可能的并且针对宿主物种的密码子优化是已知的。本发明包括其中该Cas9是嵌合Cas9蛋白的方法。这些方法可以包括一种Cas9同源物的一个或多个N末端片段与一种或多种其他或另一种Cas9同源物的一个或多个C末端片段。应当理解的是，在本发明的方法中，在该生物是动物的情况下，该修饰可以离体地或在体外例如在细胞培养物中进行，并且在一些情况下不在体内进行。在其他实施例中，可以在体内进行。在一些实施例中，本发明包括本发明的组合物或其CRISPR酶(包括或可替代地是编码CRISPR酶的mRNA)，其中该靶序列在其3’端的侧翼为PAM(原型间隔子邻近基序)序列，该PAM序列包含5’-基序，尤其是在Cas9是(或衍生自)化脓链球菌或金黄色葡萄球菌Cas9的情况下。例如，适合的PAM是针对SpCas9或SaCas9酶(或衍生的酶)的5’-NRG或5’-NNGRR(其中N是任何核苷酸)。应当理解的是，SpCas9或SaCas9是来自或衍生自化脓链球菌或金黄色葡萄球菌Cas9的那些。

在一个方面，本发明提供了通过操纵感兴趣的基因组座位中的靶序列来修饰生物或非人类生物的方法，其中该基因组座位与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关，该方法包括：

递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：

A)I.CRISPR-Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列包含：

(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，

(b)tracr配对序列，和

(c)tracr序列，以及

II.编码CRISPR酶的多核苷酸序列，该CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列，

其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且编码CRISPR酶的多核苷酸序列是DNA或RNA；并且

该方法还可以任选地包括递送HDR模板，例如经由病毒递送载体或粒子，其中该HDR模板提供该蛋白的正常或较不异常形式的表达；其中“正常”是就野生型而论，并且“异常”是引起病症或疾病状态的蛋白质表达；并且

任选地该方法可以包括从该生物或非人类生物分离或获得表达所述异常蛋白的细胞，任选地扩增该细胞群，使一种或多种病毒载体或粒子与所述细胞进行接触以获得修饰的细胞群，任选地扩增该修饰的细胞群，并且任选地向该生物或非人类生物给予修饰的细胞。

在一个方面，本发明提供了通过操纵感兴趣的基因组座位中的靶序列来修饰生物或非人类生物的方法，其中该感兴趣的基因组座位与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关，该方法包括：使细胞与含有非天然存在的或工程化的组合物接触，该组合物包含：I.(a)指导序列，该指导序列能够杂交到HSC中的靶序列上、和(b)至少一种或多种tracr配对序列；II.CRISPR酶，任选地具有一个或多个NLS；以及III.包含tracr序列的多核苷酸序列，其中该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶；并且

该方法还可以任选地包括递送HDR模板，例如经由病毒递送载体或粒子，其中该HDR模板提供该蛋白的正常或较不异常形式的表达；其中“正常”是就野生型而论，并且“异常”是引起病症或疾病状态的蛋白质表达；并且

任选地该方法可以包括从该生物或非人类生物分离或获得表达所述异常蛋白的细胞，任选地扩增该细胞群，使一种或多种病毒载体或粒子与所述细胞进行接触以获得修饰的细胞群，任选地扩增该修饰的细胞群，并且任选地向该生物或非人类生物给予修饰的细胞。

可以递送编码任何一种或多种或所有CRISPR-复合物的一种或多种多核苷酸，这一种或多种多核苷酸有利地连接至一个或多个调节元件用于例如经由一种或多种粒子在体内表达，这一种或多种粒子包含含有可操作地连接至这一个或多个调节元件的一种或多种多核苷酸的载体。编码CRISPR酶的多核苷酸序列、指导序列、tracr配对序列或tracr序列的任一者或全部可以是RNA。应当理解的是，在提及作为RNA并且被认为‘包含‘这样tracr配对序列的特征的多核苷酸的情况下，该RNA序列包括该特征。在该多核苷酸是DNA并且被认为包含这样tracr配对序列的特征的情况下，该DNA序列被或者可以被转录成包括该讨论中的特征的RNA。在该特征是蛋白质的情况下，如CRISPR酶，所提及的该DNA或RNA序列被或者可以被翻译(以及在DNA首先被转录的情况下)。

在某些实施例中，本发明提供了通过操纵感兴趣的基因组座位中的靶序列来修饰生物(例如，哺乳动物，包括人类)或非人类哺乳动物或生物的方法，例如其中该感兴趣的基因组座位与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关，该方法包括递送非天然存在的或工程化的组合物，例如经由与细胞或细胞群接触，其中该组合物包含一种或多种递送载体或粒子，该一种或多种递送载体或粒子包含一种或多种病毒、质粒或核酸分子载体(例如RNA)，该一种或多种病毒、质粒或核酸分子载体(例如RNA)可操作地编码用于其表达的组合物，其中该非天然存在的或工程化的组合物包含：I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一个CRISPR-Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含(a)一个能够杂交到真核细胞中的靶序列上的指导序列，(b)tracr配对序列，和(c)tracr序列，以及II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列上，该CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列(或者任选地至少一个或多个核定位序列，因为在一些实施例中可能不涉及NLS)，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，或者(B)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统含有一种或多种载体，该一种或多种载体包含I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到(a)能够杂交到真核细胞中的靶序列上的指导序列、和(b)至少一种或多种tracr配对序列，II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列上，以及III.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接到tracr序列上，其中组分I、II和III位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶。该方法还可以任选地包括递送HDR模板，例如经由接触该细胞或细胞群的递送载体或粒子，或使该细胞或细胞群与另一种含有该HDR模板的递送载体或粒子接触，其中该HDR模板提供该蛋白的正常或较不异常形式的表达；其中“正常”是就野生型而论，并且“异常”是引起病症或疾病状态的蛋白质表达；并且任选地该方法可以包括从该生物或非人类生物分离或获得表达所述异常蛋白的细胞，任选地扩增该细胞群，使一种或多种递送载体或粒子与表达所述异常蛋白的所述细胞进行接触以获得修饰的细胞群，任选地扩增该修饰的细胞群，并且任选地向该生物或非人类生物给予修饰的细胞。在一些实施例中，组分I、II和III位于相同载体上。在其他实施例中，组分I和II位于相同载体上，而组分III位于另一种载体上。在其他实施例中，组分I和III位于相同载体上，而组分II位于另一种载体上。在其他实施例中，组分II和III位于相同载体上，而组分I位于另一种载体上。在其他实施例中，组分I、II和III各自位于不同的载体上。本发明还提供了如本文所述的病毒或质粒载体系统。

通过操纵靶序列，申请人还打算靶序列的表观遗传操纵。这可以是靶序列的染色质状态的操纵，如借助于修饰靶序列的甲基化状态(即，甲基化或甲基化模式或CpG岛的添加或去除)、组蛋白修饰，从而增加或降低靶序列的可及性，或者借助于3D折叠。应当理解的是，在提及一种通过操纵在感兴趣的基因组座位中的靶序列来修饰一种生物或哺乳动物(包括人类或非人类哺乳动物或生物)的方法的情况下，这可适用于作为整体的生物(或哺乳动物)或者仅仅是来自这种生物的单个细胞或细胞群(如果该生物是多细胞的话)。在人类的情况下，例如，申请人特别地设想到单个细胞或细胞群，并且这些细胞可以优选地进行离体修饰，进而重新引入。在这种情况下，活组织检查或其他组织或生物流体样品可以必要的。在这方面，干细胞也是特别优选的。但是，当然还设想了体内实施例。并且，本发明对眼细胞、视网膜细胞、血管细胞、上皮细胞、内皮细胞和耳蜗细胞而言是尤其有利的。

在一些实施例中，本发明包括一种通过操纵细胞或细胞群中的感兴趣的基因组座位中的DNA双链体的相对链上的第一靶序列和第二靶序列来修饰生物或非人类生物的方法，例如其中该感兴趣的基因组座位与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关，该方法包括例如通过使该细胞或细胞群与递送载体接触来递送，例如包含非天然存在的或工程化的组合物的病毒载体或粒子，该组合物包含：

I.第一CRISPR-Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列，其中该第一多核苷酸序列包含：

(a)第一指导序列，该第一指导序列能够杂交到该第一靶序列上，

(b)第一tracr配对序列，和

(c)第一tracr序列，

II.第二CRISPR-Cas系统chiRNA多核苷酸序列，其中该第二多核苷酸序列包含：

(a)第二指导序列，该第二指导序列能够杂交到该第二靶序列上，

(b)第二tracr配对序列，和

(c)第二tracr序列，并且

III.编码CRISPR酶的多核苷酸序列，该CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列并且包含一个或多个突变，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列；或者

IV.I.至III.中的一者或多者(例如，该第一tracr配对序列和该第二tracr配对序列)的一种或多种表达产物，该CRISPR酶；

其中当转录时，该第一tracr配对序列和该第二tracr配对序列分别杂交到该第一tracr序列和第二tracr序列上并且该第一指导序列和该第二指导序列分别指导第一CRISPR复合物和第二CRISPR复合物与该第一靶序列和第二靶序列的序列特异性结合，其中该第一CRISPR复合物包含与(1)杂交到该第一靶序列上的第一指导序列、和(2)杂交到该第一tracr序列上的第一tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中该第二CRISPR复合物包含与(1)杂交到该第二靶序列上的第二指导序列、和(2)杂交到该第二tracr序列上的第二tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中编码CRISPR酶的多核苷酸序列是DNA或RNA，并且其中该第一指导序列指导邻近该第一靶序列的DNA双链体的一条链的切割并且该第二指导序列指导邻近该第二靶序列的另一条链的切割，从而诱导双链断裂，由此修饰该生物或该非人类生物；并且该方法还可以任选地包括递送HDR模板，例如经由递送载体接触含有该HDR模板的该细胞或细胞群，或使该细胞或细胞群与另一种含有该HDR模板的递送载体接触，其中该HDR模板提供该蛋白的正常或较不异常形式的表达；其中“正常”是就野生型而论，并且“异常”是引起病症或疾病状态的蛋白质表达；并且任选地，该方法可以包括从该生物或非人类生物分离或获得细胞或细胞群，任选地扩增该细胞群，使一种或多种递送载体或粒子与该细胞或细胞群进行接触以获得修饰的细胞群，任选地扩增该修饰的细胞群。一种为与真核生物或非人类生物中的基因组座位相关的疾病建模的方法，包括操纵所述基因组座位的编码、非编码或调节元件内的靶序列，包括递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含病毒载体系统，该载体系统包含一种或多种病毒载体，该一种或多种病毒载体可操作地编码用于其表达的组合物，其中该非天然存在的或工程化的组合物包含：

(A)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含

I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含

(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，

(b)tracr配对序列，和

(c)tracr序列，以及

II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码SaCas9的酶编码序列上，该SaCas9任选地包含至少一个或多个核定位序列，

其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，

其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的SaCas9，

或者

(B)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含

I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至

(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，和

(b)至少一种或多种tracr配对序列，

II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码SaCas9的酶编码序列，以及

III.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至tracr序列，

其中组分I、II和III位于该系统的相同或不同载体上，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的SaCas9，并且任选地向该生物或非人类生物给予修饰的细胞。在本发明的一些方法中，编码CRISPR酶的多核苷酸序列、该第一和第二指导序列、该第一和第二tracr配对序列或该第一和第二tracr序列中的任一者或全部是RNA。在本发明另外的实施例中，编码CRISPR酶的编码序列的多核苷酸、该第一和第二指导序列、该第一和第二tracr配对序列或该第一和第二tracr序列是RNA，并且是经由脂质体、纳米粒子、外泌体、微囊泡、或基因枪递送的；但是，有利的是经由病毒载体或粒子递送。在本发明的某些实施例中，该第一和第二tracr配对序列共享100％的一致性和/或该第一和第二tracr序列共享100％的一致性。在一些实施例中，这些多核苷酸可以被包含在含有一种或多种载体的载体系统中。在本发明的优选实施例中，该CRISPR酶是一种Cas9酶，例如SpCas9或SaCas9。在本发明的一个方面，该CRISPR酶在催化结构域中包含一个或多个突变，其中关于SpCas9，这一个或多个突变选自下组，该组由以下各项组成：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和D986A，例如D10A突变。在优选的实施例中，该第一CRISPR酶具有一个或多个突变，使得该酶是一种互补链切口酶，并且该第二CRISPR酶具有一个或多个突变，使得该酶是一种非互补链切口酶。可替代地，该第一酶可以是一种非互补链切口酶，而该第二酶可以是一种互补链切口酶。在本发明的优选方法中，该第一指导序列引导邻近该第一靶序列的DNA双链体的一条链的切割并且该第二指导序列引导邻近该第二靶序列的另一条链的切割从而产生5’突出端。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至多200个碱基对、优选至多100个碱基对、或更优选至多50个碱基对。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至少26个碱基对、优选至少30个碱基对、或更优选34-50个碱基对。

关于CRISPR酶的突变，当该酶不是SpCas9时，可以在相应于SpCas9的位置10、762、840、854、863和/或986的任何或所有残基处进行突变(其可以例如通过标准序列比较工具进行确定)。具体地说，在SpCas9中的任何或所有下列突变是优选的：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和/或D986A；并且还设想了这些置换氨基酸中的任何的保守性取代。在一个方面，本发明提供了关于本文论述的任何或各个或所有实施例，其中该CRISPR酶包含至少一个或多个、或至少两个或更多个突变，其中该至少一个或多个突变或该至少两个或更多个突变是关于根据SpCas9蛋白的D10、E762、H840、N854、N863、或D986，例如，关于SpCas9的D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和/或D986A，或根据SaCas9的N580，例如，关于SaCas9的N580A，或Cas9的直向同源物中与Sp或Sa对应的任何一个或多个突变，或该CRISPR酶包含至少一个突变，其中至少关于Sp Cas9的H840或N863A或关于Sa Cas9的N580A是突变的；例如，其中该CRISPR酶包含H840A、或D10A和H840A、或D10A和N863A，根据SpCas9蛋白，或Cas9的直向同源物中与Sp蛋白或Sa蛋白对应的任何一个或多个突变。

在一些实施例中，本发明包括一种通过操纵细胞或细胞群中的感兴趣的基因组座位中的DNA双链体的相对链上的第一靶序列和第二靶序列来修饰生物或非人类生物的方法，例如其中该感兴趣的基因组座位与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关，该方法包括例如通过使该细胞或细胞群与一种或多种包含非天然存在的或工程化的组合物的递送载体接触来递送，该组合物包含：

I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至

(a)第一指导序列，该第一指导序列能够杂交到该第一靶序列上，和

(b)至少一种或多种tracr配对序列，

II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至

(a)第二指导序列，该第二指导序列能够杂交到该第二靶序列上，和

(b)至少一种或多种tracr配对序列，

III.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至编码CRISPR酶的酶编码序列，以及

IV.第四调节元件，该第四调节元件可操作地连接至tracr序列，

V.I.至IV.中的一者或多者(例如，该第一tracr配对序列和该第二tracr配对序列)的一种或多种表达产物，该CRISPR酶；

其中组分I、II、III和IV位于该系统的相同或不同载体上，在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该第一和第二指导序列分别指导第一和第二CRISPR复合物与该第一和第二靶序列的序列特异性结合，其中该第一CRISPR复合物包含与(1)杂交到该第一靶序列上的第一指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中该第二CRISPR复合物包含与(1)杂交到该第二靶序列上的第二指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中编码CRISPR酶的多核苷酸序列是DNA或RNA，并且其中该第一指导序列指导邻近该第一靶序列的DNA双链体的一条链的切割，并且该第二指导序列指导邻近该第二靶序列的另一条链的切割，从而诱导双链的断裂，由此修饰该生物或非人类生物；并且该方法还可以任选地包括递送HDR模板，例如经由的递送载体或粒子接触含有该HDR模板的细胞或细胞群，或使细胞或细胞群与另一种含有该HDR模板的粒子接触，其中该HDR模板提供该蛋白的正常或较不异常形式的表达；其中“正常”是就野生型而论，并且“异常”是引起病症或疾病状态的蛋白质表达；并且任选地该方法可以包括从该生物或非人类生物分离或获得细胞或细胞群，任选地扩增这些细胞，使一种或多种递送载体或粒子与该细胞或细胞群进行接触以获得修饰的细胞群，任选地扩增该修饰的细胞群，并且任选地向该生物或非人类生物给予修饰的HSC。

本发明还提供了如本文所述的载体系统。该系统可以包含一种、二种、三种或四种不同的载体。组分I、II、III和IV因此可以被定位在一种、两种、三种或四种不同的载体上，并且在此设想了针对这些组分的可能位置的所有组合，例如：组分I、II、III和IV可以位于相同载体上；组分I、II、III和IV可以各自位于不同的载体上；组分I、II、III和IV可以位于总计两种或三种不同载体上，其中设想了位置的所有组合，等。在本发明的一些方法中，编码CRISPR酶的多核苷酸序列、该第一指导序列和该第二指导序列、该第一tracr配对序列和该第二tracr配对序列或该第一tracr序列和该第二tracr序列中的任一者或全部是RNA。在本发明另外的实施例中，该第一和第二tracr配对序列共享100％的一致性和/或该第一和第二tracr序列共享100％的一致性。在本发明的优选实施例中，该CRISPR酶是一种Cas9酶，例如SpCas9。在本发明的一个方面，该CRISPR酶在催化结构域中包含一个或多个突变，其中关于SpCas9，这一个或多个突变选自下组，该组由以下各项组成：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和D986A；例如，D10A突变。在优选的实施例中，该第一CRISPR酶具有一个或多个突变，使得该酶是一种互补链切口酶，并且该第二CRISPR酶具有一个或多个突变，使得该酶是一种非互补链切口酶。可替代地，该第一酶可以是一种非互补链切口酶，而该第二酶可以是一种互补链切口酶。在本发明的一个另外的实施例中，这些病毒载体的一种或多种可以经由脂质体、纳米粒子、外泌体、微囊泡、或基因枪进行递送；但是，病毒递送或粒子递送是有利的。

在本发明的优选方法中，第一指导序列指导邻近该第一靶序列的DNA双链体的一条链的切割并且第二指导序列指导邻近该第二靶序列的另一条链的切割从而产生5’突出端。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至多200个碱基对、优选至多100个碱基对、或更优选至多50个碱基对。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至少26个碱基对、优选至少30个碱基对、或更优选34-50个碱基对。

在一些实施例中，本发明包括一种修饰细胞或细胞群中的感兴趣的基因组座位的方法，例如其中该感兴趣的基因组座位与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关，这是通过向该细胞或细胞群中引入一种或多种递送载体或粒子，例如通过使该细胞或细胞群与一种或多种递送载体或粒子接触，这一种或多种递送载体或粒子包含具有一个或多个突变的Cas蛋白和两种指导RNA，这两种指导RNA分别靶向该细胞或细胞群中的DNA分子的第一链和第二链，由此这些指导RNA靶向该DNA分子并且该Cas蛋白使该DNA分子的第一链和第二链的每一者产生切口，由此改变该细胞或细胞群中的靶标；并且，其中该Cas蛋白和这两种指导RNA并不天然地一起存在，并且该方法还可以任选地包括递送HDR模板，例如经由递送载体或粒子接触含有该HDR模板的细胞或细胞群，或使细胞或群体与另一种含有该HDR模板的递送载体或粒子接触，其中该HDR模板提供该蛋白的正常或较不异常形式的表达；其中“正常”是就野生型而论，并且“异常”是引起病症或疾病状态的蛋白质表达；并且任选地该方法可以包括从该生物或非人类生物分离或获得细胞，任选地扩增该细胞群，使一种或多种递送载体或粒子与这些细胞进行接触以获得修饰的细胞群，任选地扩增该修饰的细胞群并且任选地向该生物或非人类生物给予修饰的细胞。在本发明的优选方法中，该Cas蛋白使该DNA分子的第一链和第二链的每一者产生切口导致5’突出端。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至多200个碱基对、优选至多100个碱基对、或更优选至多50个碱基对。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至少26个碱基对、优选至少30个碱基对、或更优选34-50个碱基对。本发明的实施例还包括包含融合到tracr配对序列和tracr序列上的指导序列的指导RNA。在本发明的一个方面，该Cas蛋白经密码子优化以便在真核细胞，优选哺乳动物细胞或人类细胞中中表达。在本发明另外的实施例中，该Cas蛋白是一种II型CRISPR-Cas蛋白，例如一种Cas 9蛋白。在一个高度优选的实施例中，该Cas蛋白是Cas9蛋白，例如SpCas9或SaCas9。在本发明的方面中，就SpCas9而言，该Cas蛋白具有一个或多个选自下组的突变，该组由以下各项组成：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和D986A；例如，D10A突变。本发明的方面涉及被减少的基因产物或被进一步引入到编码基因产物的DNA分子中的模板多核苷酸或通过允许两个5’突出端重新退火并连接而被精确切断的间插序列的表达、或被改变的基因产物的活性或功能、或被增加的基因产物的表达。在本发明的一个实施例中，该基因产物是一种蛋白质。

在一些实施例中，本发明包括一种修饰细胞或细胞群中的感兴趣的基因组座位的方法，例如其中该感兴趣的基因组座位与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关，这是通过向该细胞或细胞群中引入递送载体或一种或多种粒子，例如通过使该细胞或细胞群与递送载体或一种或多种粒子接触，这递送载体或一种或多种粒子包含：

a)第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到两种CRISPR-Cas系统指导RNA的每一者，这两种指导RNA分别靶向该细胞或该细胞群内的细胞的双链DNA分子的第一链和第二链，和

b)第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至Cas蛋白，或

c)a)或b)的一种或多种表达产物，

其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上，由此这些指导RNA靶向该细胞或该细胞群内的细胞的DNA分子，并且该Cas蛋白使该细胞或该细胞群内的细胞的DNA分子的第一链和第二链的每一者产生切口；并且，其中该Cas蛋白和这两个指导RNA并不天然地一起存在；并且该方法还可以任选地包括递送HDR模板，例如经由的递送载体或粒子接触含有该HDR模板的细胞或细胞群，或使细胞或细胞群与另一种含有该HDR模板的粒子接触，其中该HDR模板提供该蛋白的正常或较不异常形式的表达；其中“正常”是就野生型而论，并且“异常”是引起病症或疾病状态的蛋白质表达；并且任选地该方法可以包括从该生物或非人类生物分离或获得细胞，任选地扩增所述细胞群，使一种或多种递送载体或粒子与这些细胞进行接触以获得修饰的细胞群，任选地扩增该修饰的细胞群并且任选地向该生物或非人类生物给予修饰的细胞。在本发明的方面中，这些指导RNA可包含融合到tracr配对序列和tracr序列上的指导序列。在本发明的一个实施例中，该Cas蛋白是一种II型CRISPR-Cas蛋白。在本发明的一个方面，该Cas蛋白经密码子优化以便在真核细胞，优选哺乳动物细胞或人类细胞中表达。在本发明另外的实施例中，该Cas蛋白是一种II型CRISPR-Cas蛋白，例如一种Cas 9蛋白。在一个高度优选的实施例中，该Cas蛋白是Cas9蛋白，例如SpCas9或SaCas9。在本发明的方面中，关于SpCas9，该Cas蛋白具有一个或多个选自下组的突变，该组由以下各项组成：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和D986A；例如，D10A突变。本发明的方面涉及被减少的基因产物或被进一步引入到编码基因产物的DNA分子中的模板多核苷酸或通过允许两个5’突出端重新退火并连接而被精确切断的间插序列的表达、或被改变的基因产物的活性或功能、或被增加的基因产物的表达。在本发明的一个实施例中，该基因产物是一种蛋白质。在本发明的优选实施例中，该系统的这些载体是病毒载体。在一个另外的实施例中，该系统的这些载体经由脂质体、纳米粒子、外泌体、微囊泡、或基因枪进行递送；并且粒子是优选的。在一个方面，本发明提供了一种修饰细胞或细胞群中的靶多核苷酸的方法。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。在一些实施例中，所述切割包括通过所述CRISPR酶切割在该靶序列位置的一条或两条链。在一些实施例中，所述切割导致靶基因的转录降低。在一些实施例中，该方法进一步包括通过与外源模板多核苷酸同源重组修复所述切割的靶多核苷酸，其中所述修复导致一种突变，包括所述靶多核苷酸的一个或多个核苷酸的插入、缺失、或取代。在一些实施例中，所述突变导致在从包含该靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸改变。在一些实施例中，该方法进一步包括将一种或多种载体或其一种或多种表达产物例如经由一种或多种递送载体或粒子递送到所述细胞或细胞群中，其中这一种或多种载体驱动下列一者或多者的表达：该CRISPR酶、连接到该tracr配对序列上的指导序列、和该tracr序列。在一些实施例中，所述载体被递送到受试者体内的细胞或细胞群中。在一些实施例中，所述修饰发生在细胞培养物中的所述细胞或细胞群中。在一些实施例中，该方法进一步包括在所述修饰之前从受试者体内分离所述细胞或细胞群。在一些实施例中，该方法进一步包括使所述细胞或细胞群和/或从中衍生的细胞返回到所述受试者体内。

在一个方面，本发明提供了一种产生包含突变的疾病基因的细胞或细胞群的方法。在一些实施例中，疾病基因是与患有或产生一种疾病的风险的增加相关联的任何基因。在一些实施例中，该方法包括(a)将一种或多种载体或其一种或多种表达产物例如经由一种或多种递送载体或粒子引入细胞或细胞群中，其中这一种或多种载体驱动下列一者或多者的表达：CRISPR酶、连接到tracr配对序列上的指导序列、和tracr序列；并且(b)允许CRISPR复合物结合到靶多核苷酸上以实施在所述疾病基因内的该靶多核苷酸的切割，其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶多核苷酸内的靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，由此产生包含突变的疾病基因的细胞或细胞群。在一些实施例中，所述切割包括通过所述CRISPR酶切割在该靶序列位置的一条或两条链。在一些实施例中，所述切割导致靶基因的转录降低。在一些实施例中，该方法进一步包括通过与外源模板多核苷酸同源重组修复所述切割的靶多核苷酸，其中所述修复导致一种突变，包括所述靶多核苷酸的一个或多个核苷酸的插入、缺失、或取代。在一些实施例中，所述突变导致在从包含该靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸改变。在一些实施例中，向动物给予该修饰的细胞或细胞群，以由此产生动物模型。

在一个方面，本发明提供了修饰细胞或细胞群中的靶多核苷酸的方法。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。在其他实施例中，本发明提供了一种修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方法，该真核细胞产生自表达异常蛋白质的细胞或细胞群。该方法包括通过使用结合到多核苷酸上的CRISPR复合物增加或降低靶多核苷酸在该细胞或细胞群中的表达；有利地，该CRISPR复合物经由一种或多种病毒递送载体或粒子递送。

在一些方法中，可以使靶多核苷酸失活以实施细胞或细胞群中的表达的修饰。例如，当CRISPR复合物结合到细胞中的靶序列上时，该靶多核苷酸失活，这样使得该序列不被转录，该编码蛋白不被产生，或者该序列不会像野生型序列一样起作用。

在一些实施例中，该功能结构域是一个转录激活结构域，优选VP64。在一些实施例中，该功能结构域一个转录阻遏结构域，优选KRAB。在一些实施例中，该转录阻遏结构域是SID、或SID的多联体(例如SID4X)。在一些实施例中，该功能结构域是一个表观遗传修饰结构域，从而提供了一种表观遗传修饰酶。在一些实施例中，该功能结构域是一种激活结构域，其可以是P65激活结构域。

本发明进一步包括本发明的组合物或其CRISPR复合物或酶或其RNA(包括或可替代地是编码CRISPR酶的mRNA)，其用于在医学或治疗中使用。在一些实施例中，本发明包括根据本发明的组合物或其组分，其用于在根据本发明的方法中使用。在一些实施例中，本发明提供了本发明的组合物或其CRISPR复合物或酶或其RNA(包括或可替代地是编码CRISPR酶的mRNA)在离体基因或基因组编辑，尤其是在细胞或细胞群中的用途，该细胞或细胞群任选地可以然后被引入从中获得该细胞或细胞群的生物或非人类生物或者相同物种的另一种生物或非人类生物中。在某些实施例中，本发明包括本发明的组合物或其CRISPR复合物或酶或其RNA(包括或可替代地是编码CRISPR酶的mRNA)在用于离体基因或基因组编辑中或在根据本发明的方法中使用的药剂的制造中的用途。在某些实施例中，本发明提供了一种治疗或抑制对其有需要的受试者(例如，哺乳动物或人类)或非人类受试者(例如，哺乳动物)的由感兴趣的基因组座位中的靶序列的缺陷所引起的病症的方法，该方法包括通过操纵细胞或细胞群中的靶序列来修饰该受试者或非人类受试者的该细胞或细胞群，并且向该受试者或非人类受试者给予修饰的细胞；有利地，细胞的修饰是通过使这些细胞与含有该CRISPR复合物或其组分的递送载体(例如，病毒)或粒子接触；有利地，在某些实施例中，该递送载体(病毒)或粒子还提供HDR模板或者另一种粒子或载体提供该HDR模板，并且其中该病症对于通过操纵该靶序列进行的治疗或抑制是敏感的。

该CRISPR Cas复合物的某些RNA也是已知的并且被称为sgRNA(单一指导RNA)。在有利的实施例中，该CRISPR Cas复合物的RNA是sgRNA。该CRISPR-Cas9系统已经被工程化为靶向细胞或细胞群中的一个或多个遗传座位。在本文制备并示例了Cas9蛋白(有利地其针对真核细胞并且尤其是哺乳动物细胞，例如人类细胞(眼细胞、血管细胞、耳蜗细胞等)进行了密码子优化)和靶向细胞中的一个或多个座位(例如，基因RHO、ATOH1、VEGFA)的sgRNA。这些Cas9蛋白和sgRNA有利地经由病毒递送(AAV)进行递送。当经由粒子递送时，这些粒子由混合的Cas9蛋白和sgRNA形成。将该sgRNA和Cas9蛋白混合物与以下混合物混合，该混合物包含表面活性剂、磷脂、生物可降解聚合物脂蛋白和醇或基本上由其组成或由其组成，由此形成含有该sgRNA和Cas9蛋白的粒子。本发明包括如此制备的粒子和来自这样一种方法的粒子及其用途。更一般地说，使用有效工艺形成粒子。首先，使Cas9蛋白和靶向基因或对照基因LacZ的sgRNA在适合的温度(例如，15℃-30℃，例如，20℃-25℃，例如，室温)下以适合的摩尔比(例如，3:1至1:3或2:1至1:2或1:1)有利地在无菌、无核酸酶缓冲液(例如，1XPBS)中一起混合适合的时间(例如，15-45，如30分钟)。分开地，将粒子组分(如或包含：表面活性剂，例如阳离子脂质，例如1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；磷脂，例如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)；生物可降解聚合物，如乙二醇聚合物或PEG，和脂蛋白，如低密度脂蛋白，例如胆固醇)溶解于醇(有利地C_1-6烷基醇，如甲醇、乙醇、异丙醇，例如100％乙醇)中。将这两种溶液混合在一起以形成含有Cas9-sgRNA复合物的粒子。在某些实施例中，该粒子可以含有HDR模板。其可以是与含有sgRNA+Cas9蛋白的粒子共给予的粒子，或即，除使细胞或细胞群与含有sgRNA+Cas9蛋白的粒子接触之外，使该细胞或细胞群与含有HDR模板的粒子接触；或者使该HSC与含有全部的该sgRNA、Cas9和该HDR模板的粒子接触。该HDR模板可以通过分开的载体给予，由此在第一实例中，该粒子穿透HSC细胞并且该分开的载体也穿透该细胞，其中该HSC基因组被sgRNA+Cas9修饰并且该HDR模板也存在，由此基因组座位被该HDR修饰；例如，这可以导致突变的校正。在本文讨论中的粒子有利地通过将一种或多种sgRNA和Cas9蛋白的混合物(任选地含有一种或多种HDR模板或当就一种或多种模板而言分开的粒子是令人希望的时，这样的混合物仅含有一种或多种HDR模板)与以下混合物混合而获得或可获得，该混合物包括表面活性剂、磷脂、生物可降解聚合物、脂蛋白和醇或基本上由其组成或由其组成(其中一种或多种sgRNA靶向与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关的一个或多个遗传座位)。

在一个方面，本发明提供了为与真核生物或非人类生物中的基因组座位相关的疾病建模的方法，包括操纵所述基因组座位的编码、非编码或调节元件内的靶序列，包括递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：

(A)-I.CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列包含：

(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，

(b)tracr配对序列，和

(c)tracr序列，以及

II.编码Cas9的多核苷酸序列，该Cas9任选地包含至少一个或多个核定位序列，

其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9，并且编码Cas9的多核苷酸序列是DNA或RNA，

或者

(B)I.多核苷酸，其包含：

(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，和

(b)至少一种或多种tracr配对序列，

II.编码Cas9的多核苷酸序列，以及

III.包含tracr序列的多核苷酸序列，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9，并且编码Cas9的多核苷酸序列是DNA或RNA。

在某些优选的实施例中，该Cas9是SaCas9。

在一个方面，本发明提供了为与真核生物或非人类生物中的基因组座位相关的疾病建模的方法，包括操纵所述基因组座位的编码、非编码或调节元件内的靶序列，包括递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含病毒载体系统，该载体系统包含一种或多种病毒载体，该一种或多种病毒载体可操作地编码用于其表达组合物，其中该非天然存在的或工程化的组合物包含：

(A)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含

I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含

(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，

(b)tracr配对序列，和

(c)tracr序列，以及

II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码Cas9(优选SaCas9)的酶编码序列上，该Cas9任选地包含至少一个或多个核定位序列，

其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，

其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9，

或者

(B)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含

I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至

(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，和

(b)至少一种或多种tracr配对序列，

II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码Cas9的酶编码序列，以及

III.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至tracr序列，

其中组分I、II和III位于该系统的相同或不同载体上，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9。

在一个方面，本发明提供了治疗或抑制真核生物或非人类生物的由基因组座位中的一个或多个突变所引起的病症或疾病的方法，包括操纵对其有需要的受试者或非人类受试者体内的靶序列中的所述基因组座位的编码、非编码或调节元件内的靶序列，包括通过操纵该靶序列来修饰该受试者或非人类受试者，并且其中该病症或疾病对于通过操纵该靶序列进行的治疗或抑制是敏感的，该方法包括提供包含以下项的治疗：

递送包含AAV或慢病毒载体系统的非天然存在的或工程化的组合物，该载体系统包含一种或多种AAV或慢病毒载体,该一种或多种AAV或慢病毒载体可操作地编码用于其表达的组合物，其中在表达时该靶序列由该非天然存在的或工程化的组合物操纵，其中该非天然存在的或工程化的组合物包括：

(A)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含

I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含

(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的该靶序列上，

(b)tracr配对序列，和

(c)tracr序列，以及

II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码Cas9(优选SaCas9)的酶编码序列上，该Cas9包含至少一个或多个核定位序列，

其中(A)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，

其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9，

或者

(B)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含

I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至

(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，和

(b)至少一种或多种tracr配对序列，

II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码Cas9(优选SaCas9)的酶编码序列，以及

III.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至tracr序列，

其中组分I、II和III位于该系统的相同或不同载体上，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9。

在某些实施例中，本发明提供了制备用于在根据本发明的任何方法中使用的AAV或慢病毒载体的方法，该方法包括将含有编码该AAV或慢病毒的一种或多种核酸分子或基本上由其组成的一种或多种质粒转染到AAV感染的或慢病毒感染的细胞中，并且提供对于该AAV或慢病毒的复制和包装必须的AAV AAV或慢病毒rep和/或cap和/或辅助核酸分子。

在一个方面，本发明提供了一种用于在本发明的任何方法(例如，为与真核生物或非人类生物中的遗传座位相关的疾病建模的方法)中使用的组合物，所述方法包括操纵所述遗传座位的编码、非编码或调节元件内的靶序列。在某些实施例中，本发明提供了该组合物在离体或体内基因或基因组编辑中的用途，包括治疗用途。

在一个方面，本发明提供了一种用于在药剂的制造中使用的组合物，该药剂用于体外、离体或体内基因或基因组编辑中、或用于在通过操纵与疾病相关的基因组座位中的靶序列来修饰生物或非人类生物的方法中使用、或者在治疗或抑制真核生物或非人类生物的由基因组座位中的一个或多个突变所引起的病症或疾病的方法中使用。

在一个方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包含：

(A)-I.CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列包含：

(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，

(b)tracr配对序列，和

(c)tracr序列，以及

II.编码Cas9(优选Sa Cas9)的多核苷酸序列，该Cas9任选地包含至少一个或多个核定位序列，

其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9，并且编码Cas9的多核苷酸序列是DNA或RNA，

或者

(B)I.多核苷酸，其包含：

(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，和

(b)至少一种或多种tracr配对序列，

II.编码Cas9(优选SaCas9)的多核苷酸序列，以及

III.包含tracr序列的多核苷酸序列，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的SaCas9，并且编码Cas9的多核苷酸序列是DNA或RNA；

用于在药物中或在疗法中使用；或用于在通过操纵与疾病或障碍相关的基因组座位中的靶序列来修饰生物或非人类生物的方法中使用；或用于在治疗或抑制真核生物或非人类生物的由与疾病相关的遗传座位中的一个或多个突变所引起的病症的方法中使用；或者用于在体外、离体或体内基因或基因组编辑中使用。

在一个方面，本发明提供了一种用于治疗或抑制真核生物或非人类生物的由基因组座位中的一个或多个突变所引起的病症或疾病的治疗性基因组编辑方法，包括操纵对其有需要的受试者或非人类受试者体内的靶序列中的所述基因组座位的编码、非编码或调节元件内的靶序列，包括通过操纵该靶序列来修饰该受试者或非人类受试者，并且其中该病症或疾病对于通过操纵该靶序列进行的治疗或抑制是敏感的，该方法包括提供包含以下项的治疗：

递送包含AAV或慢病毒载体系统的非天然存在的或工程化的组合物，该载体系统包含一种或多种AAV或慢病毒载体,该一种或多种AAV或慢病毒载体可操作地编码用于其表达的组合物，其中在表达时该靶序列由该非天然存在的或工程化的组合物操纵，其中该非天然存在的或工程化的组合物包括：

(A)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含

I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含

(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的该靶序列上，

(b)tracr配对序列，和

(c)tracr序列，以及

II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码Cas9(优选SaCas9)的酶编码序列上，该Cas9包含至少一个或多个核定位序列，

其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，

其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9，

或者

(B)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含

I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至

(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，和

(b)至少一种或多种tracr配对序列，

II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码SaCas9的酶编码序列，以及

III.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至tracr序列，

其中组分I、II和III位于该系统的相同或不同载体上，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr上的tracr配对序列复合的Cas9。

在一个方面，本发明提供了一种个体化或个性化治疗对这样的治疗有需要的受试者的遗传疾病的方法，该方法包括：

(a)将多个突变离体地引入包含一个或多个表达Cas9(优选Sa Cas9)的真核细胞的组织、器官或细胞系中，或引入具有表达Cas9的细胞的转基因非人类哺乳动物体内，包括向该组织、器官、细胞系或哺乳动物中的一个或多个细胞中递送如在本文讨论的载体，其中这些特异性突变或精确序列取代与或已经与该遗传疾病相关；

(b)用以下细胞测试针对该遗传疾病的一种或多种治疗，向这些细胞中已经递送该载体并且这些细胞具有与该遗传疾病相关联的这些特异性突变或精确序列取代；并且

(c)基于来自步骤(b)的一种或多种治疗的测试的结果治疗该受试者。

在本发明的任何上述方面和实施例的某些实施例中，该病毒载体可以是AAV，例如AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV DJ或其任何组合。

在本文的关于与突变或与疾病状况相关的靶标的讨论中，这种突变或疾病状况可以是例如神经元疾病；眼病(例如，视网膜疾病，例如色素性视网膜炎；全色盲；年龄相关性黄斑变性；视力损害)，听觉疾病(例如，耳蜗细胞相关疾病、听觉损伤、耳聋)等。

因此，本发明的目的在于，在本发明中不涵盖任何先前已知的产品、制造该产品的过程、或使用该产品的方法，使得申请人保留和特此公开放弃任何先前已知的产品、过程、或方法的权利。进一步指出的是，在本发明的范围之内，本发明并不旨在涵盖任何产品、过程、或该产品的制造或使用该产品的方法，其不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC的第83条)的书面说明和可实施性要求，使得申请人保留和特此公开放弃任何先前描述的产品、制造该产品的过程、或使用该产品的方法的权利。

应注意，在本披露并且特别是在权利要求书和/或段落中，术语如“包括(comprise)”、“包括的(comprised)”、“包括了(comprising)”等等可具有在美国专利法中属于它的含义；例如，它们可以表示“包含(includes)”、“包含的(included)”、“包含了(including)”等等；并且这些术语如“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“基本上由……组成(consists essentially of)”具有在美国专利法中归于它们的含义，例如，它们允许未被明确叙述的要素，但是排除在现有技术中发现或者影响本发明的基本或新颖特征的要素。可以有利的是，在本发明的实践中符合条款53(c)EPC以及条例28(b)和(c)EPC。在此文献中没有承诺。

这些和其他实施例披露于以下详细说明中，或者据其显而易见并且由其涵盖。

附图简要说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体提出。通过参考提出说明性实施例的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些实施例中利用了本发明的原理，并且在这些附图中：

图1A-H显示了在小鼠脑中CRISPR-Cas9系统递送和Mecp2座位的靶向。(a)AAV-SpCas9和AAV-SpGuide(Mecp2)表达载体。sgRNA载体包含GFP-KASH融合蛋白的编码序列，以用于鉴定转导的神经元。(b)在小鼠海马体的背侧齿状脑回(DG)中HA-Cas9和GFP-KASH的表达。比例尺，100μm。(c)由双载体Cas9-CRISPR系统高效靶向的细胞的定量。(d)示出Cas9靶位置的小鼠Mecp2座位的图形表示；sgRNA以蓝色指示。PAM序列以紫色标记。通过对Mecp2座位的测序而检测的代表性突变模式显示如下：绿色-野生型序列；红色虚线-缺失的碱基；红色碱基：插入或突变；红色箭头指示CRISPR-Cas9切割位点。(e)SURVEYOR^TM测定凝胶显示在DG区中AAV递送后2周Mecp2座位的修饰。(f)在靶向的脑区中MeCP2蛋白质表达的Western印迹分析以及在背侧DG中MeCP2蛋白水平的定量(t-检验，**p<0.001，n＝4，来自3个动物，误差条：s.e.m.)。(g)在CRISPR-Cas9靶向于Mecp2座位后2周背侧DG区的图像。比例尺，150μm。(h)在靶向的脑区中在所有检测的细胞内(DAPI染色)MeCP2阳性细胞群体相比于对照并行位点的定量(t-检验，****p<0.0001，n＝290和249个细胞，分别来自2个动物；误差条：s.e.m)。(ITR-反向末端重复；HA-血凝素标签；NLS-核定位信号；spA-合成的多聚腺苷酸化信号；U6-PolIII启动子；sgRNA-单一指导RNA；hSyn-人类突触蛋白1启动子；GFP-绿色荧光蛋白；KASH-Klarsicht，ANC1，Syne同源核跨膜结构域；bGH>

图2A-B显示在Cas9-介导的MeCP2敲低神经元中基因表达的分析。(a)来自小鼠脑的CRISPR-Cas9靶向的细胞的细胞核纯化的策略。(b)差异性表达基因的分层聚簇(t-检验，p<0.01，n＝分类的核的19个群体，来自8个动物)，通过RNAseq检测。针对每一行将基因的相对log2(TPM+1)表达水平归一化，并且以红-蓝色标度展现。每列表示从分离的齿状脑回细胞群体经FACS分选的被靶向的100个神经元核的群体，来自对照或来自Mecp2sgRNA转导的动物，如指示的。

图3A-E显示在CRISPR-介导的MeCP2敲低后神经元的细胞响应特性方面的细胞自主缺陷。(a)卡通显示来自小鼠视觉皮质的体内实验配置和视觉刺激参数。示出GFP⁺神经元。比例尺，20μm。(b)卡通显示记录在层2/3兴奋性神经元中的配置，这些神经元接受对侧和同侧眼睛特异性输入两者。基因组修饰的GFP⁺细胞是绿色而未修饰的细胞是灰色。归一化的尖峰形状显示规则的形成尖峰的兴奋性神经元。(c,d)平均OSI(c)和诱发FR(d)是从分别表达Mecp2和对照sgRNA的GFP⁺细胞测量(t-检验，*p<0.05；图中的数目指示记录的细胞的数目；n＝2-3个动物；误差条：s.e.m)。

图4A-F显示了在小鼠脑中同步的多元基因编辑。(a)被设计用于多元基因组靶向的CRISPR-Cas9系统的示意图。(b)靶向的DNMT小鼠座位的图形表示。指导RNA以蓝色指示。PAM序列被标记为紫色。(c)SURVEYOR^TM测定凝胶显示在DG区中AAV递送后4周在FACS分选的GFP-KASH阳性细胞中DNMT座位的修饰。(d)在单一细胞中DNMT座位修饰的基于深度测序的分析，显示在多个座位中修饰的共同发生。(e)在体内递送靶向DNMT家族基因的CRISPR-Cas9系统之后，Dnmt3a和Dnmt1蛋白的Western印迹分析(顶部)。在体内CRISPR>

图5A-F显示了供AAV包装的HA标记的SpCas9(HA-SpCas9)的克隆和表达。(a)最小化SpCas9表达盒大小的不同克隆策略的示意性概述，使用短大鼠Map1b启动子(pMap1b)、小鼠Mecp2启动子(pMecp2)的截短形式以及短polyA基序(spA)。(b)使用不同SpCas9表达盒表达HA-SpCas9的初级皮层神经元培养物的Western印迹分析。(c)Mecp2启动子驱动HA-SpCas9(红色)在神经元中的表达(Map1b，NeuN；箭头)但不是在星形神经胶质(GFAP，箭头)中。示出HA-SpCas9和GFP-KASH的共表达(底部)。细胞核用DAPI标记(蓝色)。比例尺，20μm。(d)GFP-标记的示意性概述。展示了与核跨膜KASH结构域融合的增强的绿色荧光蛋白(GFP)以及GFP-KASH整合到外核膜。(e)协同感染效率计算，示出表达HA-SpCas9和GFP-KASH两者的细胞群体(n＝973个神经元，来自3个培养物；误差条：s.e.m)。(f)在病毒递送后7天，将细胞用试剂盒染色。DAPI⁺和死(DEAD⁺)细胞的定量(对照n＝518个DAPI⁺核；SpCas9/GFP-KASH>+核，来自2个培养物；误差条：s.e.m)。(ITR-反向末端重复；HA-血凝素标签；NLS-核定位信号；spA-合成的多聚腺苷酸化信号；U6-PolIII启动子；sgRNA-单一指导RNA；hSyn-人类突触蛋白1启动子；GFP-绿色荧光蛋白；KASH-Klarsicht，ANC1，Syne同源核跨膜结构域；bGH>

图6A-B显示了在Neuro-2a细胞中Mecp2的靶向。(a)Mecp2靶向序列和相应的原型间隔子邻近基序(PAM)。(b)6个用SpCas9共转染进Neuro-2a细胞中的Mecp2sgRNA的评价。使用SURVEYOR^TM测定的转染后48h对座位修饰效率进行分析。

图7A-D显示了CRISPR-SpCas9靶向初级皮层神经元中的Mecp2。(a)在AAV-CRISPR转导(绿色，GFP-KASH)后7天，在培养的神经元中MeCP2的免疫荧光染色(红色)。细胞核用DAPI标记(蓝色)。比例尺，20μm。(b)使用SURVEYOR^TM测定凝胶，使用SpCas9或dSpCas9连同Mecp2sgRNA或对照(靶向细菌lacZ基因)sgRNA时Mecp2座位靶向的评价。(c)在神经元的靶向群体中MeCP2阳性核的定量(GFP⁺)。(d)在CRISPR-SpCas9靶向Mecp2座位之后MeCP2蛋白水平的Western印迹以及MeCP2蛋白水平的定量(t-检验，**p<0.001，n＝5，来自3个培养物，误差条：s.e.m)。

图8A-E显示了在体外在SpCas9-介导的MeCP2敲低之后，神经元树突树的形态学变化。(a)在CRISPR-SpCas9靶向Mecp2座位之后，在神经元中树突树的降低的复杂度。比例尺，20μm。(b)在被SpCas9和Mecp2sgRNA靶向的神经元中树突棘形态学中的变化。比例尺，10μm。细胞的形态学是采用mCherry构建体共转染可视化。基于Mecp2染色的结果来选择用于形态学分析的细胞。(c)用树突末端的数目评定的树突树形态，以及(d)肖尔(Sholl)分析(t-检验，***p<0.0001，n＝40，来自2个培养物)。(e)树突棘密度定量(t-检验，***p<0.0001，n＝40，来自2个培养物，误差条：s.e.m)。

图9显示了来自对照动物和SpCas9-介导的Mecp2敲低的神经元核的RNAseq。盒形图，呈现跨RNA-seq文库的检测基因的数目(19个文库，各自100个核取自对照sgRNA或Mecp2sgRNA转导的核；n＝4个动物/组)/表达水平分位数。所有基因通过它们的平均log2(TPM+1)表达水平被划分为10个分位点，然后在每个样品针对每个分位点检测到的基因的数目(log2(TPM+1)>2)计数。示出的三个靶序列是分别针对Dnmt3a、Dnmt1和Dnmt3b的SEQID NO:___、SEQ ID NO:___和SEQ ID NO:___。

图10A-B显示了在体外DNMT家族成员的多元基因组靶向。(a)Dnmt3a、Dnmt1和Dnmt3b靶向序列和相应的原型间隔子邻近基序(PAM)。(b)在用靶向于Dnmt3a、Dnmt1和Dnmt3b座位的SpCas9和DNMT 3xsgRNA载体转染之后48小时，Neuro-2a细胞的SURVEYOR^TM核酸酶测定分析。示出所有三个靶基因的高效基因组编辑。

图11A-C显示了靶向的Dnmt3a、Dnmt1和Dnmt3b座位的下一代测序。在体内递送SpCas9和DNMT 3xsgRNA进入小鼠齿状脑回之后，突变的Dnmt3a(a)、Dnmt1(b)和Dnmt3b(c)座位的测序结果的实例。绿色：野生型序列，红色虚线：缺失的碱基，红色碱基：插入或突变。红箭头指示CRISPR-SpCas9切割位点。在此图中所使用的完整序列提供为分别针对Dnmt3a、Dnmt1和Dnmt3b座位的SEQ ID NO:、SEQ ID NO:、和SEQ ID NO:。它们是：SEQ ID NO:(Dnmt3a)：CCT CCG TGT CAG CGA CCC ATG CCA A，SEQ ID NO:(Dnmt1)：CCA GCG TCG AACAGC TCC AGC CCG和SEQ ID NO:(Dnmt3b)AGA GGG TGC CAG CGG GTA TAT GAG G

图12显示了不同的可编程核酸酶平台的比较。

图13A-C显示了治疗性基因组修饰的类型。特定类型的基因组编辑治疗取决于引起疾病的突变的性质。a，在基因破坏中，通过用NHEJ靶向该座位使蛋白的致病功能沉默。在感兴趣的基因上形成indel常常导致移码突变，这些移码突变产生提前终止密码子和非功能性蛋白产物或无义介导的转录物衰变，从而抑制基因功能。b，HDR基因校正可以用来校正有害突变。在外源提供的校正HDR模板的存在下，DSB被靶向突变位点附近。通过外源模板对断裂位点进行HDR修复校正了该突变，从而恢复基因功能。c，基因校正的替代方案是基因添加。这种模式的处理将治疗性转基因引入基因组中的安全港(safe-harbor)座位中。DSB被靶向该安全港座位并且与断裂位点具有同源性、含有启动子和转基因的HDR模板被引入细胞核中。HDR修复将启动子-转基因盒拷贝到安全港座位中，从而恢复基因功能，尽管对基因表达没有真实的生理控制。

图14显示了离体对比体内编辑治疗的示意表示。在离体编辑治疗中，从患者体内取出细胞，编辑并且然后重新植入(顶部图)。为了使得这种治疗模式成功，靶细胞必须能够在体外存活并且在移植后能够归巢回到靶组织中。体内治疗涉及原位细胞基因组编辑(底部图)。对于体内全身性治疗，与细胞身份或状态相对无关的递送剂用来实现在范围广泛的组织类型中进行编辑。尽管这种模式的编辑治疗在将来是可能的，但是目前不存在足够有效使这可行的递送系统。在向患者给予对特定器官系统具有向性的递送剂的情况下，使用临床上相关的病毒载体的体内靶向治疗是可行的。

图15显示了用于眼部基因治疗的SaCas9系统。

图16显示了经由Cas9同源重组(HR)载体进行的基因治疗的示意表示。

图17显示了用于眼部基因治疗的示例性方案。

图18A-B显示了人RHO座位(等位基因示出了P23H突变)。图7A显示了RHO座位的指导物设计。图7B显示了使用SURVEYOR测定的体外指导物筛选结果。

图19显示了RHO HR AAV载体。

图20A-B显示了CNGA3和CNGB3的指导物选择。(a)显示了人CNGA3座位(等位基因示出了两个疾病突变)和指导物选择。(b)显示了人CNGB3座位(等位基因示出了疾病突变)和指导物选择。

图21显示了CNGA3HR AAV载体。

图22显示了CNGB3HR AAV载体。

图23A-B显示了VEGFA的指导物选择。(a)显示了人类VEGFA座位(共同区1)；(b)显示了人类VEGFA座位(共同区2)。

图24显示了基于dCas9的表观遗传调节系统的设计(示出了该系统的3种组分，即dSaCas9、融合效应子和sgRNA)。

图25A-C显示了ATOH1的指导物选择。(a)显示了所选的两个高度可及区；(b)显示了高度可及区1-蓝色线指示指导序列并且品红色线指示PAM；(c)显示了高度可及区2-蓝色线指示指导序列并且品红色线指示PAM。

本文的这些图仅仅是出于说明性的目的，并且不一定是按比例绘制的。

本发明的详细说明

就关于CRISPR-Cas系统、其组分以及这样的组分的递送(包括方法、材料、递送运载体、载体、粒子、AAV及其制备和使用，包括关于量和配制品，全部在本发明的实践中都是有用的)的一般信息而言，参考：美国专利号8,697,359、8,771,945、8,795,965、8,865,406、8,871,445、8,889,356、8,889,418和8,895,308；美国专利公开US 2014-0310830(美国申请序列号14/105,031)、US 2014-0287938A1(美国申请序列号14/213,991)、US 2014-0273234A1(美国申请序列号14/293,674)、US 2014-0273232A1(美国申请序列号14/290,575)、US 2014-0273231(美国申请序列号14/259,420)、US 2014-0256046A1(美国申请序列号14/226,274)、US 2014-0248702A1(美国申请序列号14/258,458)、US 2014-0242700A1(美国申请序列号14/222,930)、US 2014-0242699A1(美国申请序列号14/183,512)、US2014-0242664A1(美国申请序列号14/104,990)、US 2014-0234972A1(美国申请序列号14/183,471)、US 2014-0227787A1(美国申请序列号14/256,912)、US 2014-0189896A1(美国申请序列号14/105,035)、US 2014-0186958(美国申请序列号14/105,017)、US 2014-0186919A1(美国申请序列号14/104,977)、US 2014-0186843A1(美国申请序列号14/104,900)、US 2014-0179770A1(美国申请序列号14/104,837)和US 2014-0179006A1(美国申请序列号14/183,486)、US 2014-0170753(美国申请序列号14/183,429)；欧洲专利申请EP 2771 468(EP 13818570.7)、EP 2 764 103(EP 13824232.6)和EP 2 784 162(EP14170383.5)；以及PCT专利公开WO 2014/093661(PCT/US 2013/074743)、WO 2014/093694(PCT/US 2013/074790)、WO 2014/093595(PCT/US 2013/074611)、WO 2014/093718(PCT/US2013/074825)、WO 2014/093709(PCT/US 2013/074812)、WO 2014/093622(PCT/US 2013/074667)、WO 2014/093635(PCT/US 2013/074691)、WO 2014/093655(PCT/US 2013/074736)、WO 2014/093712(PCT/US 2013/074819)、WO 2014/093701(PCT/US 2013/074800)和WO 2014/018423(PCT/US 2013/051418)。还参考分别提交于2013年1月30日；2013年3月15日；2013年3月28日；2013年4月20日；2013年5月6日和2013年5月28日的美国临时专利申请61/758,468；61/802,174；61/806,375；61/814,263；61/819,803和61/828,130。还参考提交于2013年6月17日的美国临时专利申请61/836,123。另外参考各自提交于2013年6月17日的美国临时专利申请61/835,931、61/835,936、61/836,127、61/836,101、61/836,080和61/835,973。进一步参考提交于2013年8月5日的美国临时专利申请61/862,468和61/862,355；提交于2013年8月28日的61/871,301；提交于2013年9月25日的61/960,777和提交于2013年10月28日的61/961,980。又进一步参考：各自提交于2014年6月10日(6/10/14)的PCT专利申请号PCT/US 2014/041803、PCT/US 2014/041800、PCT/US 2014/041809、PCT/US 2014/041804和PCT/US 2014/041806；提交于2014年6月11日的PCT/US 2014/041808；和提交于2014年10月28日的PCT/US2014/62558，以及各自提交于2013年12月12日的美国临时专利申请序列号61/915,150、61/915,301、61/915,267和61/915,260；提交于2013年1月29日和2013年2月25日的61/757,972和61/768,959；提交于2013年6月17日的61/835,936、61/836,127、61/836,101、61/836,080、61/835,973和61/835,931；均提交于2014年6月11日的62/010,888和62/010,879；各自提交于2014年6月10日的62/010,329和62/010,441；各自提交于2014年2月12日的61/939,228和61/939,242；提交于2014年4月15日的61/980,012；提交于2014年8月17日的62/038,358；各自提交于2014年9月25日的62/054,490、62/055,484、62/055,460和62/055,487；和提交于2014年10月27日的62/069,243。还参考提交于2014年9月25日的美国临时专利申请号62/055,484、62/055,460和62/055,487；提交于2014年4月15日的美国临时专利申请61/980,012；以及提交于2014年2月12日的美国临时专利申请61/939,242。参考提交于2014年6月10日的PCT申请指定(尤其是美国)申请号PCT/US 14/41806。参考提交于2014年1月22日的美国临时专利申请61/930,214。参考各自提交于2013年12月12日的美国临时专利申请61/915,251、61/915,260、和61/915,267。参考提交于2014年4月15日的美国临时专利申请USSN 61/980,012。参考提交于2014年6月10日的PCT申请指定(尤其是美国)申请号PCT/US 14/41806。参考提交于2014年1月22日的美国临时专利申请61/930,214。参考各自提交于2013年12月12日的美国临时专利申请61/915,251、61/915,260、和61/915,267。这些专利、专利公开、以及申请的每一个、以及在其中或在它们的审查程序期间引用的所有文件(“申请引用文件”)以及在这些申请引用文献中引用或参考的所有文件，连同其中提到的或在其中任何文件中提到并通过引用结合在其中的针对任何产品的任何说明书、说明、产品规格、和产品表，特此通过引用结合在此，并且可以在本发明的实践中采用。所有文件(例如，这些专利、专利公开、以及申请和申请引用文件)在如同每个单独文件被确切地且单独地指明为通过引用结合的相同程度上通过引用结合在此。

另外关于CRISPR-Cas系统的一般信息，提及以下内容(还特此通过引用结合在此)：

使用CRISPR/Cas系统进行的多元基因组工程化(Multiplex>

使用CRISPR-Cas系统对细菌基因组进行RNA-指导的编辑(RNA-guided>

通过CRISPR/Cas-介导的基因组工程化在多基因中携带突变的小鼠的一步产生(One-Step>

哺乳动物内源转录和外遗传状态的光控制(Optical>

通过RNA指导的CRISPR>

RNA指导的Cas9核酸酶的DNA靶向特异性(DNA>使用CRISPR-Cas9系统进行的基因组工程化(Genome engineering using theCRISPR-Cas9system).兰(Ran)，FA.、徐(Hsu)，PD.、赖特(Wright)，J.、阿格瓦拉(Agarwala)，V.、斯科特(Scott)，DA.、张(Zhang)，F.《自然工具》(Nature Protocols)十一月；8(11):2281-308.(2013)；

在人类细胞中基因组规模CRISPR-Cas9敲除筛选(Genome-Scale>

在与指导RNA和靶DNA复合物中的cas9的晶体结构(Crystal>

在哺乳动物细胞中CRISPR内切核酸酶Cas9的基因组宽结合(Genome-wide>

用于基因组编辑和癌症建模的CRISPR-Cas9敲入小鼠(CRISPR-Cas9Knockin>

用于基因组工程化的CRISPR-Cas9的开发与应用(Development>

使用CRISPR/Cas9系统在人类细胞中进行遗传筛选(Genetic>

对于CRISPR-Cas9-介导的基因失活的高效sgRNA的合理设计(Rational>

使用CRISPR-Cas9在哺乳动物脑中的基因功能的体内探询(In>

将这些文献的每一个通过引用结合在此，并且简要讨论如下：

丛(Cong)等人基于嗜热链球菌Cas9以及还有化脓链球菌Cas9两者改造了II型CRISPR/Cas系统以用于在真核细胞中使用，并且证实了Cas9分子可以通过短RNA指导以诱导在人类和小鼠细胞中DNA的精确切割。他们的研究进一步显示Cas9在转化成一种切口酶时可以用来以最低诱变活性促进在真核细胞中的同源定向修复。另外，他们的研究证实多个指导序列可以被编码进单一CRISPR阵列中以使得能够在哺乳动物基因组内的内源性基因组座位位点处同时编辑若干，证实了RNA指导的核酸酶技术的容易可编程性和广泛可应用性。这种使用RNA以编程细胞内序列特异性DNA切割的能力定义了新一类的基因组编辑工具。这些研究进一步显示，其他CRISPR座位可能是可移植入哺乳动物细胞中的，并且还可以介导哺乳动物基因组切割。重要地，可以设想的是CRISPR/Cas系统的若干方面可以进一步改进以增加其效率和多功能性。

江(Jiang)等人使用规律间隔成簇短回文重复(CRISPR)-关联的Cas9内切核酸酶，与双-RNA复合，以在肺炎链球菌和大肠杆菌的基因组中引入精确的突变。该途径依赖于在靶基因组位点处的双-RNA:Cas9-引导的切割，以杀死未突变的细胞，并且回避对选择性标记或反选择系统的需要。该研究报道通过改变短CRISPR>

科纳曼(Konermann)等人解决了在本领域中对通用和稳固技术的需要，其使得能够基于CRISPR>

来自微生物CRISPR-Cas系统的Cas9核酸酶通过20nt指导序列而靶向特异性基因组座位，其可以耐受与该DNA靶标的某些错配并由此促进不希望的脱靶诱变。为了解决此问题，兰(Ran)等人描述了将Cas9切口酶突变体与配对的指导RNA相组合以引入靶向的双链断裂的途径。因为基因组中的单独切口以高保真性被修复，所以同时经由适当补偿指导RNA而形成切口对于双链断裂是必需的，并且所述切口形成延伸了特异性识别的碱基的数目以用于靶标切割。作者证实了使用配对的切口形成可以降低在细胞系中的脱靶活性50至1,500倍，并且从而促进在小鼠受精卵中的基因敲除而不牺牲中靶切割效率。这个通用策略使得多种多样的要求高特异性的基因组编辑应用成为可能。

徐(Hsu)等人表征了在人类细胞中SpCas9靶向特异性以告知靶位点的选择并避免脱靶效应。该研究评价了在293T和293FT细胞中的>100个预测的基因组脱靶座位处>700个指导RNA变体和SpCas9-诱导的indel突变水平。这些作者报道SpCas9以序列依赖性方式耐受指导RNA与靶DNA之间在不同位置处的错配，对错配的数目、位置和分布敏感。这些作者进一步示出SpCas9-介导的切割不受DNA甲基化的影响，并且SpCas9和sgRNA的剂量可被滴定为使得脱靶修饰最小化。另外，为了促进哺乳动物基因组工程应用，这些作者报道提供基于网络的软件工具以指导靶序列的选择和验证连同脱靶分析。

兰(Ran)等人描述了用于在哺乳动物细胞中Cas9-介导的经由非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)基因组编辑、连同产生修饰的细胞系(以用于下游功能研究)的一组工具。为了最小化脱靶切割，这些作者进一步描述了一种双-切口策略，使用的是Cas9切口酶突变体与配对的指导RNA。由这些作者提供的方案经实验得出用于选择靶位点、评价切割效率和分析脱靶活性的指南。这些研究显示，以靶设计开始，基因修饰可以在少至1-2周内实现，并且修饰的克隆细胞系可以在2-3周内得以衍生。

沙勒姆(Shalem)等人描述了新的在基因组广度范围上探询基因功能的方式。他们的研究显示，递送基因组范围的CRISPR-Cas9敲除(GeCKO)文库利用64,751个独特的指导序列靶向18,080个基因，这些指导序列使得在人类细胞中阴性和阳性选择筛选两者成为可能。首先，这些作者显示，使用该GeCKO文库来鉴定癌症和多能干细胞中对于细胞活力至关重要的基因。接着，在黑色素瘤模型中，这些作者针对基因进行筛选，这些基因的损失涉及对维罗非尼(一种抑制突变体蛋白激酶BRAF的治疗剂)的抗性。他们的研究显示，最高级候选物包括先前验证的基因NF1和MED12连同新颖的命中物NF2、CUL3、TADA2B、和TADA1。这些作者观察到在靶向相同基因的独立指导RNA之间的高水平的一致性以及高比率的命中确认，并且因此证实了采用Cas9进行基因组范围筛选的前景。

尼氏玛素(Nishimasu)等人以2.5A°分辨率报道了与sgRNA复合的化脓链球菌Cas9以及其靶DNA的晶体结构。该结构揭示了一种由靶识别和核酸酶叶片组成的两叶片构造，其将sgRNA:DNA异源双链体容纳在它们的界面处的带正电的凹槽中。然而识别叶片对于结合sgRNA和DNA是至关重要的，核酸酶叶片包含HNH和RuvC核酸酶结构域，这些结构域适合地被定位为分别用于靶DNA的互补和非互补链的切割。核酸酶叶片还包含负责与原型间隔子邻近基序(PAM)相互作用的羧基-末端结构域。这种高分辨率结构和伴随的功能分析已经揭示了RNA-指导的由Cas9进行的DNA靶向的分子机制，由此为合理设计新的通用基因组编辑技术做好准备。

吴(Wu)等人标定了在小鼠胚胎干细胞(mESC)中，来自化脓链球菌的无催化活性Cas9(dCas9)(加载有单一指导RNA(sgRNA))的基因组广度的结合位点。这些作者显示，测试的四种sgRNA中的每一种将dCas9靶向至数十和数千个之间的基因组位点，这些基因组位点频繁地通过sgRNA中的5-核苷酸种子区和NGG原型间隔子邻近基序(PAM)表征。染色质不可接近性降低了dCas9与具有匹配种子序列的其他位点的结合；因此70％的脱靶位点是与基因相关联的。这些作者显示，在用催化活性的Cas9转染的mESC中295dCas9结合位点的靶向测序鉴定出超过背景水平的仅一个突变位点。这些作者提出了一种针对Cas9结合和切割的两态模型，其中种子匹配触发了结合但是需要与靶DNA的广泛配对用于切割。

徐(Hsu)2014是一篇综述文章，它大体讨论了CRISPR-Cas9的从酸奶到基因组编辑的历史，包括细胞的基因筛选，其在2014年6月5日之前提交的本说明书的谱系中的申请的信息、数据和发现中。徐2014的总体传授不涉及本说明书的特定模型、动物。

还提及了蔡(Tsai)等人，“针对高度特异性基因组编辑的二聚CRISPR RNA-指导的FokI核酸酶(Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specificgenome editing)，”自然生物技术(Nature Biotechnology)32(6):569-77(2014)，其被认为不是本发明或申请的现有技术，但是其可以被考虑用于本发明的实践。

此外，提及的是标题为“用于使用粒子递送组分靶向障碍和疾病的CRISPR-CAS系统和组合物的递送、用途和治疗应用(DELIVERY,USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OFTHE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASESUSING PARTICLE DELIVERY COMPONENTS)”的同时提交PCT申请_____________，案卷参考47627.99.2060和BI-2013/107(要求来自以下一个或多个或所有美国临时专利申请的权益：提交于2014年9月24日的62/054,490；提交于2014年6月10日的62/010,441；以及各自提交于2013年12月12日的61/915,118、61/915,215和61/915,148)(“粒子递送PCT”)，将其通过引用并入本文，关于一种制备含有sgRNA-和-Cas9蛋白的粒子的方法，该方法包括将包含sgRNA和Cas9蛋白(和任选地HDR模板)的混合物与以下混合物混合，该混合物包含表面活性剂、磷脂、生物可降解聚合物、脂蛋白和醇或基本上由其组成或由其组成；以及来自这样的工艺的粒子。例如，其中使Cas9蛋白和sgRNA在适合的温度(例如，15℃-30℃，例如，20℃-25℃，例如，室温)下以适合的摩尔比(例如，3:1至1:3或2:1至1:2或1:1)有利地在无菌、无核酸酶缓冲液(例如，1X PBS)中一起混合适合的时间(例如，15-45，如30分钟)。分开地，将粒子组分(如或包含：表面活性剂，例如阳离子脂质，例如1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；磷脂，例如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)；生物可降解聚合物，如乙二醇聚合物或PEG，和脂蛋白，如低密度脂蛋白，例如胆固醇)溶解于醇(有利地C_1-6烷基醇，如甲醇、乙醇、异丙醇，例如100％乙醇)中。将这两种溶液混合在一起以形成含有Cas9-sgRNA复合物的粒子。因此，在粒子中配制整个复合物之前，可以使sgRNA与该Cas9蛋白预复合。可以制备具有不同摩尔比的不同已知组分的配制品，以促进将核酸递送到细胞(例如1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1,2-二十四酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、聚乙二醇(PEG)和胆固醇)。例如，DOTAP:DMPC:PEG:胆固醇摩尔比可以是DOTAP>

本发明涉及用于控制涉及序列靶向的基因表达的系统、方法、和组合物的工程化和优化，该序列靶向例如涉及CRISPR-Cas系统及其组分的基因组干扰或基因编辑。在有利的实施例中，该Cas酶是Cas9，优选SpCas9或SaCas9。

本发明方法的一个优点在于，该CRISPR系统避免了脱靶结合及其所产生的副作用。这是通过使用被安排为具有针对靶DNA的高度序列特异性的系统而实现的。

基于可编程核酸酶(如锌指核酸酶、转录激活子样效应子核酸酶和CRISPR-Cas9)的基因组编辑技术发展的最近进展已经显著提高了申请人在真核细胞的基因组中做出精确改变的能力。基因组编辑已经通过促进产生病理过程的更准确的细胞模型和动物模型扩宽了申请人阐明遗传学对疾病的贡献的能力。可编程核酸酶的特别诱人的应用是直接校正受影响组织和细胞中的遗传突变以治疗传统疗法难以治疗的遗传疾病的潜力。申请人在本文提供了关于发展基于可编程核酸酶的疗法的当前进展连同未来前景和挑战的讨论。

在人类基因组中的大约25,000个注释基因中，超过3,000个基因的突变已经与疾病表型相联系(www.omim.org/statistics/geneMap)，并且正在以惊人的快速节奏发现更具疾病相关性的遗传变异。现在，由于测序成本的急剧下降、人类基因组计划的完成以及来自患者的基因组测序数据的指数增长，遗传学在人类健康中的作用已经成为研究、临床医学和靶向治疗剂的开发的主要关注领域[瓦尔德(Lander)，E.S.《自然》(Nature)470，187-197(2011)]。在申请人对疾病的遗传基础的理解上，这些进展已经改善了申请人对疾病机制的理解并且指向潜在的治疗策略。然而，尽管在药物开发中提出了有效的治疗假设并且做出了强有力的努力，但是使用小分子治疗具有强遗传贡献的疾病仅取得了数目有限的成功[托厄尼(Thoene)，J.G.用于遗传疾病的小分子疗法(Small molecule therapy forgenetic disease)，(剑桥大学出版社(Cambridge University Press)，剑桥，英国；纽约，2010)]。因此，需要替代性方法。新兴的能够修饰受疾病影响的细胞和组织中的核酸的治疗策略具有巨大的治疗潜力。由于它们的遗传学定义明确并且通常缺乏安全有效的治疗替代方案，单基因的高度渗透性疾病(如重症联合免疫缺陷(SCID)、血友病)以及某些酶缺陷已经成为这样的疗法的焦点。

迄今开发的两种最强大的遗传治疗策略是能够经由转基因表达补偿丢失的基因功能的病毒基因疗法和通过敲低靶mRNA来介导缺陷基因的靶向阻遏的RNA干扰(RNAi)(综述于凯(Kay)，M.A.《自然综述·遗传学》(Nature reviews.Genetics)12，316-328(2011)和瓦依希纳威(Vaishnaw)，A.K.等人《科学》(Silence)1，14(2010))。病毒基因疗法已经成功地用于治疗影响造血系统的单基因隐性障碍(如SCID和威斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome))，通过将受影响基因的功能拷贝半随机地整合进造血干细胞/祖细胞的基因组中[加斯帕(Gaspar)，H.B.等人《科学转化医学》(Sciencetranslational medicine)3，97ra79(2011)；豪(Howe)，S.J.等人《临床研究杂志》(TheJournal of clinical investigation)118，3143-3150(2008)；阿优特(Aiuti)，A.等人《科学》(Science)341，1233151(2013)]。RNAi已经用于抑制尤其牵涉在癌症、年龄相关性黄斑变性和TTR-淀粉样变性中的基因的功能，以便在临床试验中产生治疗作用(www.clinicaltrials.gov，试验编号：NCT00689065、NCT01961921和NCT00259753)。尽管有希望并且最近成功了，病毒基因疗法和RNAi具有防止它们用于大量疾病的实用性的限制。例如，病毒基因疗法可以引起插入诱变和转基因表达调节异常[豪(Howe)，S.J.等人《临床研究杂志》(The Journal of clinical investigation)118，3143-3150(2008)]。可替代地，RNAi只能抑制靶基因的表达，因此限制了其只用于敲低是有益的靶标。并且，RNAi通常不能完全抑制基因表达，并且因此不太可能为基因功能的完全消除对于治疗而言是必要的疾病提供益处。可以克服这些限制的令人兴奋的替代方案是精确修饰靶细胞的基因组，从而去除或校正有害突变或插入保护性突变。卡地亚.沃茨(Cartier.

Watts)，“造血干细胞扩增与基因治疗(Hematopoietic Stem Cell Expansionand Gene Therapy)”《细胞疗法》(Cytotherapy)，13(10):1164-1171.doi:10.3109/14653249.2011.620748(2011)，通过引用并入本文连同它引用的文献，如同完整地陈述一样，讨论了造血干细胞(HSC)基因疗法(例如，病毒介导的造血干细胞(HSC)基因疗法)，作为许多障碍的极具吸引力的治疗选择，这些障碍包括血液学病症、免疫缺陷(包括HIV/AIDS)以及其他遗传障碍，像溶酶体贮积病，包括SCID-X1、ADA-SCID、β-地中海贫血、X连锁CGD、威斯科特-奥尔德里奇综合征、范科尼贫血、肾上腺脑白质营养不良(ALD)和异染性脑白质营养不良(MLD)。

威廉姆斯(Williams)，“扩宽造血干细胞遗传疗法的适应症(Broadening theIndications for Hematopoietic Stem Cell Genetic Therapies)”，《细胞·干细胞》(Cell Stem Cell)13:263-264(2013)，通过引用并入本文连同它引用的文献，如同完整地陈述一样，报道了慢病毒介导的基因转移进入来自患有溶酶体贮积病异染性脑白质营养不良症(MLD)的患者的HSC/P细胞中，所述疾病是由芳基硫酸酯酶A(ARSA)缺陷引起的导致神经脱髓鞘的遗传疾病；以及慢病毒介导的基因转移进入患有威斯科特-奥尔德里奇综合征(WAS)的患者的HSC中(患者具有缺损WAS蛋白，该蛋白是调节血液细胞谱系中的细胞骨架功能的小GTP酶CDC42的效应子，并且因此罹患伴有复发性感染、自身免疫性症状的免疫缺陷以及具有异常小的且功能异常的血小板的血小板减少，导致大量出血并且白血病和淋巴瘤的风险增加)。与使用慢病毒相对照，根据本领域的知识和本披露的教导，就MLD(芳基硫酸酯酶A(ARSA)缺陷)而言，本领域技术人员可以使用靶向并校正突变(芳基硫酸酯酶A(ARSA)缺陷)的CRISPR-Cas9系统来校正HSC(例如，用递送ARSA的编码序列的适合的HDR模板)。与使用慢病毒相对照，根据本领域的知识和本披露的教导，就WAS而言，本领域技术人员可以使用靶向并校正突变(WAS蛋白缺陷)的CRISPR-Cas9系统来校正HSC(例如，用递送WAS蛋白的编码序列的适合的HDR模板)；确切地说，sgRNA可以靶向引起WAS的突变(缺陷WAS蛋白)，并且HDR可以为WAS蛋白的正确表达提供编码。

根据本领域的知识和本披露的教导，就免疫缺陷病症(如HIV/AIDS)而言，本领域技术人员可以校正HSC，包括使HSC与靶向并敲除CCR5的CRISPR-Cas9系统接触。可以将靶向并敲除CCR5-和-Cas9蛋白的sgRNA(并且有利地是双指导物法，例如一对不同的sgRNA；例如，靶向原代人CD4+T细胞和CD34+造血干细胞和祖细胞(HSPC)中的两个临床相关基因B2M和CCR5的sgRNA)引入HSC中。可以给予这些细胞；并且任选地处理/扩增。参见卡地亚(Cartier)。还参见基姆(Kiem)，“用于HIV疾病的基于造血干细胞的基因治疗(Hematopoietic stem cell-based gene therapy for HIV disease)”，《细胞·干细胞》(Cell Stem Cell).2012年2月3日；10(2):137-147；通过引用并入本文连同它引用的文献；曼达尔(Mandal)等人，“使用CRISPR/Cas9有效消除人造血干细胞和效应细胞中的基因(Efficient Ablation of Genes in Human Hematopoietic Stem and Effector Cellsusing CRISPR/Cas9)”，《细胞·干细胞》，第15卷，第5期，第643-652页，2014年11月6日；通过引用并入本文连同它引用的文献。作为另一种使用CRISPR-Cas9系统对抗HIV/AIDS的手段，还提及的是爱宾娜(Ebina)，“通过编辑HIV-1整合前病毒DNA抑制HIV-1表达的CRISPR/Cas9系统(CRISPR/Cas9system to suppress HIV-1expression by editing HIV-1integrated proviral DNA)”《科技报告》(SCIENTIFIC REPORTS)|3:2510|DOI:10.1038/srep02510，通过引用并入本文连同它引用的文献。

基于可编程核酸酶(如锌指核酸酶(综述于乌尔诺夫(Urnov)，F.D.等人《自然综述·遗传学》(Nature reviews.Genetics)11，636-646(2010))、转录激活子样效应子核酸酶(综述于博格达诺韦(Bogdanove)，A.J.&福亚塔斯(Voytas)，D.F.《科学》(Science)333，1843-1846(2011))和规律间隔成簇短回文重复(CRISPR)相关核酸酶(综述于徐(Hsu)，P.D.等人《细胞》(Cell)157，1262-1278(2014)))正在打开在患病细胞和组织中实现治疗性基因组编辑的可能性。申请人在本文提供了最新综述。

基因组编辑技术

可编程核酸酶使得能够通过在特定基因组座位处引入靶向DNA双链断裂(DSB)来进行精确基因组编辑。DSB随后向DNA损伤发信号并且向该DSB位点募集用于非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)的内源修复机器，以介导基因组编辑。

迄今，已经开发了三种主要类别的核酸酶，以使得能够进行位点特异性基因组编辑，它们是锌指核酸酶(ZFN，图12，左图)[金姆(Kim)，Y.G.等人《美国国家科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica)93，1156-1160(1996)；乌尔夫(Wolfe)，S.A.等人《生物物理学和生物分子结构年度综论》(Annual review of biophysics and biomolecular structure)29，183-212(2000)；彼彼科娃(Bibikova)，M.等人《科学》(Science)300，764(2003)；彼彼科娃，M.等人《遗传学》(Genetics)161，1169-1175(2002)；米勒(Miller)，J.等人《欧洲分子生物学组织杂志》(The EMBO journal)4，1609-1614(1985)；米勒，J.C.等人《自然生物技术》(Naturebiotechnology)25，778-785(2007)]、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN，图1，中图)[博赫(Boch)，J.等人《科学》326，1509-1512(2009)；莫斯科(Moscou)，M.J.&博格达诺韦(Bogdanove)，A.J.《科学》326，1501(2009)；克里斯蒂安(Christian)，M.等人《遗传学》186，757-761(2010)；米勒，J.C.等人《自然生物技术》29，143-148(2011)]和CRISPR相关核酸酶Cas9(图1，右图)[博洛坦(Bolotin)，A.等人《微生物学》(Microbiology)151，2551-2561(2005)；巴尔朗格(Barrangou)，R.等人《科学》315，1709-1712(2007)；加尔诺(Garneau)，J.E.等人《自然》(Nature)468，67-71(2010)；德尔特泛亚(Deltcheva)，E.等人《自然》471，602-607(2011)；萨普拉诺斯卡(Sapranauskas)，R.等人《核酸研究》(Nucleic acidsresearch)39，9275-9282(2011)；季聂克(Jinek)，M.等人《科学》337，816-821(2012)；加斯纳斯(Gasiunas)，G.等人《美国国家科学院院刊》109，E2579-2586(2012)；Cong(丛)，L.等人《科学》339，819-823(2013)；玛丽(Mali)，P.等人《科学》339，823-826(2013)]。基于其DNA识别模式，这三种类型的核酸酶系统可以被大致可分为两类-其中ZFN和TALEN经由蛋白质-DNA相互作用实现特异性DNA结合，Cas9经由直接与靶DNA碱基配对的短RNA指导分子被靶向特异性DNA序列(图13)。ZFN和TALEN是由融合到序列无关核酸酶结构域的DNA结合结构域组成的嵌合酶FokI[金姆(Kim)，Y.G.等人《美国国家科学院院刊》(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America)93，1156-1160(1996)；克里斯蒂安(Christian)，M.等人《遗传学》(Genetics)186，757-761(2010)]。重新靶向ZFN和TALEN需要DNA结合结构域的蛋白质工程化，这对于ZFN而言是特别具有挑战性的并且对于TALEN而言是依然困难的[伊萨兰(Isalan)，M.《自然方法》(Nature methods)9，32-34(2012)；孙(Sun)，N.&赵(Zhao)，H.《生物技术与生物工程》(Biotechnology andbioengineering)110，1811-1821(2013)]。相比之下，Cas9蛋白是不变的并且可以通过改变伴随RNA指导物的序列的一小部分而被容易地重新靶向新的基因组座位。已经证明所有三种核酸酶都可以在范围广泛的模式生物和哺乳动物细胞中实现有效的基因组编辑并且现在业界和学术界都在努力将这些工具开发为治疗剂[泰巴斯(Tebas)，P.等人《新英格兰医学杂志》(The New England journal of medicine)370，901-910(2014)；吉诺维斯(Genovese)，P.等人《自然》(Nature)510，235-240(2014)；李(Li)，H.等人《自然》475，217-221(2011)；印(Yin)，H.等人《自然生物技术》(Nature biotechnology)32，551-553(2014)]。

一旦已经产生DSB，便可以通过NHEJ或HDR修复病灶，取决于细胞状态和修复模板的存在。在不需要修复模板的方法中，NHEJ可以通过直接将两个DSB末端重新连接来修复病灶。尽管NHEJ介导的DSB修复可以是准确的，但是归因于核酸酶活性，通过NHEJ机器重复修复同一DSB最终导致形成桥接断裂位点的小插入或缺失突变[彼彼科娃(Bibikova)，M.等人《遗传学》(Genetics)161，1169-1175(2002)]。被引入基因的编码序列中的此类插入或缺失(indel)可以引起移码突变，这经由无义介导的衰变导致mRNA降解而耗尽功能基因，或导致产生非功能性截短型蛋白[亨策(Hentze)，M.W.&库洛兹科(Kulozik)，A.E.《细胞》(Cell)96，307-310(1999)]。因此，NHEJ可以用于与RNAi类似地抑制基因功能，然而，它通过向基因组中引入永久性共价修饰而导致靶向细胞中的基因表达的持续抑制。

比较起来，HDR允许研究者使用外源DNA模板来指定DSB修复的结果[彼彼科娃(Bibikova)，M.等人《科学》(Science)300，764(2003)；舒利卡(Choulika)，A.等人《分子和细胞生物学》(Molecular and cellular biology)15，1968-1973(1995)；彼彼科娃，M.等人《分子和细胞生物学》21，289-297(2001)；克雷西(Krejci)，L.等人《核酸研究》(Nucleicacids research)40，5795-5818(2012)；普莱西斯(Plessis)，A.等人《遗传学》(Genetics)130，451-460(1992)；鲁埃(Rouet)，P.等人《分子和细胞生物学》14，8096-8106(1994)鲁金(Rudin)，N.等人《遗传学》122，519-534(1989)]。引入靶向DSB后，在于模板DNA中掺入任何编码的改变的方法中，HDR机器可以使用外源提供的与断裂位点具有序列同源性的单链或双链DNA模板来合成用于修复病灶的DNA。例如，可以使用HDR连同用于直接校正有害突变的适当设计的修复模板，由此恢复基因功能同时保留基因表达的生理调节。

针对治疗应用的考虑事项

在基因组编辑治疗中第一个考虑事项是序列特异性核酸酶的选择。每个核酸酶平台都具有自己一套独特的长处和短处，其中的许多必须在治疗的背景下平衡以最大化治疗益处(图12)。

迄今，两种使用核酸酶的治疗性编辑方法已经显示出显著的前景：基因破坏和基因校正。基因破坏涉及刺激NHEJ以在遗传元件中产生靶向的indel，这通常导致对患者而言有益的功能缺失突变(图13A)。相比之下，基因校正使用HDR将致病突变直接逆转，从而恢复功能同时保留经校正元件的生理调节(图13B)。HDR还可以用于将治疗性转基因插入基因组中的限定“安全港”座位中，以恢复丢失的基因功能(图13C)。

为了使得特异性编辑治疗有效，在靶细胞群中必须达到足够高水平的修饰以逆转疾病症状。这种治疗性修饰的‘阈值’通过治疗后经编辑的细胞的健康度、和逆转症状所需的基因产物的量来确定。

细胞健康度与结果

关于健康度，相对于它们的未编辑对应物，编辑对经处理的细胞产生三种潜的在结果：增加、中性或降低的健康度。在健康度增加的情况下，例如在SCID-X1的治疗中，相对于其未编辑的对应物，修饰的造血祖细胞选择性地扩增。SCID-X1是一种由IL2RG基因的突变引起的疾病，该基因的功能为造血淋巴细胞谱系的适当发育所需[伦纳德(Leonard)，W.J.等人《免疫学综述》(Immunological reviews)138，61-86(1994)；考杉斯基(Kaushansky)，K.&威廉姆斯(Williams)，W.J.Williams《血液学》(hematology)，(麦格劳-希尔医学部(McGraw-Hill Medical)，纽约，2010)]。在通过接受针对SCID-X1的病毒基因疗法的患者和SCID-X1突变的自发校正的罕见实例进行的临床试验中，经校正造血祖细胞能够克服这种发育阻断并且相对于其患病对应物扩增以介导治疗[布索(Bousso)，P.等人《美国国家科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America)97，274-278(2000)；哈赛因-贝-阿比纳(Hacein-Bey-Abina)，S.等人《新英格兰医学杂志》(The New England journal of medicine)346，1185-1193(2002)；加斯帕(Gaspar)，H.B.等人《柳叶刀》(Lancet)364，2181-2187(2004)]。在经编辑细胞具有选择性优势的情况下，甚至低数量的经编辑细胞也可以通过扩增而增多，从而为患者提供治疗益处。相比之下，针对其他造血疾病(像慢性肉芽肿病(CGD))的编辑对于经编辑的造血祖细胞而言没有诱导健康度方面的变化，从而提高治疗性修饰的阈值。CGD是由编码吞噬细胞氧化酶蛋白的基因的突变引起的，这些蛋白通常被嗜中性粒细胞用于产生杀死病原体的活性氧[慕克吉(Mukherjee)，S.&思拉舍(Thrasher)，A.J.《基因》(Gene)525，174-181(2013)]。因为这些基因的功能障碍不影响造血祖细胞健康度或发育，而是仅仅影响成熟造血细胞类型抵抗感染的能力，所以经编辑的细胞在这种疾病中不可能优先扩增。的确，在基因疗法试验中已经观察到在CGD中的基因校正细胞中没有选择性优势，从而造成长期细胞植入困难[梅尔施(Malech)，H.L.等人《美国国家科学院院刊》(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America)94，12133-12138(1997)；康(Kang)，H.J.等人《分子疗法：美国基因治疗学会杂志》(Molecular therapy:thejournal of the American Society of Gene Therapy)19，2092-2101(2011)]。因此，相对于编辑产生增加的靶细胞健康度的疾病，治疗编辑产生中性健康度优势的疾病(像CGD)将需要显著更高水平的编辑。如果编辑赋予健康度劣势，正如恢复癌细胞中的肿瘤抑制基因的功能的情况，经修饰的细胞被其患病对应物胜过，从而使得治疗益处相对于编辑率而言较低。后一类别的疾病特别难以用基因组编辑疗法进行治疗。X连锁慢性肉芽肿病(CGD)是一种由于不存在吞噬细胞NADPH氧化酶或其活性降低而导致的宿主防御遗传性障碍。根据本披露和本领域的知识，本领域技术人员能够使用靶向并校正该突变(不存在吞噬细胞NADPH氧化酶或其活性降低)的CRISPR-Cas9系统(例如，用递送吞噬细胞NADPH氧化酶的编码序列的适合的HDR模板)；确切地说，sgRNA可以靶向引起CGD的突变(缺陷吞噬细胞NADPH氧化酶)，并且HDR可以为吞噬细胞NADPH氧化酶的正确表达提供编码。

除细胞健康度之外，治疗疾病所必需的基因产物的量也影响用于逆转症状所必须达到的治疗性基因组编辑的最低水平。B型血友病是一种基因产物水平的小变化可以导致临床结果的显著变化的疾病。这种疾病是由编码因子IX的基因的突变引起的，所述因子是一种通常由肝脏分泌进入血液的蛋白质，在血液中它作为凝血级联的组分起作用。B型血友病的临床严重性与因子IX活性的量相关。严重疾病与低于1％的正常活性相关，较轻形式的疾病与高于1％的因子IX活性相关[考杉斯基(Kaushansky)，K.&威廉姆斯(Williams)，W.J.Williams《血液学》(hematology)，(麦格劳-希尔医学部(McGraw-Hill Medical)，纽约，2010)；洛夫基斯特(Lofqvist)，T.等人《内科医学杂志》(Journal of internalmedicine)241，395-400(1997)]。这表明可以在甚至小百分比的肝细胞中恢复因子IX表达的编辑疗法对临床结果可以具有大的影响。一项使用ZFN校正出生后不久的B型血友病小鼠模型的研究证明3％-7％的校正足以逆转疾病症状，从而为这一假设提供了临床前证据[李(Li)，H.等人《自然》(Nature)475，217-221(2011)]。

基因产物水平的小变化便可以影响临床结果的障碍以及经编辑的细胞存在健康度优势的疾病是基因组编辑疗法的理想靶标，因为治疗性修饰的阈值足够低以允许给出当前技术的成功机会较高。

靶向这些疾病现在已经在临床前水平和I期临床试验下取得了编辑治疗的成功(参见下表)。需要改进DSB修复途径操纵和核酸酶递送，以将这些有希望的结果扩展到对于经编辑的细胞而言具有中性健康度优势或需要较大量的基因产物用于治疗的疾病。下表显示了针对治疗模型的基因组编辑应用的实例。

一个实施例包括使携带B型血友病、SCID(例如，SCID-X1、ADA-SCID)或遗传性酪氨酸血症突变的造血干细胞与靶向感兴趣的基因组座位的sgRNA和Cas9蛋白接触，就B型血友病、SCID(例如，SCID-X1、ADA-SCID)或遗传性酪氨酸血症而言(例如，如在李(Li)、吉诺维斯(Genovese)或印(Yin)中的)；有利地与校正该突变的适合的HDR模板接触。

DSB修复途径的效率

NHEJ和HDR DSB修复活性随细胞类型和细胞状态而显著变化。NHEJ不是高度地受细胞周期调节并且跨细胞类型是有效的，从而允许在可及靶细胞群中进行高水平的基因破坏。相比之下，HDR主要在S/G2期过程中起作用，并且因此局限于活跃分裂的细胞，从而限制了需要对有丝分裂细胞进行精确基因组修饰的治疗[齐恰(Ciccia)，A.&埃利奇(Elledge)，S.J.《分子细胞》(Molecular cell)40，179-204(2010)；查普曼(Chapman)，J.R.等人《分子细胞》47，497-510(2012)]。

经由HDR的校正效率可以通过靶向座位的表观遗传学状态或序列或者使用的具体修复模板构型(单链对比双链、长同源臂对比短同源臂)进行控制[哈赛因-贝-阿比纳(Hacein-Bey-Abina)，S.等人《新英格兰医学杂志》(The New England journal ofmedicine)346，1185-1193(2002)；加斯帕(Gaspar)，H.B.等人《柳叶刀》(Lancet)364，2181-2187(2004)；博伊默(Beumer)，K.J.等人G3(2013)]。NHEJ和HDR机器在靶细胞中的相对活性也可以影响基因校正效率，因为这些途径可以竞争以解决DSB[博伊默(Beumer)，K.J.等人《美国国家科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America)105，19821-19826(2008)]。HDR还赋予了伴随NHEJ策略未见的递送挑战，因为它需要同时递送核酸酶和修复模板。在实践中，这些约束迄今为止已经在治疗相关细胞类型中导致低水平的HDR。临床转化因此在很大程度上已经聚焦于NHEJ策略来治疗疾病，尽管已经针对B型血友病和遗传性酪氨酸血症小鼠模型描述了概念验证临床前HDR治疗[李(Li)，H.等人《自然》(Nature)475，217-221(2011)；印(Yin)，H.等人《自然生物技术》(Nature biotechnology)32，551-553(2014)]。

细胞和组织靶向

任何给定的基因组编辑应用都可以包括蛋白质、小RNA分子和/或修复模板的组合，使得递送这多个部分比递送小分子治疗剂显著更具有挑战性。已经开发了两种用于递送基因组编辑工具的主要策略：离体策略和体内策略。在离体治疗中，将患病细胞从体内取出，编辑并且然后移植回患者体内(图14，顶部图)。离体编辑具有以下优点：允许靶细胞群被明确定义并且指定递送到细胞中的治疗性分子的具体剂量。当脱靶修饰是问题时，后一考虑事项可能是特别重要的，因为滴定核酸酶的量可以减少此类突变(徐(Hsu)等人，2013)。离体方法的另一个优点是可以实现典型高的编辑率，这归因于使蛋白质和核酸进入用于研究和基因疗法应用的培养中的细胞中的有效递送系统的发展。

然而，离体方法存在两大将其应用局限于小数目的疾病的缺陷。首先，在体外操纵时靶细胞必须能够存活。对于许多组织(像脑)而言，在体外培养细胞是主要挑战，因为细胞不能存活或失去对其体内功能必需的特性。因此，离体治疗在很大程度上局限于具有易于离体培养和操纵的成体干细胞的组织，如造血系统。第二，重新引入患者体内后，培养细胞通常植入不佳，从而降低治疗有效性。然而，植入可以通过在移植之前耗尽宿主细胞的消融预处理方案来增强，这些方案在临床上是可行的但是向患者引入显著的风险[邦恩(Bunn)，H.F.&阿斯特尔(Aster)，《血液病病理生理学杂志》(J.Pathophysiology of blooddisorders)，(麦格劳-希尔公司(McGraw-Hill)，纽约，2011)]。

体内基因组编辑涉及将编辑系统直接递送到处于其天然组织中的细胞类型(图14，底部图)。体内编辑允许治疗受影响细胞群不易于离体操纵的疾病。此外，将核酸酶原位递送至细胞允许处理多种组织和细胞类型。相对于离体疗法而言，这些特性可能允许将体内治疗应用于更大范围的疾病。

迄今为止，在很大程度上已经通过使用具有限定的组织特异性向性的病毒载体实现了体内编辑。就携带负荷物的能力和向性而言，此类载体目前是受限的，将这种模式的治疗局限于用临床上有用的载体进行转导是有效的器官系统，如肝、肌肉和眼睛[科特曼(Kotterman)，M.A.&谢弗(Schaffer)，D.V.《自然综述·遗传学》(Naturereviews.Genetics)15，445-451(2014)；纽伦(Nguyen)，T.H.&费里(Ferry)，N.《基因治疗》(Gene therapy)11增刊1，S76-84(2004)；博伊(Boye)，S.E.等人《分子疗法：美国基因治疗学会杂志》(Molecular therapy:the journal of the American Society of GeneTherapy)21，509-519(2013)]。

体内递送的主要潜在障碍是可能响应于治疗所必需的大量病毒而产生的免疫应答，但是这种现象并不是基因组编辑特有的并且伴随其他基于病毒的基因疗法也有观察到[贝西(Bessis)，N.等人《基因治疗》(Gene therapy)11增刊1，S10-17(2004)]。还有可能的是来自编辑核酸酶本身的肽被呈现在MHC I类分子上以刺激免疫应答，尽管几乎没有支持这发生在临床前水平下的证据。这种模式的治疗的另一个主要困难是控制编辑基因组的核酸酶在体内的分布以及因此的剂量，从而产生可能难以预测的脱靶突变谱。

成功的基因组编辑治疗策略的实例

离体编辑治疗

纯化、培养和移植造血细胞的由来已久的临床专业知识已经使得影响血液系统的疾病(如SCID、范科尼贫血、威斯科特-奥尔德里奇综合征和镰状细胞贫血)成为离体编辑治疗的焦点。聚焦于造血细胞的另一个原因是归功于针对血液障碍设计基因治疗的先前努力，已经存在相对较高效率的递送系统。尽管存在这些优点，但是移植后细胞植入的效率通常较低使得这种模式的治疗必然应用于经编辑的细胞具有健康度优势的疾病，这样使得小数目的植入的经编辑细胞可以扩增并治疗疾病。

范科尼贫血：至少15个基因(FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1/BRCA2、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ/BACH1/BRIP1、FANCL/PHF9/POG、FANCM、FANCN/PALB2、FANCO/Rad51C和FANCP/SLX4/BTBD12)的突变可以引起范科尼贫血。产生自这些基因的蛋白质涉及在称为FA途径的细胞过程中。当产生新的DNA拷贝的过程(称为DNA复制)由于DNA损伤被阻断时，FA途径被开启(激活)。FA途径将某些蛋白送至损害区域，这触发了DNA修复，所以DNA复制可以继续。FA途径对某一类型的DNA损伤(称为链间交联(ICL))特别具有响应性。当DNA的相对链上的两个DNA结构单元(核苷酸)异常地附接或连接在一起时出现ICL，这使得DNA复制过程停止。ICL可以通过在体内产生的毒性物质的积聚或通过用某些癌症治疗药物进行治疗而引起。将八种与范科尼贫血相关的蛋白质集合在一起以形成称为FA核心复合物的复合物。FA核心复合物激活两种称为FANCD2和FANCI的蛋白质。这两种蛋白质的激活将DNA修复蛋白带至ICL区域，因此可以去除交联并且DNA复制可以继续。FA核心复合物。更具体地，FA核心复合物是由FANCA、FANCB、FANCC、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL和FANCM组成的核多蛋白复合物，作为E3泛素连接酶起作用并且介导ID复合物的激活，所述ID复合物是由FANCD2和FANCI构成的异二聚体。一旦被单遍在蛋白化，它便与FA途径下游的经典肿瘤抑制剂(包括FANCD1/BRCA2、FANCN/PALB2、FANCJ/BRIP1和FANCO/Rad51C)相互作用并且由此促进经由同源重组(HR)进行的DNA修复。80％至90％的FA情况归因于以下三个基因之一的突变：FANCA、FANCC和FANCG。这些基因提供用于产生FA核心复合物的组分的指令。与FA核心复合物相关的此类基因的突变将使得该复合物丧失功能并且破坏整个FA途径。其结果是，DNA损伤未被有效修复并且ICL随时间积累。盖泽尔哈特(Geiselhart)，“综述文章，通过范科尼贫血途径破坏信号传导导致异常的造血干细胞生物学：潜在机制和可能的治疗策略(Review Article,Disrupted Signaling through the Fanconi Anemia Pathway Leadsto Dysfunctional Hematopoietic Stem Cell Biology:Underlying Mechanisms andPotential Therapeutic Strategies)”，《贫血》(Anemia)第2012卷(2012)，文章ID265790，http://dx.doi.org/10.1155/2012/265790，讨论了FA和涉及股骨内注射编码FANCC基因的慢病毒从而在体内校正HSC的动物实验。根据本披露和本领域的知识，人们可以使用靶向与FA相关的突变中的一个或多个的CRISPR-Cas9系统，例如具有一种或多种sgRNA和一种或多种HDR模板的CRISPR-Cas9系统，这一种或多种sgRNA和这一种或多种HDR模板对应地靶向引起FA的突变FANCA、FANCC或FANCG中的一个或多个并且提供FANCA、FANCC或FANCG中一者或多者的校正表达。

一种这样的疾病是HIV，其中感染导致CD4+T细胞的健康度劣势。

用于HIV治疗的基因组编辑的基本原理源于以下观察结果，即对CCR5(病毒的细胞辅助受体)的功能缺失突变纯合的个体对感染具有高度抗性并且以另外方式是健康的，从而表明通过基因组编辑模拟这种突变可以是安全且有效的治疗策略[刘(Liu)，R.等人《细胞》(Cell)86，367-377(1996)]。这一想法在临床上得到了验证，当向感染HIV的患者给予来自对功能缺失CCR5突变纯合的供体的异体骨髓移植时，产生不可检测水平的HIV以及正常CD4T细胞计数的恢复[赫特尔(Hutter)，G.等人《新英格兰医学杂志》(The New Englandjournal of medicine)360，692-698(2009)]。尽管由于成本和潜在的移植物抗宿主疾病，骨髓移植对于大多数HIV患者而言是不现实的治疗策略，但是转化患者自己的T细胞的HIV疗法是现实的。

使用ZFN和NHEJ敲除人源化HIV小鼠模型中的CCR5的早期研究显示移植CCR5编辑的CD4T细胞提高病毒载量和CD4T细胞计数[佩雷斯(Perez)，E.E.等人《自然生物技术》(Nature biotechnology)26，808-816(2008)]。重要的是，这些模型还显示HIV感染导致对CCR5裸细胞的选择，表明编辑赋予健康度优势并且潜在地允许小数目的经编辑的细胞产生治疗作用。

作为这项和其他有希望的临床前研究的结果，敲除患者T细胞中的CCR5的基因组编辑治疗现在已经在人类中进行测试[奥尔特(Holt)，N.等人《自然生物技术》(Naturebiotechnology)28，839-847(2010)；李(Li)，L.等人《分子疗法：美国基因治疗学会杂志》(Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy)21，1259-1269(2013)]。在最近的I期临床试验中，从患有HIV的患者体内取出CD4+T细胞，用被设计成敲除CCR5基因的ZFN进行编辑并且以自体方式移植回患者体内[泰巴斯(Tebas)，P.等人《新英格兰医学杂志》(The New England journal of medicine)370，901-910(2014)]。来自这个试验的早期结果表明通过ZFN对CCR5座位进行基因组编辑是安全的，但是随访时间太短以至于不能充分理解治疗的风险和功效。

离体编辑治疗最近已经被扩展成包括基因校正策略。在来自吉诺维斯(Genovese)和同事的一篇最近的论文中克服了离体HDR的障碍，他们在获得自罹患SCID-X1的患者的造血干细胞(HSC)中实现了突变的IL2RG基因的基因校正[吉诺维斯，P.等人《自然》(Nature)510，235-240(2014)].吉诺维斯(Genovese)等人使用多模式策略完成了HSC中的基因校正。首先，使用含有编码IL2RG的治疗性cDNA的HDR模板的整合缺陷型慢病毒转导HSC。转导后，用对靶向IL2RG中的突变热点的ZFN进行编码的mRNA对细胞进行电穿孔，以基于基因校正刺激HDR。为了提高HDR率，用小分子优化培养条件，以促使HSC分裂。通过优化的培养条件、核酸酶和HDR模板，以治疗上相关的比率在培养中获得来自SCID-X1患者的经基因校正的HSC。来自经历相同的基因校正程序的未受影响的个体的HSC在小鼠体内可以维持长期造血功能，即HSC功能的黄金标准。HSC能够产生所有造血细胞类型并且可以进行自体移植，使得它们成为所有造血遗传障碍的极有价值的细胞群[韦斯曼(Weissman)，I.L.&静流(Shizuru)，J.A.《血液》(Blood)112，3543-3553(2008)]。原则上，经基因校正的HSC可以用于治疗范围广泛的遗传血液障碍，使得这项研究成为治疗性基因组编辑的令人振奋的突破。

体内编辑治疗

体内编辑治疗面对与离体策略类似的挑战并且还被小数目的有效递送系统所限制。靶座位的无效修饰由于递送方面的任何无效而加剧，使得用这种模式的治疗特别难以治疗缺乏稳健的递送平台的组织。然而，对于递送有效的器官系统而言，已经取得了许多令人振奋的临床治疗成功。

成功的体内编辑治疗的第一个实例在B型血友病小鼠模型中得到证实[李(Li)，H.等人《自然》(Nature)475，217-221(2011)]。如较早所指出的，B型血友病是一种由编码因子IX的基因的功能缺失突变引起的X连锁隐性障碍，所述因子是凝血级联的关键组分。将受严重影响个体体内的因子IX活性恢复到高于1％的其水平可以将该疾病转化为显著更轻的形式，因为从年幼时预防性地向此类患者体内输注重组因子IX达到此类水平在很大程度上改善临床并发症[洛夫基斯特(Lofqvist)，T.等人《内科医学杂志》(Journal of internalmedicine)241，395-400(1997)]。因此，仅需低水平的HDR基因校正来改变患者的临床结果。此外，因子IX由肝合成和分泌，肝是可以被编码编辑系统的病毒载体有效转导的器官。根据本领域的知识和本披露的教导，就B型血友病而言，本领域技术人员可以使用靶向并校正突变(由编码因子IX的基因的功能缺失突变引起的X连锁隐性障碍)的CRISPR-Cas9系统来校正HSC(例如，用递送因子IX的编码序列的适合的HDR模板)；确切地说，sgRNA可以靶向引起B型血友病的突变，并且HDR可以为因子IX的正确表达提供编码。

使用编码ZFN的嗜肝腺相关病毒(AAV)血清型和校正HDR模板，在鼠类肝中实现突变的、人源化因子IX基因的高达7％的基因校正[李(Li)，H.等人《自然》(Nature)475，217-221(2011)]。这使得凝块形成动力学(凝血级联功能的量度)得到改进，第一次证明体内编辑治疗不仅可行，而且有效。

在此项研究的基础上，其他团体最近已经使用用CRISPR-Cas9进行的肝体内基因组编辑成功地治疗遗传性酪氨酸血症小鼠模型并且产生提供针对心血管疾病的保护的突变。这两种不同的应用证明了这种方法用于涉及肝功能异常的障碍的多功能性[印(Yin)，H.等人《自然生物技术》(Nature biotechnology)32，551-553(2014)；丁(Ding)，Q.等人《循环研究》(Circulation research)115，488-492(2014)]。为了证明此策略是广泛适用的，必需将体内编辑应用于其他器官系统。目前，正在努力优化病毒和非病毒载体两者，以扩展可以用这种模式的治疗进行治疗的障碍的范围[科特曼(Kotterman)，M.A.&谢弗(Schaffer)，D.V.《自然综述·遗传学》(Nature reviews.Genetics)15，445-451(2014)；印(Yin)，H.等人《自然综述·遗传学》15，541-555(2014)]。

编辑性核酸酶的特异性

基因组编辑工具的特异性是临床应用的主要安全性问题之一。遗传修饰是永久的，并且有害的脱靶突变具有产生具有致癌潜力和其他不希望的副作用的细胞的可能。此外，由脱靶编辑造成的致癌突变可以导致经编辑的细胞扩增，因此，甚至低水平的脱靶诱变也可能具有灾难性后果。

有两个问题仍然悬而未决：评价和减少脱靶效应。大量的研究已尝试评价ZFN、TALEN和Cas9核酸酶的靶向特异性。数量有限的表征ZFN[帕塔纳雅克(Pattanayak)，V.等人《自然方法》(Nature methods)8，765-770(2011)；加布里埃尔(Gabriel)，R.等人《自然生物技术》(Nature biotechnology)29，816-823(2011)]和TALEN[桂灵尔(Guilinger)，J.P.等人《自然方法》11，429-435(2014)]特异性的研究仅仅强调了检测ZFN和TALEN脱靶活性的挑战。值得注意的是，这两项尝试表征同一对靶向CCR5的ZFN的脱靶谱的独立研究已经公布了不同的且非重叠的脱靶位点，这突出了与核酸酶特异性分析相关的挑战。

许多研究已经尝试评价Cas9的特异性，部分归因于靶向Cas9的机构的RNA指导的DNA的简单性，这使得显著更易于基于沃森-克里克碱基配对规则建立关于可能的脱靶机制的假说。虽然最初的细菌[萨普拉诺斯卡(Sapranauskas)，R.等人《核酸研究》(Nucleicacids research)39，9275-9282(2011)]、生物化学[季聂克(Jinek)，M.等人《科学》(Science)337，816-821(2012)；加斯纳斯(Gasiunas)，G.等人《美国国家科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica)109，E2579-2586(2012)]和哺乳动物[丛(Cong)，L.等人《科学》339，819-823(2013)]实验已经表明指导序列的3`8-12bp种子区对单碱基错配可以是敏感的，但是进一步的工作表明显示这种经验法则不一定准确，尤其是在存在高浓度的Cas9和指导RNA的情况下[付(Fu)，Y.等人《自然生物技术》(Nature biotechnology)31，822-826(2013)；丘(Cho)，S.W.等人《基因组研究》(Genome research)24，132-141(2014)；徐(Hsu)，P.D.等人《自然生物技术》31，827-832(2013)；玛丽(Mali)，P.等人《自然生物技术》31，833-838(2013)；帕塔纳雅克(Pattanayak)，V.等人《自然生物技术》31，839-843(2013)]。许多这些研究是在细胞系中进行的并且在与中靶序列具有高水平同源性的基因组位点处检查了Cas9介导的诱变，并且不出所料地发现，高度同源的脱靶位点亚组被该核酸酶显著突变。然而，这些研究所评价的可能脱靶位点的范围被局限于计算机预测的位点。最近，经Cas9编辑的细胞系的全基因组测序揭示了低发生率的脱靶突变，这表明Cas9介导的基因组编辑可以是特异性的[贝雷斯(Veres)，A.等人《细胞·干细胞》(Cell stem cell)15，27-30(2014)]。尽管有这些研究，但是仍然迫切需要使用更先进的方法像直接捕获DSB[克罗塞托(Crosetto)，N.等人《自然方法》(Nature methods)10，361-365(2013)]以及可以检测潜在地由核酸酶处理所赋予的更大的结构变化(即易位)的技术对全基因组脱靶进行无偏评估，并且应当进行无偏评估以理解由可编程核酸酶赋予的诱变的真正风险。值得注意的是脱靶效应可以是细胞类型特异性的；例如具有异常调节的DSB修复途径的转化细胞系中的脱靶效应可能会高估在原代健康细胞中观察到的脱靶效应。

为了降低脱靶效应的频率，许多团体正在迅速改进Cas9的靶向特异性。例如，将Cas9转化进作为专性异二聚体起作用的单链DNA切口酶中，这显著减少在计算机预测的脱靶位点处的脱靶indel形成[玛丽(Mali)，P.等人《自然生物技术》(Nature biotechnology)31，833-838(2013)；兰(Ran)，F.A.等人《细胞》(Cell)154，1380-1389(2013)]。另外，基于无催化活性Cas9与FokI核酸酶结构域之间的融合将指导RNA的截短连同RNA指导的FokI核酸酶也能够实现改进水平的靶向特异性[付(Fu)，Y.等人《自然生物技术》(Naturebiotechnology)32，279-284(2014)；桂灵尔(Guilinger)，J.P.等人《自然生物技术》32，577-582(2014)；蔡(Tsai)，S.Q.等人《自然生物技术》32，569-576(2014)]。只要有可能，考虑将这些以及未来的改进的核酸酶策略用于治疗应用。

用于治疗应用(例如，基因组编辑)的Crispr-Cas系统和组合物

一般而言，除贯穿本文献关于CRISPR-Cas或CRISPR系统的讨论之外，该CRISPR-Cas或CRISPR系统是如在本文引用的文献(如WO 2014/093622(PCT/US2013/074667))中使用的，并且总共是指转录物和涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性的其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(涵盖“同向重复”和在内源CRISPR系统背景下的tracrRNA加工的部分同向重复)、指导序列(在内源CRISPR系统背景下也称为“间隔子(spacer)”)、或如本文使用的术语“RNA”(例如，指导Cas9的RNA，例如，CRISPR RNA和反式激活(tracr)RNA或单一指导RNA(sgRNA)(嵌合RNA))或来自CRISPR座位的其他序列和转录物。一般而言，CRISPR系统的特征为促进在靶序列的位点处的CRISPR复合物(在内源CRISPR系统的背景下也称为原型间隔子)的形成的元件。在CRISPR复合物形成的背景下，“靶序列”是指指导序列被设计为对其具有互补性的序列，其中在靶序列与指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。靶序列可以包含任何多核苷酸，如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施例中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在一些实施例中，可以通过计算机搜索重复基序来鉴定同向重复，其满足下列标准的任一项或全部：1.发现一个在II型CRISPR座位侧翼的基因组序列的2Kb窗口；2.跨从20到50bp；以及3.以20到50bp间隔开。在一些实施例中，可以使用这些标准中的2条，例如1和2、2和3、或1和3。在一些实施例中，可以使用所有这3条标准。在一些实施例中，在CRISPR复合物中可以优选的是该tracr序列具有一个或多个发夹并且长度是30个或更多个核苷酸、长度是40个或更多个核苷酸或长度是50个或更多个核苷酸；该指导序列长度是在10至30个核苷酸之间，该CRISPR/Cas酶是II型Cas9酶；在本发明的实施例中，术语指导序列和指导RNA可互换地使用，如在前述引用文献(如WO 2014/093622(PCT/US 2013/074667))中。一般而言，指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施例中，当使用适合的比对算法进行最佳比对是，在指导序列与其相应的靶序列之间的互补程度是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、或更多。可以使用用于比对序列的任何适合的算法来确定最佳比对，其非限制性实例包括史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法、尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法、基于伯罗斯-惠勒变换(Burrows-Wheeler Transform)的算法(例如伯罗斯-惠勒比对工具(Burrows WheelerAligner))、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft技术公司；在www.novocraft.com可获得)、ELAND(亿明达公司(Illumina)，圣地亚哥，加利福尼亚州)、SOAP(在soap.genomics.org.cn可获得)、以及Maq(在maq.sourceforge.net可获得)。在一些实施例中，指导序列在长度上为约或多于约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个、或更多个核苷酸。在一些实施例中，指导序列在长度上为少于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个、或更少的核苷酸。优选地，该指导序列是10-30个核苷酸的长度。可以通过任何适合的测定法来评估指导序列引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力。例如，足以形成CRISPR复合物的CRISPR系统的组分，包括有待测试的指导序列在内，可以例如通过用编码该CRISPR序列的组分的载体进行转染而被提供到具有相应靶序列的宿主细胞中，随后通过如本文所述的Surveyor测定来评估在该靶序列之内的优先切割。类似地，通过提供该靶序列、包括有待测试的指导序列在内的CRISPR复合物的组分、和不同于该测试指导序列的对照指导序列，并且比较在该测试指导序列与该对照指导序列反应之间的靶序列处的结合或切割率，可以在一个试管中评估靶多核苷酸序列的切割。其他测定法是可能的，并且将由本领域技术人员想到。指导序列可以被选择为靶向任何靶序列。在一些实施例中，该靶序列是在细胞的基因组内的序列。示例性靶序列包括在靶基因组中为独特的那些。例如，对于化脓链球菌Cas9，在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG的Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNNXGG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG的化脓链球菌Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNXGG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。对于嗜热链球菌CRISPR1Cas9，在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW的Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNNXXAGAAW(N是A、G、T、或C；X可以是任何物；并且W是A或T)在该基因组中单次出现。在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW的嗜热链球菌CRISPR1Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNXXAGAAW(N是A、G、T、或C；X可以是任何物；并且W是A或T)在该基因组中单次出现。对于化脓链球菌Cas9，在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG的Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNNXGGXG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG的化脓链球菌Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNXGGXG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。在这些序列的每一个中，“M”可以是A、G、T、或C，并且在序列鉴定中不必考虑为是独特的。在一些实施例中，指导序列被选择为降低在该指导序列内的二级结构程度。在一些实施例中，在最佳地折叠时，该指导序列的约或少于约75％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％、或更少的核苷酸参与自我互补碱基配对。可以通过任何适合的多核苷酸折叠算法来确定最佳折叠。一些算法是基于计算最小吉布斯(Gibbs)自由能。一种这样的算法的实例是mFold，正如祖克(Zuker)和施蒂格勒(Stiegler)《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)9(1981)，133-148)所描述。折叠算法的另一个实例是使用由维也纳大学(University of Vienna)的理论化学研究所(Institutefor Theoretical Chemistry)研发的在线网络服务器RNAfold(参见例如A.R.格鲁伯(A.R.Gruber)等人，2008，《细胞》(Cell)106(1):23-24；以及PA卡尔(PA Carr)和GM丘奇(GMChurch)，2009，《自然生物技术》(Nature Biotechnology)27(12):1151-62)。

一般而言，tracr配对序列包括与tracr序列具有足够互补性以促进下列一项或多项的任何序列：(1)在含有相应tracr序列的细胞中的侧翼为tracr配对序列的指导序列的切除；以及(2)在靶序列处的CRISPR复合物的形成，其中该CRISPR复合物包含杂交到tracr序列上的tracr配对序列。通常，互补程度是就tracr配对序列与tracr序列沿着这两个序列的较短者的长度的最佳比对而言。可以通过任何适合的比对算法来确定最佳比对，并且可以可以进一步对二级结构做出解释，如在该tracr序列或tracr配对序列之内的自我互补性。在一些实施例中，在进行最佳比对时，在该tracr序列与tracr配对序列之间沿着这两者的较短者的长度的互补程度是约或多于约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、或更高。在一些实施例中，该tracr序列在长度上为约或多于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个、或更多个核苷酸。在一些实施例中，该tracr序列和tracr配对序列被包含在单个转录物中，使得在这两者之间的杂交产生具有二级结构(如发夹)的转录物。在本发明的一个实施例中，该转录物或转录的多核苷酸序列具有至少两个或更多个发夹。在优选的实施例中，该转录物具有两个、三个、四个或五个发夹。在本发明的一个另外的实施例中，该转录物具有至多五个发夹。在发夹结构中，在该环的最终“N”和上游的序列5’的部分相应于该tracr配对序列，并且该环的序列3’的部分相应于该tracr序列。另外的包含指导序列、tracr配对序列、和tracr序列的单一多核苷酸的非限制性实例如下(列出为5’到3’)，其中“N”代表指导序列的碱基，小写字体的第一区代表tracr配对序列，且小写字体的第二区代表tracr序列，并且该最后的多聚T序列代表转录终止子：(1)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataa ggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT；(2)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT；(3)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccg aaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT；(4)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaactt gaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTT；(5)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaac ttgaaaaagtgTTTTTTT；以及(6)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTTTTT。在一些实施例中，序列(1)到(3)与来自嗜热链球菌CRISPR1的Cas9结合使用。在一些实施例中，序列(4)到(6)与来自化脓链球菌的Cas9结合使用。在一些实施例中，该tracr序列是一个与包含该tracr配对序列的转录物分开的转录物。

在一些实施例中，随后可以通过满足下列标准的任一项或全部的序列来预测候选tracrRNA：1.与同向重复同源的序列(在Geneious中搜索的具有高达18-bp错配的基序)；2.在转录方向上的预测的不依赖Rho的转录终止子的存在；以及3.在tracrRNA与同向重复之间的稳定发夹二级结构。在一些实施例中，可以使用这些标准中的2条，例如1和2、2和3、或1和3。在一些实施例中，可以使用所有这3条标准。

在一些实施例中，嵌合的合成指导RNA(sgRNA)设计可以在同向重复与tracrRNA之间掺入至少12bp的双链体结构。

为了将毒性和脱靶效应降低到最低限度，重要的是控制所递送的CRISPR酶mRNA和指导RNA的浓度。CRISPR酶mRNA和指导RNA的最佳浓度可以通过在细胞或非人类真核生物动物模型中测试不同的浓度并且使用深度测序分析在潜在的脱靶基因组座位处的修饰的范围而确定。例如，对于靶向人类基因组的EMX1基因中的5’-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3’的指导序列，可以使用深度测序来评定在下列两个脱靶位点处的修饰水平，1：5’-GAGTCCTAGCAGGAGAAGAA-3’和2：5’-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAA-3’。对于体内递送，应当选择产生最高的中靶修饰水平同时将脱靶修饰水平最小化的浓度。可替代地，为了将毒性水平和脱靶效应最小化，可以用一对靶向感兴趣部位的指导RNA来递送CRISPR酶切口酶mRNA(例如，具有D10A突变的化脓链球菌Cas9)。这两个指导RNA需要如下间隔开。将毒性和脱靶效应最小化的指导序列和策略可以是如在WO2014/093622(PCT/US 2013/074667)中的。

该CRISPR系统有利地衍生自II型CRISPR系统。在一些实施例中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于包含内源CRISPR系统的特殊生物，如化脓链球菌。在本发明的优选实施例中，该CRISPR系统是一个II型CRISPR系统，并且该Cas酶是Cas9，其催化DNA切割。Cas蛋白的非限制性实例包括：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8，Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物、或其修饰形式。

在一些实施例中，未修饰的CRISPR酶如Cas9具有DNA切割活性。在一些实施例中，该CRISPR酶指导在靶序列位置处(例如在该靶序列之内和/或在该靶序列的互补物之内)的一条链或两条链的切割。在一些实施例中，该CRISPR酶指导距离靶序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个、或更多个碱基对之内的一条链或两条链的切割。在一些实施例中，一个载体编码相对于相应的野生型酶被突变的CRISPR酶，使得该突变的CRISPR酶缺乏切割含有一个靶序列的靶多核苷酸的一条链和两条链的能力。例如，在来自化脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸到丙氨酸取代(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转化成切口酶(切割单条链)。致使Cas9为切口酶的其他突变实例包括而不限于H840A、N854A、和N863A。作为一个另外的实例，Cas9的两个或更多个催化结构域(RuvC I、RuvC II、和RuvC III或该HNH结构域)可以被突变为产生实质上缺乏所有DNA切割活性的突变的Cas9。在一些实施例中，D10A突变与H840A、N854A、或N863A突变的一者或多者相组合，以便产生实质上缺乏所有DNA切割活性的Cas9酶。在一些实施例中，当该突变的CRISPR酶的DNA切割活性不多于该酶的非突变形式的DNA切割活性的约25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％、或更少时，则该酶被考虑为实质上缺乏所有DNA切割活性；一个实例可以是当突变形式的DNA切割活性与非突变形式相比是零或可忽略不计时。在该酶不是SpCas9的情况下，可以在相应于SpCas9的位置10、762、840、854、863和/或986的任何或所有残基处进行突变(其可以例如通过标准序列比较工具进行确定)。具体地说，在SpCas9中的任何或所有下列突变是优选的：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和/或D986A；并且还设想了这些置换氨基酸中的任何的保守性取代。在其他Cas9中的相应位置处的相同取代(或这些突变的保守性取代)也是优选的。特别优选的是在SpCas9中的D10和H840。然而，在其他Cas9中，相应于SpCas9D10和H840的残基也是优选的。例如在Sa Cas9中，N580处的突变(例如，N580A)是有利的。SpCas9的直向同源物可以用于本发明的实践中。一种Cas酶可以被鉴定为Cas9，因为这可以是指与来自II型CRISPR系统的具有多个核酸酶结构域的最大核酸酶共享同源性的酶的通用类别。最优选地，该Cas9酶来自或衍生自spCas9(化脓链球菌Cas9)或saCas9(金黄色葡萄球菌Cas9)。“StCas9”是指来自嗜热链球菌的野生型Cas9，其蛋白质序列在登录号G3ECR1下给出于SwissProt数据库中。类似地，化脓链球菌Cas9或spCas9在登录号Q99ZW2下被包括在SwissProt中。关于衍生，申请人意指该衍生的酶在很大程度上是基于与野生型酶具有高度序列同源性的含义，但是如本文所述它在某些方面已经被突变(修饰)。应当理解的是，术语Cas和CRISPR酶在本文中通常可互换地使用，除非另外说明。如上提及的，在本文中使用的许多残基编号是指来自化脓链球菌中的II型CRISPR座位的Cas9酶。然而，应当理解的是，本发明包括更多的来自其他微生物物种的Cas9，如SpCas9、SaCa9、St1Cas9等等。通过来源于化脓链球菌或Cas9或任何密切相关的Cas9的酶促作用，产生了在靶位点序列处的双链断裂，所述靶位点序列杂交到该指导序列的20个核苷酸上并且具有在该靶序列的20个核苷酸之后的原型间隔子相邻基序(PAM)序列(实例包括NGG/NRG或可以如本文所述进行确定的PAM)。经由Cas9的对于位点特异性DNA识别和切割的CRISPR活性是由该指导序列、部分杂交到该指导序列上的tracr序列以及该PAM序列定义的。该CRISPR系统的更多方面描述于卡吉诺夫(Karginov)和汉农(Hannon)的“CRISPR系统：在细菌和古细菌中的小RNA指导的防御”(The CRISPR system:small RNA-guided defencein bacteria and archaea)，《分子细胞学杂志》(Mole Cell)2010，1月15日；37(1):7。II型CRISPR座位来自化脓链球菌SF370，该座位含有四个基因Cas9、Cas1、Cas2和Csn1的聚簇以及两个非编码RNA元件tracrRNA和由非重复序列的短段(间隔子，每个约30bp)间隔开的重复序列(同向重复)的特征性阵列。在此系统中，以四个连续步骤产生靶向的DNA双链断裂(DSB)。第一步，从CRISPR座位转录两个非编码RNA前-crRNA阵列和tracrRNA。第二步，将tracrRNA杂交到前-crRNA的同向重复上，然后将其加工成含有单独的间隔子序列的成熟crRNA。第三步，该成熟crRNA:tracrRNA复合物经由在crRNA的间隔子区与原型间隔子DNA之间形成异源双链体而指导Cas9到由原型间隔子和对应的PAM组成的DNA靶标。最后，Cas9介导PAM上游的靶DNA的切割，以在原型间隔子内产生一个DSB。由单个间隔子组成的前-crRNA阵列，该单个间隔子侧翼为两个同向重复(DR，还被术语“tracr配对序列”所涵盖)。在某些实施例中，Cas9可以结构性地存在或诱导性地存在或有条件地存在或被给予或递送。Cas9优化可以用来增强功能或者用来开发新的功能，人们可以产生嵌合Cas9蛋白。并且Cas9可以用作通用的DNA结合蛋白。

典型地，在内源CRISPR系统的背景下，CRISPR复合物(包含杂交到靶序列上并且与一种或多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致在该靶序列中或其附近(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、或更多个碱基对之内)的一条链或两条链的切割。不希望受到理论的束缚，该tracr序列(其可以包含或其组成为野生型tracr序列的全部或部分(例如野生型tracr序列的约或多于约20、26、32、45、48、54、63、67、85个、或更多个核苷酸))也可以形成CRISPR复合物的一部分，如通过沿着该tracr序列的至少一部分杂交到与该指导序列可操作地连接的tracr配对序列的全部或部分上。

密码子优化序列的一个实例是在这种情形下针对在真核生物(例如，人类)中表达(即，针对在人类中表达进行优化)或针对如本文论述的另一种真核生物、动物或哺乳动物进行优化的序列；参见，例如，WO 2014/093622(PCT/US 2013/074667)中的SaCas9人类密码子优化序列。虽然这是优选的，但是应当理解的是，其他实例也是可能的，并且针对除人类之外的宿主物种的密码子优化或针对具体器官的密码子优化是已知的。在一些实施例中，编码CRISPR酶的酶编码序列经密码子优化，以便在特定的细胞如真核细胞中表达。这些真核细胞可以是特定生物的那些或来源于特定生物，如哺乳动物，包括但不限于人、或如本文论述的非人类真核生物或动物或哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔、狗、牲畜、或非人类哺乳动物或灵长动物。在一些实施例中，对于人类或动物而言很可能使得他们(它们)受苦而没有任何实质性医学益处的用于修饰人类的种系遗传同一性的方法和/或用于修饰动物的遗传同一性的方法、以及还有作为这样的方法的结果的动物，可以被排除在外。一般而言，密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个、或更多个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰一个核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的方法。不同的物种对于具有特定氨基酸的某些密码子展示出特定的偏好。密码子偏好性(在生物之间的密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于(除其他之外)被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此，可以将基因定制为基于密码子优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可以容易地获得，例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的密码子使用数据库(“Codon Usage Database”)中，并且这些表可以通过不同的方式调整适用。参见，中村Y.(Nakamura Y.)等人，“从国际DNA序列数据库中制表的密码子使用：2000年的状态”(“Codon usage tabulated from theinternational DNA sequence databases:status for the year 2000.”)《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)28:292(2000年)。用于密码子优化特定的序列以便在特定的宿主细胞中表达的计算机算法也是可得的，如基因制造(Gene Forge)(Aptagen公司；雅各布斯(Jacobus)，PA)，也是可得的。在一些实施例中，在编码CRISPR酶的序列中的一个或多个密码子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个、或更多个、或所有密码子)相应于对于特定氨基酸最频繁使用的密码子。

在一些实施例中，一种载体编码包含一个或多个核定位序列(NLS)如约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个NLS的CRISPR酶。在一些实施例中，该CRISPR酶包含在或接近于氨基端的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个NLS，在或接近于羧基端约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个NLS，或这些的组合(例如在氨基端的零个或至少一个或多个NLS以及在羧基端的零个或一个或多个NLS)。当存在多于一个NLS时，每一个可以被选择为不依赖于其他NLS，使得在多于一个拷贝中可以存在单个NLS和/或与在一个或多个拷贝中存在一个或多个其他NLS相组合。在本发明的一个优选实施例中，该CRISPR酶包含至多6个NLS。在一些实施例中，当NLS的最近的氨基酸是在从N端或C端沿着该多肽链的约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个、或更多个氨基酸之内时，NLS可以被视为接近该N端或C端。NLS的非限制性实例包括来源于以下项的NLS序列：SV40病毒大T抗原的NLS，其具有氨基酸序列PKKKRKV；来自核质蛋白的NLS(例如，具有序列KRPAATKKAGQAKKKK的核质蛋白二分NLS)；c-myc NLS，其具有氨基酸序列PAAKRVKLD或RQRRNELKRSP；hRNPA1M9NLS，其具有序列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY；来自输入蛋白-α的IBB结构域的序列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV；肌瘤T蛋白的序列VSRKRPRP和PPKKARED；人p53的序列POPKKKPL；小鼠c-abl IV的序列SALIKKKKKMAP；流感病毒NS1的序列DRLRR和PKQKKRK；肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL；小鼠Mx1蛋白的序列REKKKFLKRR；人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK；以及类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK。一般而言，该一个或多个NLS具有足够的强度，以便在真核细胞的核中驱动该CRISPR复合物以可检测到的量积聚。一般而言，核定位活性的强度可以驱动在该CRISPR酶中的NLS的数目、所使用的一个或多个特定的NLS、或这些因素的组合。可以通过任何适合的技术进行细胞核中积聚的检测。例如，一种检测标记可以融合到CRISPR酶上，使得细胞内的位置可以被可视化，如与检测细胞核的位置的手段(例如，对于细胞核特异的染料，如DAPI)相结合。还可以将细胞核从细胞中分离出来，然后可以通过任何适合的用于检测蛋白质的方法分析其内容物，如免疫组织化学、Western印迹或酶活性测定。如通过测定CRISPR复合物形成的作用(例如，测定在靶序列处的DNA切割或突变、或测定由于CRISPR复合物形成和/或CRISPR酶活性的影响而改变的基因表达活性)，与没有暴露于CRISPR酶或复合物、或暴露于缺乏该一个或多个NLS的CRISPR酶的对照相比较，还可以间接地确定细胞核中的积聚。

本发明的方面涉及被减少的基因产物或被进一步引入到编码基因产物的DNA分子中的模板多核苷酸或通过允许两个5’突出端重新退火并连接而被精确切断的间插序列的表达、或被改变的基因产物的活性或功能、或被增加的基因产物的表达。在本发明的一个实施例中，该基因产物是一种蛋白质。只有产生在这些指导序列(大于-8bp的偏移)之间具有小于8bp重叠的5’突出端的sgRNA对才能介导可检测的indel形成。重要的是，当与野生型Cas9配对时，在这些分析中使用的每个指导对于有效诱导indel是重要的，表明这些指导对的相对位置在预测双切割活性中是最重要的参数。由于Cas9n和Cas9H840A切割DNA的相对链，对于一个给定的sgRNA对而言，用Cas9H840A取代Cas9n应该会导致该突出端类型的倒转；但当用指示Cas9H840A是实质上缺乏所有DNA切割活性的CRISPR酶的Cas9H840A时，没有观察到indel形成(这是当该突变的CRISPR酶的DNA切割活性不多于该酶的非突变形式的DNA切割活性的约25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％、或更少时；由此一个实例可以是当突变形式的DNA切割活性与非突变形式相比是零或可忽略不计时，例如在相比于生物化学或原核系统的真核系统中，当用Cas9H840A时，没有观察到indel形成)。尽管如此，将产生具有Cas9n的5’突出端的一对sgRNA原则上会相反地产生相应的3’突出端，以及双切口。因此，导致具有Cas9n的3’突出端产生的sgRNA对可以与另一个突变的Cas9一起使用，以产生一个5’突出端，以及双切口。相应地，在一些实施例中，还提供了重组模板。重组模板可以是如本文所述的另一个载体的组分，其被包含在一个分开的载体中，或者被提供为一个分开的多核苷酸。在一些实施例中，重组模板被设计为用作在同源重组中的模板，如在被作为CRISPR复合物的一部分的CRISPR酶切开或切割的靶序列之内或在其附近。模板多核苷酸可以具有任何适合的长度，如约或多于约10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000个、或更多个核苷酸长度。在一些实施例中，该模板多核苷酸与包含该靶序列的多核苷酸的一部分互补。当进行最佳比对时，模板多核苷酸可能与靶序列的一个或多个核苷酸(例如约或多于约1、5、10、15、20个、或更多个核苷酸)重叠。在一些实施例中，当一个模板序列与包含靶序列的多核苷酸进行最佳比对时，该模板多核苷酸的最近的核苷酸在距离该靶序列的约1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000、5000、10000个、或更多个核苷酸之内。

在一些实施例中，将驱动CRISPR系统的一个或多个元件的表达的一种或多种载体引入到宿主细胞中，使得该CRISPR系统的这些元件的表达在一个或多个靶位点指导CRISPR复合物的形成。例如，Cas酶、连接到tracr配对序列上的指导序列、以及tracr序列可以各自可操作地连接到在分开的载体上的分开的调节元件上。或者，可以将CRISPR系统的RNA递送至转基因Cas9动物或哺乳动物，例如，结构性地或诱导性地或有条件性地表达Cas9的动物或哺乳动物；或以其他方式表达Cas9或具有包含Cas9的细胞的动物或哺乳动物，如通过向其先前给予用于编码以及在体内表达Cas9的一种或多种载体。可替代地，从相同或不同调节元件表达的二个或更多个元件可以结合在单个载体中，其中提供该CRISPR系统的任何组分的一种或多种另外的载体不包括在该第一载体中。结合在单个载体中的CRISPR系统元件可以按照任何适合的取向排列，如一个元件相对于第二元件位于5’(“上游”)或3’(“下游”)。一个元件的编码序列可以位于第二元件的编码序列的同一条链或相对链上，并且取向为相同或相对的方向。在一些实施例中，单个启动子驱动编码CRISPR酶的转录物以及该指导序列、tracr配对序列(任选地可操作地连接到该指导序列上)、和嵌入在一个或多个内含子序列之内(例如，各自在不同的内含子中，两个或更多个在至少一个内含子中，或者全部都在单个内含子中)的tracr序列中的一者或多者的表达。在一些实施例中，该CRISPR酶、指导序列、tracr配对序列、和tracr序列可操作地连接到相同的启动子上并且从其表达。用于表达CRISPR系统的一个或多个元件的递送运载体、载体、粒子、纳米粒子、配制品及其组分是如在前述文献(如WO 2014/093622(PCT/US 2013/074667))中所使用的。在一些实施例中，载体包含一个或多个插入位点，如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施例中，一个或多个插入位点(例如，约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个插入位点)位于一种或多种载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。在一些实施例中，载体包含在tracr配对序列的上游、并且任选地在可操作地连接到该tracr配对序列上的调节元件的下游的插入位点，使得在将指导序列插入到该插入位点中之后并且在表达时该指导序列引导CRISPR复合物与真核细胞中的靶序列的序列特异性结合。在一些实施例中，载体包含一个或多个插入位点，每个插入位点位于两个tracr配对序列之间，从而允许在每个位点插入指导序列。在这样一种安排中，两种或更多种指导序列可以包含单指导序列的两个或更多个拷贝、两种或更多种不同的指导序列、或这些的组合。当使用多个不同的指导序列时，可以使用单个表达构建体使CRISPR活性靶向到细胞内的多个不同的相应靶序列。例如，单个载体可以包含约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20种、或更多种指导序列。在一些实施例中，可以提供约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多种这样的含有靶序列的载体，并且任选地将其递送到细胞中。在一些实施例中，一个载体包含可操作地连接到编码CRISPR酶(如Cas蛋白)的酶编码序列上的调节元件。CRISPR酶或CRISPR酶mRNA或CRISPR指导RNA或一个或多个RNA可以分开递送；并且有利地这些中的至少一者经由纳米粒子复合物递送。可以在该指导RNA在给出时间以待CRISPR酶表达之前递送CRISPR酶mRNA。可以在给予指导RNA之前1-12小时(优选约2-6小时)给予CRISPR酶mRNA。可替代地，可以一起给予CRISPR酶mRNA和指导RNA。有利地，可以在初始给予CRISPR酶mRNA+指导RNA之后1-12小时(优选约2-6小时)给予指导RNA的第二加强剂量。为了实现基因组修饰的最有效水平，另外给予CRISPR酶mRNA和/或指导RNA可以是有用的。

在一个方面，本发明提供了用于使用CRISPR系统的一个或多个元件的方法。本发明的CRISPR复合物提供了用于修饰靶多核苷酸的有效手段。本发明的CRISPR复合物具有多种多样的实用性，包括修饰(例如，缺失、插入、转位、失活、激活)多种细胞类型中的靶多核苷酸。正因为如此，本发明的CRISPR复合物在例如基因疗法、药物筛选、疾病诊断以及预后中具有广阔的应用谱。示例性CRISPR复合物包括与指导序列复合的CRISPR酶，该指导序列与靶多核苷酸内的靶序列杂交。该指导序列与tracr配对序列连接，该tracr配对序列进而与tracr序列杂交。在一个实施例中，本发明提供了一种切割靶多核苷酸的方法。该方法包括使用CRISPR复合物修饰靶多核苷酸，该CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上并且实施所述靶多核苷酸的切割。典型地，当被引入进细胞中时，本发明的CRISPR复合物在基因组序列中产生一个断裂(例如，单链或双链断裂)。例如，可以使用该方法切割细胞中的疾病基因。由该CRISPR复合物产生的断裂可以通过修复过程进行修复，如易出错的非同源末端连接(NHEJ)途径或高保真同源定向修复(HDR)。在这些修复过程期间，可以将外源多核苷酸模板引入进基因组序列中。在一些方法中，该HDR过程被用于修饰基因组序列。例如，将外源多核苷酸模板引入进细胞中，该外源多核苷酸模板包括有待整合的、侧翼为上游序列和下游序列的序列。上游和下游序列与染色体中的整合位点的任一侧都具有序列相似性。在希望的情况下，供体多核苷酸可以是DNA，例如DNA质粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、病毒载体、一段线性DNA、PCR片段、裸核酸或与递送赋形剂(如脂质体或泊洛沙姆)复合的核酸。该外源多核苷酸模板包括有待整合的序列(例如，突变的基因)。供整合的序列可以是对细胞而言内源或外源的序列。有待整合的序列的实例包括编码蛋白质的多核苷酸或非编码RNA(例如，微小RNA)。因此，供整合的序列可以可操作地连接到一个或多个适当的控制序列上。可替代地，有待整合的序列可以提供一种调节功能。选择外源多核苷酸模板中的上游和下游序列，以促进感兴趣的染色体序列与供体多核苷酸之间的重组。该上游序列是一个与供整合的靶向位点的上游的基因组序列具有序列相似性的核酸序列。类似地，该下游序列是一个与供整合的靶向位点的染色体序列下游具有序列相似性的核酸序列。外源多核苷酸模板中的上游和下游序列与靶向的基因组序列可以具有75％、80％、85％、90％、95％或100％序列一致性。优选地，外源多核苷酸模板中的上游和下游序列与靶向的基因组序列具有约95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。在一些方法中，外源多核苷酸模板中的上游和下游序列与靶向的基因组序列具有约99％或100％序列一致性。上游或下游序列可以包括从约20bp至约2500bp，例如约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500bp。在一些方法中，示例性上游或下游序列具有约200bp至约2000bp、约600bp至约1000bp或更具体地约700bp至约1000bp。在一些方法中，该外源多核苷酸模板可以进一步包括一种标记。这样的一种标记使得容易地筛选靶向的整合。适合的标记的实例包括限制性位点、荧光蛋白或选择性标记。可以使用重组技术构建本发明的外源多核苷酸模板(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，2001和奥苏贝尔(Ausubel)等人，1996)。在一种用于通过整合外源多核苷酸模板而修饰靶多核苷酸的方法中，通过CRISPR复合物将双链断裂引入进基因组序列中，经由同源重组通过外源多核苷酸模板而修复该断裂，这样使得将该模板整合进基因组中。双链断裂的存在促进模板的整合。在其他实施例中，本发明提供了一种修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。该方法包括通过使用结合到多核苷酸上的CRISPR复合物增加或降低靶多核苷酸的表达。在一些方法中，可以使靶多核苷酸失活以实施细胞中的表达的修饰。例如，当CRISPR复合物结合到细胞中的靶序列上时，该靶多核苷酸失活，这样使得该序列不被转录，该编码蛋白不被产生，或者该序列不会像野生型序列一样起作用。例如，可以使蛋白质或微小RNA编码序列失活，这样使得该蛋白质或微小RNA或前-微小RNA转录物不被产生。在一些方法中，可以使控制序列失活，这样使得它不再作为控制序列起作用。如在此使用，“控制序列”是指影响核酸序列的转录、翻译或可及性的任何核酸序列。控制序列的实例包括启动子、转录终止子和增强子，它们是控制序列。CRISPR复合物的靶多核苷酸可以是对真核细胞而言内源或外源的任何多核苷酸。例如，该靶多核苷酸可以是一种驻留在真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该靶多核苷酸可以是一个编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或一个非编码序列(例如，调节多核苷酸或无用DNA)。靶多核苷酸的实例包括与信号传导生化途径相关的序列，例如信号传导生化途径相关基因或多核苷酸。靶多核苷酸的实例包括疾病相关基因或多核苷酸。“疾病相关”基因或多核苷酸是指与非疾病对照的组织或细胞相比，在来源于疾病影响的组织的细胞中以异常水平或以异常形式产生转录或翻译产物的任何基因或多核苷酸。在改变的表达与疾病的出现和/或进展相关的情况下，它可以是一个以异常高的水平被表达的基因；它可以是一个以异常低的水平被表达的基因。疾病相关基因还指具有一个或多个突变或直接负责或与一个或多个负责疾病的病因学的基因连锁不平衡的遗传变异的基因。转录的或翻译的产物可以是已知的或未知的，并且可以处于正常或异常水平。CRISPR复合物的靶多核苷酸可以是对真核细胞而言内源或外源的任何多核苷酸。例如，该靶多核苷酸可以是一种驻留在真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该靶多核苷酸可以是一个编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或一个非编码序列(例如，调节多核苷酸或无用DNA)。不希望被理论所束缚，据信该靶序列应该与PAM(原型间隔子邻近基序)相关；也就是说，与由CRISPR复合物识别的短序列相关。对PAM的精确序列和长度要求取决于使用的CRISPR酶而不同，但是PAM典型地是临近原型间隔子(也就是说，靶序列)的2-5个碱基对序列。在以下实例部分中给出PAM序列的实例，并且熟练人员将能够鉴定与给定的CRISPR酶一起使用的另外的PAM序列。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。在一个方面，本发明提供了修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该多核苷酸上，这样使得所述结合导致所述多核苷酸的表达增加或降低；其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。类似的考虑因素和条件适用如上文针对修饰靶多核苷酸的方法。事实上，这些取样、培养和重新引入选择跨本发明的多个方面而适用。在一个方面，本发明提供了修饰真核细胞中的靶多核苷酸的方法，这些方法可以在体内、离体或在体外。在一些实施例中，该方法包括对来自人或非人动物的细胞或细胞群进行取样，并且修饰该细胞或这些细胞。培养可以发生在离体的任何阶段。该细胞或这些细胞甚至可以被重新引入该非人动物或植物中。对于重新引入的细胞，特别优选的是这些细胞是干细胞。

确实，在本发明的任何方面，该CRISPR复合物可以包括与杂交到靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列可以连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而可以杂交到tracr序列上。

本发明涉及用于控制涉及序列靶向的基因表达的系统、方法、和组合物的工程化和优化，该序列靶向例如涉及CRISPR-Cas系统及其组分的基因组干扰或基因编辑。在有利的实施例中，该Cas酶是Cas9。本发明方法的一个优点在于，该CRISPR系统最小化或避免了脱靶结合及其所产生的副作用。这是通过使用被安排为具有针对靶DNA的高度序列特异性的系统而实现的。

自失活系统

一旦已经引入预期的改变，如通过在细胞基因组中编辑预期的基因拷贝，便不再需要在该细胞中继续CRISRP/Cas9表达。的确，持续表达在非预期基因组位点处存在脱靶效应的某些酪蛋白情况下等是不希望的。因此，限时表达是有用的。诱导型表达提供了一种方法，但是此外申请人已经工程化自失活CRISPR-Cas9系统，该系统依赖于在该CRISPR载体本身内使用非编码指导靶序列。因此，表达开始后，该CRISPR系统将导致其自身的破坏，但是在破坏完成之前，它将有时间编辑靶基因的基因组拷贝(在二倍体细胞中具有正常点突变的情况下，需要至多两个编辑)。简单地，自失活CRISPR-Cas系统包括另外的RNA(即，指导RNA)，其靶向CRISPR酶自身的编码序列或靶向与存在于下列一项或多项中的独特序列互补的非编码指导靶序列：(a)在驱动非编码RNA元件的表达的启动子内，(b)在驱动Cas9基因的表达的启动子内，(c)在Cas9编码序列中的100bp的ATG翻译起始密码子内，(d)在病毒递送载体的反向末端重复(iTR)内(例如，在AAV基因组中)。

HDR的效率

虽然产生治疗效果所需的靶细胞群中的基因组修饰量取决于疾病而不同，但是通过增加的编辑率改进了最具编辑性的治疗的功效。如先前所指出的，编辑率受DSB修复途径的活性和递送到感兴趣的细胞中的效率的控制。因此，这些因素中任一者的改进都可能改进编辑治疗的功效。

用于增加DSB修复途径的活性率的尝试主要聚焦于HDR，但是细胞周期调控和用核酸酶递送HDR模板的挑战使得采用此途径的策略与NHEJ相比效率较低。对于缓慢循环的细胞类型，现在已经在某种程度上通过用药理学试剂离体地刺激有丝分裂而绕过了细胞周期调控[科尔曼(Kormann)，M.S.等人《自然生物技术》(Nature biotechnology)29，154-157(2011)]。然而，实际上，有丝分裂后细胞不太可能经得起这种操纵，从而限制了本策略的适用性。已经尝试通过将含有治疗转基因的DNA模板直接连接进靶向的DSB中而完全规避对HDR的需要。已经观察到此类连接事件，但是比率太低以至于无法用于治疗[兰(Ran)，F.A.等人《细胞》(Cell)154，1380-1389(2013)；奥兰多(Orlando)，S.J.等人《核酸研究》(Nucleic acids research)38，e152(2010)]。可能的是，需要显著新的方法来改进HDR效率和提高需要精确基因组校正的策略的治疗功效。

基因组编辑为处理多种难治疾病呈现了诱人的机会。尽管如此，该技术仍处于其婴儿期并且需要许多重复来系统地优化其功效、安全性和特异性。另外，尽管人们对基因组编辑感到异常兴奋，但是需要战略规划和严格而赋能的调节过程来确保成功地开发这种类别的可能改变生活的药物。

递送，包括一般意义的递送

多种核酸或蛋白质递送方法可以用于将基因组编辑核酸酶引入离体或体内靶细胞中。取决于递送方法的选择，核酸酶可以在靶细胞中瞬时地或永久地表达。鉴于核酸酶可以展现出脱靶切割活性或触发免疫应答，应谨慎地选择递送系统。对于离体应用而言，如造血干细胞的编辑，电穿孔可以用于通过递送基于DNA的核酸酶表达载体、mRNA或蛋白质来实现瞬时核酸酶表达。整合感受态和缺陷慢病毒载体两者也都已经成功地用于驱动核酸酶表达。然而，整合慢病毒载体可能是不太令人希望的，因为它们驱动组成型表达并且可以引起更多的脱靶活性。此外，所有三个核酸酶平台也已经证实经得起修饰，这样使得可以将蛋白质通过工程化细胞穿透或化学缀合而直接递送到细胞中[桂灵尔(Guilinger)，J.P.等人《自然方法》(Nature methods)11，429-435(2014)；祖易斯(Zuris)，J.A.等人《自然生物技术》(Nature biotechnology)(2014)；盖伊(Gaj)，T.等人《自然方法》9，805-807(2012)]。

对于体内应用而言，最有前途的递送系统是病毒载体，特别是腺相关病毒(AAV)载体，它们最近已经被批准用于临床使用[沃思(Wirth)，T.等人《基因》525，162-169(2013)]。AAV以许多血清型存在并且已经显示对于多种组织类型而言具有高递送功效，包括眼、脑、肝和肌肉[萨穆尔斯基(Samulski)，R.J.&缪斯科斯卡(Muzyczka)，N.《病毒学年度综述》(Annual Review of Virology)1，427-451(2014)]。然而，AAV载体的相对较小的包装能力为核酸酶递送提出了一些挑战。ZFN相对较小并且二聚体ZFN对可以被包装到单个AAV中，二聚体TALEN对要大得多并且可能需要被包装到两个分开的AAV载体中。对于Cas9，短直向同源物可以与指导RNA一起被包装到单个AAV中。到目前为止，AAV介导的核酸酶表达已经在若干组织类型(包括肝和脑)中被证实是成功的[李(Li)，H.等人《自然》(Nature)475，217-221(2011)；斯维奇(Swiech)等人，《自然生物技术》(Nature biotechnology)(2014)]。

尽管AAV介导的体内核酸酶表达是可能的，但是存在一些需要进一步解决的挑战。首先，AAV介导的核酸酶表达通常是组成型的并且更令人希望的是在基因组编辑事件已经在靶细胞中成功地发生之后能够关闭核酸酶表达。其次，已经天然地暴露于AAV的患者可能已经产生了针对特定血清型的免疫。因此，AAV对于这些患者而言可能不是适当的递送载体。为了克服病毒载体所面对的这些挑战，基于纳米粒子和脂质的体内mRNA或蛋白质递送系统可以提供有吸引力的替代方案[祖易斯(Zuris)，J.A.等人《自然生物技术》(Naturebiotechnology)(2014)；科尔曼(Kormann)，M.S.等人《自然生物技术》29，154-157(2011)]。

根据本披露和本领域的知识，可以通过在本文一般性地和详细地描述的递送系统来递送CRISPR-Cas系统或其组分或其核酸分子(包括，例如HDR模板)或编码或提供其组分的核酸分子。

载体递送，例如质粒、病毒递送：该CRISPR酶，例如Cas9，和/或任何本发明的RNA，例如指导RNA，可以使用任何适合载体，例如，质粒或病毒载体，如腺相关病毒(AAV)、慢病毒、腺病毒或其他病毒载体类型、或其组合进行递送。Cas9以及一种或多种指导RNA可以包装到一种或多种载体，例如，质粒或病毒载体中。在一些实施例中，该载体，例如，质粒或病毒载体可以，例如，通过肌肉注射递送到感兴趣组织中，而有时经由静脉内、经皮、鼻内、经口、粘膜、或其他递送方法进行递送。这样的递送可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本文有待递送的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如载体选择、靶细胞、生物、或组织、有待治疗的受试者的一般状况、所寻求的转化/修饰的程度、给药途径、给药方式、所寻求的转化/修饰的类型，等等。

这样的剂量可以进一步含有，例如，载体(水、盐水、乙醇、甘油、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油，等等)、稀释剂、药学上可接受的载体(例如，磷酸盐缓冲盐水)、药学上可接受的赋形剂、和/或本领域已知的其他化合物。该剂型可以进一步含有一种或多种药学上可接受的盐，例如像，无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、等等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。另外，也可以存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质、凝胶或胶凝材料、调味剂、着色剂、微球体、聚合物、悬浮剂等等。另外，也可以存在一种或多种其他常规药用成分，如防腐剂、保湿剂、悬浮剂、表面活性剂、抗氧化剂、抗结剂、填充剂、螯合剂、包衣剂、化学稳定剂等等，尤其是该剂型是可复原形式时。适合的示例性成分包括微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、聚山梨酯80、苯乙醇、三氯叔丁醇、山梨酸钾、抗坏血酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚、对氯酚、明胶、白蛋白和它们的组合。药学上可接受的赋形剂的彻底论述可获自《雷明顿药物科学》(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES)(马克出版公司，纽约，1991)，通过引用将其并入本文。

在本文的一个实施例中，递送是经由腺病毒进行的，其可以是含有至少1x>5个腺病毒载体粒子(也称为粒子单位，pu)的单次加强剂量。在本文的一个实施例中，该剂量优选地是该腺病毒载体的至少约1x>6个粒子(例如，约1x>6-1x>12个粒子)，更优选至少约1x>7个粒子，更优选至少约1x>8个粒子(例如，约1x>8-1x>11个粒子或约1x>8-1x>12个粒子)，并且最优选至少约1x>0个粒子(例如，约1x>9-1x>10个粒子或约1x10⁹-1x>12个粒子)，或者甚至至少约1x>10个粒子(例如，约1x>10-1x>12个粒子)。可替代地，该剂量包含不多于约1x>14个粒子，优选不多于约1x>13个粒子，甚至更优选不多于约1x>12个粒子，甚至更优选不多于约1x>11个粒子，并且最优选不多于约1x>10个粒子(例如，不多于约1x>9个粒子)。因此，该剂量可以含有单剂量的腺病毒载体，其具有例如，约1x>6粒子单位(pu)，约2x>6pu、约4x>6pu、约1x>7pu、约2x>7pu、约4x10⁷pu、约1x10⁸pu、约2x>8pu、约4x>8pu、约1x>9pu、约2x>9pu、约4x>9pu、约1x10¹⁰pu、约2x>10pu、约4x>10pu、约1x>11pu、约2x>11pu、约4x>11pu、约1x>12pu、约2x>12pu、或约4x>12pu的腺病毒载体。参见，例如，在2013年6月4日授权的授予纳贝尔(Nabel)等人的美国专利号8,454,972B2中的腺病毒载体(通过引用并入本文)以及在其第29栏第36-58行的剂型。在本文的一个实施例中，该腺病毒是经由多剂量递送的。

在本文的一个实施例中，该递送是经由AAV进行的。用于针对人类的AAV的体内递送的治疗有效剂量被认为处于含有从约1x>10到约1x>10个功能AAV/ml溶液的从约20到约50ml的盐水溶液的范围内。该剂量可以调整以便使治疗益处相对于任何副作用的平衡。在本文的一个实施例中，AAV剂量大致处于从约1x>5到1x>50个基因组AAV、从约1x>8到1x>20个基因组AAV、从约1x>10到约1x>16个基因组、或约1x>11到约1x>16个基因组AAV的浓度范围内。人类剂量可以是约1x>13个基因组AAV。这样的浓度能以从约0.001ml到约100ml、约0.05到约50ml、或约10到约25ml的载体溶液进行递送。通过建立剂量反应曲线的常规试验，本领域普通技术人员可以容易地确立其他有效剂量。参见，例如，2013年3月26日授权的授予哈加(Hajjar)等人的美国专利号8,404,658B2，在第27栏第45-60行。

在本文的一个实施例中，该递送是经由质粒进行的。在这样的质粒组合物中，该剂量应当是足以引出反应的质粒的量。例如，在质粒组合物中的质粒DNA的适当量可以是从约0.1到约2mg，或从约1μg到约10μg/70kg个体。本发明的质粒一般将包括(i)启动子；(ii)编码CRISPR酶的序列，任选连接到所述启动子上；(iii)选择标记；(iv)复制起点；和(v)(ii)的下游的并且可操作连接到其上的转录终止子。该质粒还可以编码CRISPR复合物的RNA组分，但是这些中的一种或多种相反可以被编码到不同载体上。

本文的剂量是基于平均70kg的个体。给药频率在医学或兽医学从业者(例如医师、兽医师)或本领域熟练的科学家的范围之内。还应注意，在实验中所使用的小鼠典型地是约20g，并且从小鼠实验，一个小鼠可以扩展到70kg个体。

在一些实施例中，本发明的RNA分子在脂质体或阳离子脂质体配制品等等中进行递送并且可以通过本领域技术人员熟知的方法进行制备。这样的方法描述于，例如，美国专利号5,593,972、5,589,466、和5,580,859中，将其通过引用并入本文。已经开发了专门针对增强和改进递送siRNA到哺乳动物细胞中的递送系统，(参见，例如，沈(Shen)等人《欧洲生化学会联合会快报》(FEBS Let.)2003，539:111-114；夏(Xia)等人，《自然生物技术》(Nat.Biotech.)2002，20:1006-1010；赖希(Reich)等人，《分子视界》(Mol.Vision.)2003，9:210-216；索伦森(Sorensen)等人，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)2003，327:761-766；路易斯(Lewis)等人，《自然遗传学》(Nat.Gen.)2002，32:107-108以及西梅奥尼(Simeoni)等人，NAR 2003，31，11:2717-2724)并且可以将其应用于本发明。最近，siRNA已经成功用于抑制灵长动物中的基因表达(参见例如托伦蒂诺(Tolentino)等人，《视网膜》(Retina)24(4):660，它也可应用于本发明。

实际上，RNA递送是一种有用的体内递送方法。有可能使用脂质体或纳米粒子将Cas9和gRNA(并且，例如，HR修复模板)递送到细胞中。因此，CRISPR酶如Cas9的递送和/或本发明的RNA的递送可以处于RNA的形式并且经由微囊泡、脂质体或纳米粒子来进行。例如，Cas9mRNA和gRNA可以被包装到脂质体粒子中用于体内递送。脂质体转染试剂例如来自生命技术公司(Life Technologies)的lipofectamine以及市售的其他试剂可以有效地将RNA分子递送到肝脏中。

RNA的递送手段还优选包括经由纳米粒子的RNA递送(卓(Cho)S.、金伯格(Goldberg)M.、松(Son)S.、许(Xu)Q.、杨(Yang)F.、梅(Mei)Y.、博加特廖夫(Bogatyrev)S.、朗格(Langer)R.和安德森(Anderson)D.，“用于将小干扰RNA递送到内皮细胞的脂质样纳米粒子“(Lipid-like nanoparticles for small interfering RNA delivery toendothelial cells)，《先进功能材料》(Advanced Functional Materials)，19:3112-3118，2010)或外泌体(施罗德(Schroeder)A.、莱文斯(Levins)C.、科特斯(Cortez)C.、朗格(Langer)R.、和安德森(Anderson)D.，“用于siRNA递送的基于脂质的纳米治疗剂”(Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery)，《内科学杂志》(Journal of InternalMedicine)，267:9-21，2010，PMID:20059641)。事实上，已经表明外泌体在递送siRNA中特别有用，其为与CRISPR系统有一些相似之处的系统。例如，艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人“外泌体诱导的体外和体内siRNA递送”(“Exosome-mediated delivery of siRNA invitro and in vivo.”)《自然-实验手册》(Nat Protoc.)2012年12月；7(12):2112-26.doi:10.1038/nprot.2012.131。电子版2012年11月15日描述了外泌体对于跨不同的生物屏障的药物递送是有希望的工具并且可以用于体外和体内递送siRNA。其途径在于通过转染一种包含与肽配体融合的外泌体蛋白的表达载体产生靶向外泌体。然后将这些外泌体纯化并且从转染的细胞上清液中表征，然后将RNA加载到外泌体中。根据本发明的递送或给药可以用外泌体进行，尤其是但不限于脑。维生素E(α-生育酚)可以与CRISPR Cas结合并且连同高密度脂蛋白(HDL)一起递送到脑，例如以与乌诺(Uno)等人完成的用于将短干扰RNA(siRNA)递送到脑的类似方式《人类基因治疗》(HUMAN GENE THERAPY)22:711-719(2011年6月)。经由用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或游离TocsiBACE或Toc-siBACE/HDL充满的并且与脑灌注试剂盒3(Brain Infusion Kit 3)(Alzet公司)连接的微渗透压泵(型号1007D；Alzet公司，库比蒂诺(Cupertino)，CA)灌注小鼠。将一根脑灌注导管置于在正中线的前囱的后方约0.5mm，用于灌注到背侧第三脑室中。乌诺(Uno)等人发现，通过相同的ICV灌注方法，少至3nmol的Toc-siRNA与HDL可诱导相当程度的靶减少。可以考虑结合至α-生育酚的并且与HDL共同给予靶向脑的相似剂量的CRISPR Cas用于本发明，例如，可以考虑靶向脑的约3nmol到约3μmol的CRISPR Cas。邹(Zou)等人(《人类基因治疗》(HUMAN GENE THERAPY 22:465-475(2011年4月))描述了靶向PKCγ的短发夹RNA的慢病毒介导的递送方法，其用于在大鼠脊髓中的体内基因沉默。邹(Zou)等人通过鞘内导管给予约10μl的具有1x>9个转导单位(TU)/ml的滴度的重组慢病毒。在本发明中可以考虑相似剂量的在靶向脑的慢病毒载体中表达的CRISPR Cas用于人类，例如，可以考虑靶向脑的在具有1x>9个转导单位(TU)/ml的滴度的慢病毒中的约10-50ml的CRISPR>

就局部递送至脑部而言，这可以以各种方法实现。例如，材料可以，例如，通过注射递送到纹状体内。注射可以通过穿颅术定向性进行。

在一些方面，本发明提供了以下方法，这些方法包括向宿主细胞递送一种或多种多核苷酸，如或如在此描述的一种或多种载体、其一种或多种转录物和/或一种或多种自其转录的蛋白。在一些方面，本发明进一步提供了通过这样的方法产生的细胞以及包括这样的细胞或由这样的细胞产生的动物。在一些实施例中，将与(并且任选地与其复合)指导序列组合的CRISPR酶递送至细胞。可以使用常规的病毒和非病毒基的基因转移方法将核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。

可以使用这样的方法向培养物中或宿主生物中的细胞给予编码CRISPR系统的组分的核酸。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如在此描述的载体的转录物)、裸核酸以及与递送赋形剂(如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，在被递送至细胞后它们具有游离型或整合型基因组。关于基因疗法程序的综述，参见安德森(Anderson)，《科学》(Science)256:808-813(1992)；纳贝尔(Nabel)&费尔格纳(Felgner)，TIBTECH 11:211-217(1993)；三谷(Mitani)&卡斯基(Caskey)，TIBTECH 11:162-166(1993)；狄龙(Dillon)，TIBTECH 11:167-175(1993)；米勒(Miller)，《自然》(Nature)357:455-460(1992)；范·布朗特(Van Brunt)，《生物技术》(Biotechnology)6(10):1149-1154(1988)；维涅(Vigne)，《恢复神经学和神经科学》(Restorative Neurology andNeuroscience)8:35-36(1995)；克雷默(Kremer)&佩里科德特(Perricaudet)，《英国医学公报》(British Medical Bulletin)51(1):31-44(1995)；哈嗒嗒(Haddada)等人，在《微生物学和免疫学当前主题》(Current Topics in Microbiology and Immunology)中多尔夫勒(Doerfler)和博姆(编辑)(1995)；以及余(Yu)等人，《基因疗法》(Gene Therapy)1:13-26(1994)。核酸的非病毒递送方法包括脂转染、显微注射、基因枪、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸共轭物、裸DNA、人工病毒体以及DNA的试剂增强的摄取。脂转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355中并且脂转染试剂是市售的(例如，Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适于多核苷酸的有效的受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括Felgner(费尔格纳)，WO>

细胞系AAV-1AAV-2AAV-3AAV-4AAV-5AAV-6AAV-8AAV-9Huh-7131002.50.00.1100.70.0HEK293251002.50.10.150.70.1海拉(HeLa)31002.00.16.710.20.1HepG2310016.70.31.750.3NDHep1A201000.21.00.110.20.091117100110.20.1170.1NDCHO100100141.433350101.0COS33100333.35.0142.00.5细胞系AAV-1AAV-2AAV-3AAV-4AAV-5AAV-6AAV-8AAV-9MeWo10100200.36.7101.00.2NIH3T3101002.92.90.3100.3NDA5491410020ND0.5100.50.1HT118020100100.10.3330.50.1单核细胞1111100NDND1251429NDND未成熟DC2500100NDND2222857NDND成熟DC2222100NDND3333333NDND

本发明提供了包含或基本上由编码CRISPR(规律间隔成簇短回文重复)系统的外源核酸分子组成的rAAV，例如，多个盒，该多个盒包括第一盒或由其组成，该第一盒包括或基本上由启动子、编码CRISPR相关(Cas)蛋白(假定的核酸酶或解旋酶蛋白)(例如，Cas9)的核酸分子和终止子组成，以及两个或更多个，有利地直到载体的包装尺寸极限，例如总共(包括第一盒)五个盒，这些盒包括或基本上由启动子、编码指导RNA(gRNA)的核酸分子和终止子组成(例如，每个盒示意性地由启动子-gRNA1-终止子、启动子-gRNA2-终止子...启动子-gRNA(N)-终止子表示(其中N是可以插入的处于载体的包装尺寸极限的上限的数目))，或两个或更多个单独的rAAV，每个rAAV包含一个或多于一个CRISPR系统盒，例如，第一rAAV包含第一盒，该第一盒包括或基本上由启动子、编码Cas(例如，Cas9)的核酸分子和终止子组成，并且第二rAAV包含多个，四个，盒，这些盒包括或基本上由启动子、编码指导RNA(gRNA)的核酸分子和终止子组成(例如，每个盒示意性地由启动子-gRNA1-终止子、启动子-gRNA2-终止子...启动子-gRNA(N)-终止子表示(其中N是可以插入的处于载体的包装尺寸极限的上限的数目))。由于rAAV是一种DNA病毒，因此涉及AAV或rAAV的在此讨论中的核酸分子有利地是DNA。在一些实施例中，启动子有利地是人类突触蛋白I启动子(hSyn)。用于将核酸递送至细胞的另外的方法是本领域的技术人员已知的。参见例如通过引用结合在此的US 20030087817。在一些实施例中，用一种或多种在此描述的载体瞬时地或非瞬时地转染宿主细胞。在一些实施例中，当细胞天然地出现在受试者体内时将其转染。在一些实施例中，被转染的细胞取自受试者。在一些实施例中，该细胞来源于取自受试者的细胞，如细胞系。用于组织培养的多种多样的细胞系在本领域是已知的。细胞系的实例包括但不限于，C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、海拉-S3、Huh1、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCell、Panc1、PC-3、TF1、CTLL-2、C1R、Rat6、CV1、RPTE、A10、T24、J82、A375、ARH-77、Calu1、SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388D1、SEM-K2、WEHI-231、HB56、TIB55、Jurkat、J45.01、LRMB、Bcl-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、NRK-52E、MRC5、MEF、Hep G2、海拉B、海拉T4、COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、BS-C-1猴肾上皮细胞、BALB/3T3小鼠胚胎成纤维细胞、3T3Swiss、3T3-L1、132-d5人类胎儿成纤维细胞；10.1小鼠成纤维细胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-1细胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C3H-10T1/2、C6/36、Cal-27、CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-K1、CHO-K2、CHO-T、CHO Dhfr-/-、COR-L23、COR-L23/CPR、COR-L23/5010、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CML T1、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、海拉、Hepa1c1c7、HL-60、HMEC、HT-29、Jurkat、JY细胞、K562细胞、Ku812、KCL22、KG1、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCK II、MDCK II、MOR/0.2R、MONO-MAC 6、MTD-1A、MyEnd、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCN/OPCT细胞系、Peer、PNT-1A/PNT 2、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、Saos-2细胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THP1细胞系、U373、U87、U937、VCaP、维洛(Vero)细胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR及其转基因变种。细胞系可获得自本领域的技术人员已知的多种来源(参见例如，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(马纳萨斯(Manassus)，弗吉尼亚州))。在一些实施例中，使用用一种或多种在此描述的载体转染的细胞建立新的细胞系，该新的细胞系包括一种或多种载体来源的序列。在一些实施例中，使用用如在此描述的CRISPR系统的组分转染(如通过用一种或多种载体进行瞬时转染或用RNA进行转染)且通过CRISPR复合物的活性修饰的细胞建立新的细胞系，该新的细胞系包括以下细胞，这些细胞包含吸水但是缺少任何其他外源序列。在一些实施例中，在评估一种或多种测试化合物中使用用一种或多种在此描述的载体瞬时或非瞬时转染的细胞或来源于这样的细胞的细胞系。

提高NHEJ或HR效率也有助于递送。优选的是，NHEJ效率通过共表达末端加工酶(co-expressing end-processing enzyme)如Trex2而增强(杜米特拉切(Dumitrache)等人《遗传学》(Genetics)2011年8月；188(4):787-797)。优选的是，HR效率通过瞬时抑制NHEJ机构如Ku70和Ku86而增加。HR效率也可以通过共表达原核或真核同源重组酶如RecBCD、RecA而增加。

一般包装和启动子

介导体内基因组修饰的、将Cas9编码核酸分子(例如DNA)包装到载体(例如病毒载体)中的方式包括：

为了实现NHEJ介导的基因敲除：

单病毒载体：

含有两个或更多个表达盒的载体：

启动子-Cas9编码核酸分子-终止子

启动子-gRNA1-终止子

启动子-gRNA2-终止子

启动子-gRNA(N)-终止子(一直到载体的大小限制)

双病毒载体：

含有一个用于驱动Cas9表达的表达盒的载体1

启动子-Cas9编码核酸分子-终止子

含有一个或多个用于驱动一个或多个指导RNA表达的表达盒的载体2

启动子-gRNA1-终止子

启动子-gRNA(N)-终止子(一直到载体的大小限制)

为了介导同源定向修复。

除了上述单和双病毒载体途径之外，另外的载体可以用来递送同源定向修复模板。

用来驱动Cas9编码核酸分子表达的启动子包括：

AAV ITR可以用作一种启动子：这对于消除另外的启动子元件(可在载体中占用空间)的需要是有利的。空出来的另外的空间可以用来驱动另外的元件的表达(gRNA，等等)。同样，ITR活性是较弱的，因此可以用来降低由于Cas9的过表达所致的潜在毒性。

对于遍存表达，可以使用启动子CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、铁蛋白重链或轻链，等等。

对于脑或其他CNS表达，可以使用启动子：用于所有神经元的突触蛋白I、用于兴奋性神经元的CaMKIIα、用于GABA能神经元的GAD67或GAD65或VGAT，等等。

对于肝脏表达，可以使用白蛋白启动子。

对于肺表达，可以使用SP-B。

对于内皮细胞，可以使用ICAM。

对于造血细胞，可以使用IFNβ或CD45。

对于成骨细胞，可以使用OG-2。

用来驱动指导RNA的启动子可以包括：

Pol III启动子，如U6或H1

使用Pol II启动子和内含子盒来表达gRNA

腺相关病毒(AAV)

Cas9以及一种或多种指导RNA可以使用腺相关病毒(AAV)、慢病毒、腺病毒或其他质粒或病毒载体类型进行递送，尤其是，使用来自以下文献的配方和剂量：例如，美国专利号8,454,972(针对腺病毒的配方、剂量)、8,404,658(针对AAV的配方、剂量)和5,846,946(针对DNA质粒的配方、剂量)以及来自临床试验和关于涉及慢病毒、AAV、和腺病毒的临床试验的出版物。例如，对于AAV，给药途径、配方和剂量可以如美国专利号8,454,972并且如涉及AAV的临床试验。对于腺病毒，给药途径、配方和剂量可以如美国专利号8,404,658并且如涉及腺病毒的临床试验。对于质粒递送，给药途径、配方和剂量可以如美国专利号5,846,946并且如涉及质粒的临床试验。剂量可以基于或推断为平均70kg的个体(例如，男性成人)，并且可以针对患者、受试者、不同重量和物种的哺乳动物进行调整。给药频率在医学或兽医学从业者(例如，医师、兽医师)的范围之内，其取决于常规因素，包括患者或受试者的年龄、性别、一般健康状况、其他状况以及着手解决的特殊状况或症状。可以将病毒载体注射到感兴趣的组织中。对于细胞类型特异性基因组修饰，Cas9的表达可以由细胞类型特异性启动子驱动。例如，肝脏特异性表达可以使用白蛋白启动子，而神经元特异性表达(例如，用于靶向CNS障碍)可以使用突触蛋白I启动子。

就体内递送而言，AAV相比于其他病毒载体是有利的，这是由于几个原因：

低毒性(这可以是由于纯化方法不需要细胞粒子的超速离心所致，而超速离心可能激活免疫反应)

引起插入诱变的低概率，原因在于它未整合到宿主基因组中。

AAV具有4.5或4.75Kb的包装限制。这意味着Cas9以及启动子和转录终止子必须都配合在同一个病毒载体中。大于4.5或4.75Kb的构建体将导致病毒产生的显著降低。SpCas9是相当大的，其基因自身超过4.1Kb，使其难于包装到AAV中。因此本发明的实施例包括利用更短的Cas9同源物。例如：

因此这些物种总体上是优选的Cas9物种。

关于AAV，AAV可以是AAV1、AAV2、AAV5或任何其组合。可以选择相对于有待被靶向的细胞的AAV的AAV；例如，可以选择用于靶向脑或神经元细胞的AAV血清型1、2、5或杂合衣壳AAV1、AAV2、AAV5或其任何组合；并且可以选择用于靶向心脏组织的AAV4。AAV8可用于递送到肝脏。在此启动子和载体是单独优选的。关于这些细胞的某些AAV血清型的表格(参见格林姆(Grimm)，D.等人，《病毒学杂志》(J.Virol.)82:5887-5911(2008))如下：

慢病毒

慢病毒是复杂的反转录病毒，其具有在有丝分裂细胞和有丝分裂后细胞两者中感染并表达其基因的能力。最为人熟知的慢病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)，其利其他病毒的包膜糖蛋白来靶向广泛范围的细胞类型。

慢病毒可以制备如下。在克隆pCasES10(含有慢病毒转移质粒骨架)之后，将处于低传代数(p＝5)的HEK293FT接种在T-75烧瓶中，直到在转染之前的一天在具有10％胎牛血清而没有抗生素的DMEM中50％汇合。在20小时之后，培养基更换为OptiMEM(无血清)培养基，并且在4小时后进行转染。细胞用10μg的慢病毒转移质粒(pCasES10)和下列包装质粒转染：5μg的pMD2.G(VSV-g假型)、和7.5μg的psPAX2(gag/pol/rev/tat)。在具有阳离子脂质递送剂(50μL的Lipofectamine 2000和100μl的Plus试剂)的4mL OptiMEM中进行转染。在6小时之后，培养基更换为具有10％胎牛血清的无抗生素的DMEM。在细胞培养过程中，这些方法使用血清，但是无血清方法是优选的。

慢病毒可以如下纯化。在48小时后收获病毒上清液。首先清除上清液的碎片并通过0.45μm的低蛋白结合(PVDF)滤膜进行过滤。然后将它们在超速离心机中以24,000rpm旋转2小时。将病毒沉淀重新悬浮在50μl的DMEM中在4℃过夜。然后将它们等分，并且立即在-80℃冷冻。

在另一个实施例中，还考虑了基于马传染性贫血病毒(EIAV)的最小非灵长类慢病毒载体，尤其是对于眼基因治疗而言(参见，例如，巴鲁谷安(Balagaan)，《基因医学杂志》(JGene Med)2006；8:275(285)。在另一个实施例中，还考虑了一种经由视网膜下注射用于治疗湿型的年龄相关性黄斑变性的、表达血管生成抑制蛋白(内皮抑素和血管抑素)的基于马传染性贫血病毒的慢病毒基因治疗载体(参见，例如，宾利(Binley)等人，《人类基因治疗》(HUMAN GENE THERAPY)23:980-991(2012年9月))，并且这种载体可以经修饰用于本发明的CRISPR-Cas系统。

在另一个实施例中，自灭活慢病毒载体可以用于和/或适合于本发明的CRISPR-Cas系统，该自灭活慢病毒载体具有靶向由HIV tat/rev共享的共有外显子的siRNA、核仁定位TAR诱饵、和抗CCR5特异性锤头状核酶(参见，例如，迪吉斯托(DiGiusto)等人(2010)《科学转化医学》(Sci Transl Med)2:36ra43)。可以收集最少2.5×10⁶个CD34+细胞/每千克患者体重，并且以2×10⁶个细胞/ml的密度在X-VIVO>

慢病毒载体还披露于帕金森病的治疗中，参见，例如，美国专利公开号20120295960以及美国专利号7303910和7351585。慢病毒载体还已经披露于眼病的治疗中，参见，例如，美国专利公开号20060281180、20090007284、US 20110117189；US20090017543；US 20070054961、US 20100317109。慢病毒载体还已经披露于递送到脑中，参见，例如，美国专利公开号US 20110293571；US 20110293571、US 20040013648、US20070025970、US 20090111106和美国专利号US 7259015。

RNA递送

RNA递送：该CRISPR酶，例如Cas9，和/或任何本发明的RNA，例如指导RNA，也可以按RNA的形式递送。可以使用体外转录产生Cas9mRNA。例如，可以使用含有下列元件的PCR盒来合成Cas9mRNA：来自β珠蛋白-polyA尾(一串120个或更多的腺嘌呤)的T7_启动子-科扎克(kozak)序列(GCCACC)-Cas9-3’UTR。该盒可以用于经由T7聚合酶的转录。也可以使用体外转录从含有T7_启动子-GG-指导RNA序列的盒来转录指导RNA。

为了增强表达并且降低可能的毒性，可以，例如，使用假-U或5-甲基-C修饰该CRISPR酶-编码序列和/或指导RNA，以包括一个或多个修饰的核苷。

mRNA递送方法用于当前的肝脏递送是特别有希望的。

关于RNA递送的很多临床工作已经集中于RNAi或反义上，但是这些系统可以适配为用于递送RNA用于实现本发明。应当相应地阅读以下关于RNAi等的参考文献。

粒子递送系统和/或配制品：

已知一些类型的粒子递送系统和/或配制品在不同种类的生物医学应用中是有用的。总体上，粒子被定义为小物体，该物体在其运输和特性方面以整体单元表现。根据直径将粒子进一步分类。粗粒子涵盖在2,500与10,000纳米之间的范围。细粒子的尺寸在100与2,500纳米之间。超细粒子、或纳米粒子的大小通常是在1和100纳米之间。100-nm极限的基础是以下事实：使粒子区分于大块材料的新颖特性典型地是在100nm之下的临界长度规模下显现的。

如在此所使用的，粒子递送系统/配制品被定义为任何包括根据本发明的粒子的生物学递送系统/配制品。根据本发明的粒子是任何具有小于100微米(μm)的最大尺寸(例如直径)的实体。在一些实施例中，本发明的粒子具有小于10μm的最大尺寸。在一些实施例中，本发明的粒子具有小于2000纳米(nm)的最大尺寸。在一些实施例中，本发明的粒子具有小于1000纳米(nm)的最大尺寸。在一些实施例中，本发明的粒子具有小于900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、或100nm的最大尺寸。典型地，本发明的粒子具有500nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在一些实施例中，本发明的粒子具有250nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在一些实施例中，本发明的粒子具有200nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在一些实施例中，本发明的粒子具有150nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在一些实施例中，本发明的粒子具有100nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在本发明的一些实施例中使用更小的粒子(例如，具有50nm或更小的最大尺寸)。在一些实施例中，本发明的粒子具有范围在25nm与200nm之间的最大尺寸。

粒子表征(包括，例如表征形态、尺寸、等)是使用各种不同的技术进行的。通用技术是电子显微术(TEM、SEM)、原子力显微镜(AFM)、动态光散射(DLS)、X-射线光电子光谱法(XPS)、粉末X射线衍射(XRD)、傅里叶变换红外光谱法(FTIR)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)、紫外-可见光谱法、双偏振干涉法以及核磁共振(NMR)。表征(尺寸测量)可以针对天然粒子(即预加载)或在加载负荷物(在此负荷物指代例如CRISPR-Cas系统的一种或多种组分，例如CRISPR酶或mRNA或指导RNA、或其任何组合，并且可以包括另外的载体和/或赋形剂)后进行，以提供具有最适大小的粒子以用于任何本发明的体外、离体和/或体内施用的递送。在某些优选实施例中，粒子尺寸(例如，直径)表征是基于使用动态激光散射(DLS)的测量。可提及的是美国专利号8,709,843；美国专利号6,007,845；美国专利号5,855,913；美国专利号5,985,309；美国专利号5,543,158；以及詹姆斯(James)E.达尔曼(Dahlman)和卡门巴尔内斯(Carmen Barnes)等人在《自然纳米技术》(NatureNanotechnology)(2014)的公开物，在线公开于2014年5月11日，doi:10.1038/nnano.2014.84，以上文献涉及粒子、制造和使用它们的方法及其测量。

在本发明的范围内的粒子递送系统可以按任何形式提供，包括但不限于固体、半固体、乳液、或胶体粒子。这样可以将在此描述的任何递送系统，包括但不限于例如基于脂质的系统、脂质体、胶束、微泡、外泌体、或基因枪，提供为在本发明的范围内的粒子递送系统。

纳米粒子

可以使用纳米粒子或脂质包膜同时递送CRISPR酶mRNA和指导RNA。

例如，苏X(Su X)、弗里克J(Fricke J)、卡瓦纳DG(Kavanagh DG)、欧文DJ(IrvineDJ)(“使用脂质包封的pH响应性聚合物纳米粒子的体外和体内mRNA递送”(“In vitro andin vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH-responsive polymernanoparticles”)《分子药理学》(Mol Pharm.)2011年6月6；8(3):774-87.doi:10.1021/mp100390w。2011年4月1日电子版描述了生物可降解的核-壳结构纳米粒子，其具有由磷脂双层壳包封的聚(β-氨基酯)(PBAE)核。这些被开发为用于体内mRNA递送。该pH响应性PBAE被选择为促进内体破裂，而该脂质表面层被选择为将聚阳离子核的毒性最小化。因此，这些对于递送本发明的RNA是优选的。

在一个实施例中，考虑了基于自组装生物粘附聚合物的纳米粒子，其可应用于肽的经口递送、肽的静脉内递送以及肽的鼻递送，均递送到脑。其他实施例，还考虑了例如疏水性药物的经口吸收和眼部递送。分子包膜技术涉及被保护并递送到疾病部位的工程化聚合物包膜(参见，例如，马萨(Mazza)M.等人《ACS纳米》(ACSNano)，2013.7(2):1016-1026；秀(Siew)A.等人《分子药理学》(Mol Pharm)，2012.9(1):14-28；拉拉特萨(Lalatsa)A.等人《控释杂志》(J Contr Rel)，2012.161(2):523-36；拉拉特萨(Lalatsa)A.等人，《分子药理学》(Mol Pharm)，2012.9(6):1665-80；拉拉特萨(Lalatsa)A.等人《分子药理学》(MolPharm)，2012.9(6):1764-74；加勒特(Garrett)N.L.等人《生物光电杂志》(JBiophotonics)，2012.5(5-6):458-68；加勒特(Garrett)N.L.等人《拉曼光谱杂志》(JRaman Spect)，2012.43(5):681-688；阿哈默德(Ahmad)S.等人《皇家学会界面杂志》(JRoyal Soc Interface)2010.7:S423-33；乌切克布(Uchegbu)I.F.《药物递送专家评论》(Expert Opin Drug Deliv)，2006.3(5):629-40；曲(Qu)X.等人《生物大分子》(Biomacromolecules)，2006.7(12):3452-9和乌切克布(Uchegbu)I.F.等人《国际药学杂志》(Int J Pharm)，2001.224:185-199)。考虑了约5mg/kg的剂量，呈单剂量或多剂量形式，这取决于靶组织。

在一个实施例中，可以使用由丹·安德森实验室(Dan Anderson’s lab)在MIT开发的可将RNA递送到癌细胞以便使肿瘤生长停止的纳米粒子/并且或使其适用于本发明的CRISPR Cas系统。具体地说，安德森实验室开发了用于新生物材料和纳米制剂的合成、纯化、表征、和配制的全自动化组合系统。参见，例如，阿拉比(Alabi)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci U S A.)2013年8月6日；110(32):12881-6；张(Zhang)等人，《先进材料》(Adv Mater.)2013年9月6日；25(33):4641-5；江(Jiang)等人，《纳米通讯》(Nano Lett.)2013年3月13日；13(3):1059-64；卡拉吉安尼斯(Karagiannis)等人，《ACS纳米》(ACS Nano.)2012年10月23日；6(10):8484-7；怀特海德(Whitehead)等人，《ACS纳米》(ACS Nano.)2012年8月28日；6(8):6922-9和李(Lee)等人，《自然纳米技术》(NatNanotechnol.)2012年6月3日；7(6):389-93。

美国专利申请20110293703涉及类脂质化合物，这些化合物在多核苷酸的给药中也是特别有用的，其可适用于递送本发明的CRISPR Cas系统。在一个方面，氨基醇类脂质化合物与有待递送到细胞或受试者的药剂结合而形成微粒子、纳米粒子、脂质体、或胶束。有待通过粒子、脂质体、或胶束递送的药剂可以处于气体、液体、或固体的形式，并且该药剂可以是一种多核苷酸、蛋白质、肽、或小分子。这些氨基醇类脂质化合物可以与其他氨基醇类脂质化合物、聚合物(合成的或天然的)、表面活性剂、胆固醇、碳水化合物、蛋白质、脂质、等等形成粒子。然后这些粒子可以任选地与药用赋形剂结合而形成药物组合物。

美国专利公开号20110293703也提供了制备氨基醇类脂质化合物的方法。使胺的一种或多种等效物与环氧化物封端化合物的一种或多种等效物在适当条件下反应而形成本发明的氨基醇类脂质化合物。在某些实施例中，胺的所有氨基基团与环氧化物封端化合物充分反应而形成叔胺。在其他实施例中，胺的所有氨基基团未与环氧化物封端化合物完全反应形成叔胺，由此生成在氨基醇类脂质化合物中的伯胺或仲胺。这些伯胺或仲胺照原样留下或者可以与另一种亲电体如一种不同的环氧化物封端化合物反应。正如本领域技术人员将理解的，胺与未过量的环氧化物封端化合物反应将产生多种不同的具有不同数目的尾部的氨基醇类脂质化合物。某些胺类可以用两个环氧化物衍生的化合物尾部将其完全功能化，而其他分子用环氧化物衍生的化合物尾部将不会被完全功能化。例如，二胺或多胺可包括离开该分子的不同氨基部分的一个、二个、三个、或四个环氧化物衍生的化合物尾部，从而产生伯胺、仲胺、和叔胺。在某些实施例中，并不是所有氨基基团都被完全功能化。在某些实施例中，使用相同类型的环氧化物封端化合物中的两种。在其他实施例中，使用两种或更多种不同的环氧化物封端化合物。氨基醇类脂质化合物的合成是用或不用溶剂进行的，并且该合成可以在范围从30℃-100℃，优选在大致50℃-90℃的较高温度下进行。任选地，可以将制备的氨基醇类脂质化合物纯化。例如，可以纯化氨基醇类脂质化合物的混合物而产生具有特定数目的、环氧化物衍生的化合物尾部的氨基醇类脂质化合物。或者，该混合物可以被纯化而产生特定的立体异构体或区域异构体。也可以使用烷基卤化物(例如，碘甲烷)或其他烷化剂将这些氨基醇类脂质化合物烷化，和/或它们可以被酰化。

美国专利公开号20110293703还提供了通过发明方法制备的氨基醇类脂质化合物的文库。使用涉及液体处理器、机器人、微量滴定板、计算机、等等的高通量技术，可以制备和/或筛选这些氨基醇类脂质化合物。在某些实施例中，筛选了这些氨基醇类脂质化合物的将多核苷酸或其他药剂(例如，蛋白质、肽、小分子)转染到细胞中的能力。

美国专利公开号20130302401涉及已经使用组合聚合制备的一类聚(β-氨基醇)(PBAAs)。这些发明的PBAA可以在生物技术和生物医学应用中用作涂层(如用于医疗装置或植入物的薄膜或多层薄膜的涂层)、添加剂、材料、赋形剂、生物防污剂(non-biofoulingagent)、微图像化剂(micropatterning agent)、以及细胞封装剂(cellularencapsulation agent)。当用作表面涂层时，这些PBAA在体外和体内均引出不同水平的炎症，这取决于它们的化学结构。这类材料的巨大化学多样性允许我们鉴定出体外抑制巨噬细胞激活的聚合物涂层。此外，在羧化聚苯乙烯微粒的皮下移植之后，这些涂层减少了炎症细胞的募集，并且减轻了纤维化。这些聚合物可以用来形成用于细胞封装的聚电解质复合物胶囊。本发明还可具有许多其他的生物应用，如抗微生物涂层、DNA或siRNA递送、以及干细胞组织工程。美国专利公开号20130302401的传授内容可以适用于本发明的CRISPR Cas系统。

在另一个实施例中，考虑了脂质纳米粒子(LNP)。抗转甲状腺素蛋白小干扰RNA已经被封装在脂质纳米粒子中并且被递送到人体内(参见，例如，科尔贺(Coelho)等人，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med)2013；369:819-29)，并且这样一种系统可以适用于并且应用于本发明的CRISPR Cas系统。考虑到静脉内给予约0.01到约1mg/kg体重的剂量。考虑了降低输注相关反应的风险的用药，如考虑到地塞米松、对乙酰氨基酚(acetampinophen)、苯海拉明或西替利嗪、以及雷尼替丁。考虑了约0.3mg/千克的多剂量，每4周一次，五个剂量。

LNP已经显示在将siRNA递送到肝脏中是高度有效的(参见，例如，塔韦内罗(Tabernero)等人，《癌症发现》(Cancer Discovery)，2013年4月，第3卷，第4期，第363-470页)，并且因此被考虑用于递送编码CRISPR Cas的RNA到肝脏。考虑了6mg/kg的LNP的约四个剂量的用量，每两周一次。塔韦内罗(Tabernero)等人证明，在以0.7mg/kg给予LNP的前2个周期之后，观察到肿瘤消退，并且在6个周期结束之后，患者已经实现了部分应答，具有淋巴结转移完全消退以及肝脏肿瘤的显著萎缩。在此患者中给予40个剂量之后获得完全应答，在接受经过26个月的剂量之后其保持缓解和完全治疗。具有RCC和在用VEGF途径抑制剂进行的在先治疗之后进展的包括肾脏、肺、以及淋巴结在内的肝外部位疾病的两位患者在所有部位的疾病都保持稳定大约8到12个月，并且一位具有PNET和肝转移的患者继续在18个月(36个剂量)的延伸研究中保持疾病稳定。

然而，必须将LNP的电荷考虑在内。当阳离子脂质与带负电的脂质结合时，诱导促进细胞内递送的非双层结构。由于带电荷的LNP在静脉注射之后迅速从循环中清除，开发了具有低于7的pKa值的可电离阳离子脂质(参见，例如，罗辛(Rosin)等人，《分子治疗》(Molecular Therapy)，第19卷，第12期，第1286-2200页，2011年12月)。带负电荷的聚合物如RNA可以低pH值(例如，pH 4)加载到LNP中，在此pH时可电离脂质展示出正电荷。然而，在生理学pH值时，LNP展现出与更长的循环时间相容的低表面电荷。已经关注了四种可电离阳离子脂质，即1,2-二亚油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基氧基-3-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油基氧基-酮基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinKDMA)、以及1,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLinKC2-DMA)。已经表明，含有这些脂质的LNP siRNA系统在体内肝细胞中展现出显著不同的基因沉默特性，具有根据采用因子VII基因沉默模型的DLinKC2-DMA>DLinKDMA>DLinDMA>>DLinDAP系列而变化的潜能(参见，例如，罗辛(Rosin)等人，《分子治疗》(Molecular Therapy)，第19卷，第12期，第1286-2200页，2011年12月)。可以考虑LNP或者在LNP中的或与LNP相关的CRISPR-Cas RNA的1μg/ml的剂量，尤其是对于含有DLinKC2-DMA的配制品而言。

LNP的制备和CRISPR Cas封装可以使用/和或改编自罗辛(Rosin)等人的《分子治疗》(Molecular Therapy)，第19卷，第12期，第1286-2200页，2011年12月)。阳离子脂质1,2-二亚油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基氧基-3-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油基氧基酮基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinK-DMA)、1,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLinKC2-DMA)、(3-o-[2″-(甲氧基聚乙二醇2000)琥珀酰]-1,2-二肉豆蔻酰基-sn-二醇(PEG-S-DMG)、以及R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨甲酰]-1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-胺(PEG-C-DOMG)可以由Tekmira制药公司(Tekmira Pharmaceuticals)(温哥华，加拿大)提供或者合成。胆固醇可以购自西格玛公司(圣路易斯，密苏里州)。特异性CRISPR Cas RNA可以封装在含有DLinDAP、DLinDMA、DLinK-DMA、和DLinKC2-DMA的LNP中(阳离子脂质:DSPC:CHOL:PEGS-DMG或PEG-C-DOMG的摩尔比为40:10:40:10)。在需要时，可以结合0.2％SP-DiOC18(英杰公司，伯灵顿，加拿大)来评估细胞摄取、细胞内递送、和生物分布。通过将由阳离子脂质:DSPC:胆固醇:PEG-c-DOMG(40:10:40:10摩尔比)组成的混合物溶解在乙醇中直到最终脂质浓度为10mmol/l来进行封装。可以将脂质的这种乙醇溶液逐滴加入到pH 4.0的50mmol/l柠檬酸盐中而形成多层囊泡，从而产生30％(vol/vol)乙醇的最终浓度。在使用挤出机(北方脂质公司(Northern Lipids)，温哥华，加拿大)通过两个重叠的80nm Nuclepore聚碳酸酯滤膜挤出多层囊泡之后，可以形成大的单层囊泡。可以通过如下步骤实现封装：将溶解在含有30％乙醇(vol/vol)的pH 4.0的50mmol/l柠檬酸盐中的2mg/ml的RNA逐滴加入到挤出的形成的大单层囊泡中，并且在31℃孵育30分钟，伴随持续混合直到最终的RNA/脂质重量比为0.06/1(wt/wt)。通过使用Spectra/Por 2再生纤维素透析膜在pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中透析16小时进行乙醇的去除以及配制缓冲液的中和。使用NICOMP 370型粒径分析仪、囊泡/强度模式、以及高斯拟合，通过动态光散射，可以测定纳米粒子粒径分布(Nicomp粒径分析仪公司，圣巴巴拉市，加利福尼亚州)。对于所有三个LNP系统的粒径可以是约70nm的直径。可以通过使用VivaPureD MiniH柱(赛多利斯斯泰迪生物技术公司(Sartorius Stedim Biotech))从分析前后收集的样品中去除游离RNA来确定RNA封装效率。从洗脱的纳米粒子提取封装的RNA并且将其在260nm定量。通过使用来自美国瓦克化学公司(Wako Chemicals USA)(里士满(Richmond)，弗吉尼亚州)的胆固醇E酶法测定法测量囊泡中的胆固醇含量，确定了RNA与脂质的比率。与本文关于LNP和PEG脂质的讨论结合，聚乙二醇化的脂质体或LNP同样适于递送CRISPR-Cas系统或其组分。

大LNP的制备可以使用/和或改编自罗辛(Rosin)等人的《分子治疗》(MolecularTherapy)，第19卷，第12期，第1286-2200页，2011年12月。可以在含有50:10:38.5的摩尔比的DLinKC2-DMA、DSPC、和胆固醇的乙醇中制备脂质预混物溶液(20.4mg/ml总脂质浓度)。可以按照0.75:1的摩尔比(乙酸钠:DLinKC2-DMA)将乙酸钠添加到脂质预混物中。随后可以通过将该混合物与1.85倍体积的柠檬酸盐缓冲液(10mmol/l，pH 3.0)在剧烈搅拌下合并而使脂质水合，从而导致在含有35％的在水性缓冲液中的自发脂质体形成。可以在37℃孵育该脂质体溶液以允许粒径的时间依赖性增加。可以通过动态光散射(纳米粒径电位分析仪(Zetasizer Nano ZS)，马尔文仪器公司(Malvern Instruments)，乌斯特郡(Worcestershire)，英国)在孵育的不同时间去除等分试样以研究脂质体大小的变化。一旦实现所希望的粒径，可以将水性PEG脂质溶液(储备溶液＝在35％(vol/vol)乙醇中的10mg/ml PEG-DMG)添加到该脂质体混合物中，以便产生3.5％总脂质的最终PEG摩尔浓度。在添加PEG-脂质之后，这些脂质体应该其大小，有效抑制进一步生长。然后以大约1:10(wt:wt)的RNA与总脂质比率将RNA添加到空脂质体，然后在37℃孵育30分钟以形成加载的LNP。随后将该混合物在PBS中透析过夜，并且用0.45-μm的注射器过滤器。

球形核酸(SNA^TM)构建体和其他纳米粒子(尤其是金纳米粒子)也被考虑为将CRISPR-Cas系统递送到预期靶标的手段。重要数据表明，基于核酸功能化的金纳米粒子的AuraSense治疗性球形核酸(SNA^TM)构建体是有用的。

可以与本文的教导结合使用的文献包括：卡特勒(Cutler)人，《美国化学会志》(J.Am.Chem.Soc.)2011 133:9254-9257，郝(Hao)等人，Small.20117:3158-3162，张(Zhang)等人，《ACS纳米》(ACS Nano.)2011 5:6962-6970，卡特勒(Cutler)等人，《美国化学会志》(J.Am.Chem.Soc.)2012 134:1376-1391，杨(Young)等人，《纳米通讯》(Nano Lett.)2012 12:3867-71，郑(Zheng)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)2012 109:11975-80，米尔金(Mirkin)，《纳米医学》(Nanomedicine)2012 7:635-638张(Zhang)等人，《美国化学会志》(J.Am.Chem.Soc.)2012 134:16488-1691，因特劳布(Weintraub)，《自然》(Nature)2013 495:S14-S16，崔(Choi)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)2013 110(19):7625-7630，詹森(Jensen)等人，《科学转化医学》(Sci Transl Med)5，209ra152(2013)以及米尔金(Mirkin)等人，Small,10:186-192。

具有RNA的自组装纳米粒子可以用被聚乙二醇化的聚乙烯亚胺(PEI)进行构建，其中Arg-Gly-Asp(RGD)肽配体附接在聚乙二醇(PEG)的远端。例如，这一系统已经被用作靶向表达整合素的肿瘤新血管系统和递送抑制血管内皮生长因子受体2(VEGF R2)表达以及由此实现抑制肿瘤血管发生的siRNA的手段(参见，例如，施弗勒斯(Schiffelers)等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)，2004，第32卷，第19期)。通过将等体积的阳离子聚合物水溶液和核酸水溶液混合从而产生在2到6范围上的可电离氮(聚合物)相比磷酸盐(核酸)的净摩尔过量，从而制备纳米束。在阳离子聚合物与核酸之间的静电相互作用导致聚复合物的形成，其具有约100nm的平均粒径分布，此后称为纳米束。设想了CRISPR Cas的约100到200mg的剂量，用于施弗勒斯(Schiffelers)等人的自组装纳米粒子中的递送。

巴特利特(Bartlett)等人的纳米束(PNAS，2007年9月25日，第104卷，第39期)也可以应用于本发明。通过将等体积的阳离子聚合物水溶液和核酸水溶液混合从而产生在2到6范围上的可电离氮(聚合物)相比磷酸盐(核酸)的净摩尔过量，从而制备巴特利特(Bartlett)等人的纳米束。在阳离子聚合物与核酸之间的静电相互作用导致聚复合物的形成，其具有约100nm的平均粒径分布，此后称为纳米束。巴特利特(Bartlett)等人的DOTA-siRNA合成如下：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(DOTA-NHSester)订购自Macrocyclics公司(达拉斯(Dallas)，德克萨斯州)。将碳酸盐缓冲液(pH 9)中的具有100倍摩尔过量的DOTA-NHS-酯的胺修饰的RNA有义链加入到微量离心管中。通过在室温搅拌4小时使这些内容物反应。将该DOTA-RNA有义缀合物用乙醇沉淀，重新悬浮在水中，并且退火到未修饰的反义链上而产生DOTA-siRNA。所有液体用Chelex-100(伯乐公司，赫库斯(Hercules)，加利福尼亚州)预处理，以便去除微量金属污染物。通过使用含有环糊精的聚阳离子可以形成Tf靶向和非靶向的siRNA纳米粒子。典型地，纳米粒子以3(+/-)的进料比和0.5g/升的siRNA浓度在水中形成。用Tf(金刚烷-PEG-Tf)修饰在靶向纳米粒子表面上的百分之一的金刚烷-PEG分子。将纳米粒子悬浮在用于注射的5％(wt/vol)的葡萄糖载体溶液中。

戴维斯(Davis)等人(《自然》，第464卷，2010年4月15日)使用靶向的纳米粒子递送系统进行了RNA临床试验(临床试验登记号NCT00689065)。在21天周期的第1、3、8和10天通过30分钟的静脉输注对患有标准护理治疗难治的实体癌的患者给予靶向纳米粒子剂量。这些纳米粒子包含合成递送系统，该系统含有：(1)线性的、基于环糊精的聚合物(CDP)，(2)展示在纳米粒子的外部上的用于接合癌细胞表面上的TF受体(TFR)的人转铁蛋白蛋白(TF)靶向配体，(3)亲水聚合物(用来促进在生物流体中的纳米粒子稳定性的聚乙二醇(PEG))，以及(4)被设计为降低RRM2(在临床中使用的序列，先前表示为siR2B+5)表达的siRNA。TFR已经久为所知在恶性细胞中被下调，并且RRM2是一种确立的抗癌靶标。已经显示这些纳米粒子(临床版本表示为CALAA-01)在非人类灵长动物中的多剂量研究中良好耐受。虽然已经通过脂质体递送向患有慢性粒细胞白血病的单一患者给予了siRNA，但是戴维斯等人的临床试验是初期人类试验，该试验用一个靶向的递送系统全身性地递送siRNA并且治疗患有实体癌的患者。为了确定该靶向的递送系统是否能够将功能性siRNA有效递送到人类肿瘤，戴维斯等人研究了来自三个不同的剂量组群的三位患者的活组织检查；患者A、B和C均患有转移性黑素瘤并且分别接受了18、24和30mg m-2siRNA的CALAA-01剂量。还可以针对本发明的CRISPR Cas系统考虑相似的剂量。用含有一种线性的基于环糊精的聚合物(CDP)、一种展示在纳米粒子的外部上的用于接合癌细胞表面上的TF受体(TFR)的人转铁蛋白(TF)靶向配体和/或一种亲水聚合物(例如，用来促进在生物流体中的纳米粒子稳定性的聚乙二醇(PEG))的纳米粒子，可以实现本发明的递送。

就本发明而言，优选的是使用一种或多种粒子或纳米粒子或脂质包膜递送CRISPR复合物的一种或多种组分，例如CRISPR酶或mRNA或指导RNA或sgRNA或(如果存在的话)HDR模板。其他递送系统或载体可以结合本发明的纳米粒子方面使用。

通常，“纳米粒子”是指任何具有小于1000nm的直径的粒子。在某些优选实施例中，本发明的纳米粒子具有500nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在其他优选实施例中，本发明的纳米粒子具有范围在25nm与200nm之间的最大尺寸。在其他优选实施例中，本发明的纳米粒子具有100nm或更小的最大尺寸。在其他优选实施例中，本发明的纳米粒子具有范围在35nm与60nm之间的最大尺寸。

包含于本发明中的纳米粒子可以提供为不同形式，例如提供为固体纳米粒子(例如，金属如银、金、铁、钛，非金属，基于脂质的固体，聚合物)、纳米粒子悬浮液、或其组合。可以制备金属纳米粒子、介电纳米粒子和半导体纳米粒子连同混合结构(例如，核-壳纳米粒子)。由半导体材料制成的纳米粒子也可以经量子点标记，如果它们足够小(典型地低于10nm)使得电子能级的量子化发生的话。此类纳米级粒子作为药物载体或成像剂用于生物医学应用中，并且可以被适配为用于本发明中的相似目的。

半-固体和软纳米粒子已经制造出，并且是在本发明的范围内。具有半-固体性质的原型纳米粒子是脂质体。各种类型的脂质体纳米粒子目前在临床上用作用于抗癌药物和疫苗的递送系统。一半亲水并且另一半疏水的纳米粒子称为杰那斯(Janus)粒子，并且对于稳定乳液是特别有效的。它们可以在水/油界面处自组装，并且充当固体表面活性剂。

美国专利号8,709,843(通过引用结合在此)提供了用于将包含治疗剂的粒子靶向递送至组织、细胞和细胞内隔室的药物递送系统。本发明提供了包含聚合物的靶向粒子，该聚合物缀合至表面活性剂、亲水聚合物或脂类。通过引用结合在此的美国专利号6,007,845提供了以下粒子，这些粒子具有多嵌段共聚物的核，该多嵌段共聚物是通过将多官能化合物与一种或多种疏水聚合物和一种或多种亲水聚合物共价连接而形成的，并且这些粒子包含生物活性材料。通过引用结合在此的美国专利号5,855,913提供了一种具有空气动力学上轻的粒子的微粒组合物，这些空气动力学上轻的粒子具有小于0.4g/cm³的振实密度，其平均直径在5μm与30μm之间，将一种表面活性剂结合在其表面以用于将药物递送至肺部系统。通过引用结合在此的美国专利号5,985,309提供了以下粒子，这些粒子结合表面活性剂和/或带正电或负电的治疗剂或诊断剂和相反电荷带电分子的亲水或疏水复合物，以用于递送至肺部系统。通过引用结合在此的美国专利号5,543,158提供了生物可降解的可注射纳米粒子，这些可注射纳米粒子具有生物可降解的固体核，该固体核在表面上包含生物活性材料和聚(亚烷基二醇)部分。通过引用结合在此的WO>

在一个实施例中，该纳米粒子可以是环氧化物-修饰的脂质-聚合物，有利地为7C1(参见，例如詹姆斯(James)E.达尔曼(Dahlman)和卡门巴尔内斯(Carmen Barnes)等人在《自然纳米技术》(Nature Nanotechnology)(2014)的公开物，在线公开于2014年5月11日，doi:10.1038/nnano.2014.84)。C71是通过使C15环氧化物终止的脂质与PEI600以14:1摩尔比进行反应来合成，并且与C14PEG2000配制以产生在PBS溶液中稳定持续至少40天的纳米粒子(直径在35与60nm之间)。可以利用环氧化物-修饰的脂质-聚合物将本发明的CRISPR-Cas系统递送至肺部细胞、心血管细胞或肾细胞，然而本领域的技术人员可以调适该系统以递送到其他靶器官。设想了从约0.05至约0.6mg/kg的剂量范围。还设想了经数天或数周的剂量，其中总剂量为约2mg/kg。

外泌体

外泌体是转运RNA和蛋白质的并且可以向脑和其他靶器官中递送RNA的内源纳米囊泡。为了降低免疫原性，阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人(2011，《自然生物技术》29:341)使用了用于外泌体产生的自我衍生的树突细胞。通过将树突细胞工程化为表达Lamp2b(一种外泌体膜蛋白，融合到神经元特异性RVG肽上)而实现了靶向脑。通过电穿孔使纯化的外泌体加载外源RNA。静脉注射的RVG靶向的外泌体特异性地将GAPDH siRNA递送到脑中的神经元、小胶质细胞、少突神经胶质细胞，导致特异性的基因敲除。预暴露于RVG外泌体未减弱敲低，并且在其他组织中未观察到非特异性摄取。通过BACE1的强的mRNA(60％)和蛋白质(62％)敲低证明了外泌体介导的siRNA递送的治疗潜能，BACE1是一种阿尔茨海默病中的治疗靶标。

为了获得免疫惰性的外泌体池，阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人收获了来自具有同源主要组织相容性复合体(MHC)单体型的近交C57BL/6小鼠的骨髓。由于未成熟树突细胞产生大量的缺乏T细胞激活剂如MHC-II和CD86的外泌体，阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人选择具有粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的树突细胞持续7天。次日，使用良好建立的超速离心方案从培养上清从纯化外泌体。这些产生的外泌体在物理上是同质的，具有直径为80nm的粒径分布峰，正如通过纳米粒子跟踪分析(NTA)和电子显微镜检查所测定。阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人获得了6-12μg的外泌体(基于蛋白质浓度测量的)/每10⁶个细胞。

其次，阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人研究了使用适用于纳米级应用的穿孔方案给修饰的外泌体加载外源负荷的可能性。由于电穿孔对于纳米级的膜粒子尚未良好表征，使用非特异性Cy5标记的RNA用于电穿孔方案的经验优化。在外泌体超速离心和溶解之后测定了封装的RNA的量。在400V和125μF的电穿孔导致RNA的最好保留并且用于所有的后续实验。

阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)向正常C57BL/6小鼠给予被包封在150μg的RVG外泌体中的150μg的每种BACE1siRNA并且将敲低效率与四个对照进行比较：未处理的小鼠、仅仅用RVG外泌体注射的小鼠，用与一种体内阳离子脂质体试剂络合的BACE1siRNA注射的小鼠、以及用与RVG-9R络合的BACE1siRNA注射的小鼠，该RVG肽与静电结合到siRNA上的9个D-精氨酸缀合。在给药之后3天，分析皮层组织样品，并且在siRNA-RVG-9R处理的和siRNARVG外泌体处理的小鼠中均观察到显著的蛋白质敲低(45％，P<0.05，相对于62％，P<0.01)，这是由于显著的BACE1mRNA水平降低(分别为66％[+或-]15％，P<0.001以及61％[+或-]13％，P<0.01)。而且，申请人证明了在RVG-外泌体处理的动物中在总[β]-淀粉样蛋白1-42水平上的显著降低(55％，P<0.05)，其中β淀粉样蛋白为一种在阿尔茨海默病理学中的淀粉样斑块的主要成分。所观察到的降低大于在心室内注射BACE1抑制剂之后的正常小鼠中证明的β淀粉样蛋白1-40降低。阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)在BACE1切割产物上进行了5'-cDNA末端快速扩增(RACE)，其提供了经由siRNA的RNAi介导的敲低的证据。

最后，阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人通过评定IL-6、IP-10、TNFα和IFN-α血清浓度研究了RNA-RVG外泌体是否诱导了体内免疫反应。在外泌体处理之后，类似于与有力地刺激IL-6分泌的siRNA-RVG-9R相反的siRNA转染试剂处理，登记了在所有细胞因子上的非显著性变化，证实了该外泌体处理的免疫惰性属性。假定外泌体仅仅封装20％的siRNA，用RVG-外泌体递送比RVG-9R递送显得更有效，因为用少五倍的siRNA实现了相当的mRNA敲低和更好的蛋白质敲低，而没有相应水平的免疫刺激。这个实验证明了RVG-外泌体技术的治疗潜力，其潜在地适合于与神经退行性疾病相关的基因的长期沉默。阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人的外泌体递送系统可以用于将本发明的CRISPR-Cas系统递送至治疗靶标，尤其是神经退行性疾病。对于本发明可以考虑封装在约100到1000mg的RVG外泌体中的约100到1000mg的CRISPR Cas的剂量。

艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人(《自然－实验手册》(Nature Protocols)7,2112-2126(2012))披露了可以如何利用来源于培养的细胞的外泌体用于体外和体内递送RNA。这个方案首先描述了通过转染一种包含与肽配体融合的外泌体蛋白的表达载体的靶向外泌体的产生。其次，艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人解释了如何纯化和表征来自转染的细胞上清液的外泌体。接着，艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人详述了将RNA加载到外泌体中的关键步骤。最后，艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人概述了如何使用外泌体有效体外递送RNA以及体内递送到小鼠脑中。还提供了预期结果的实例，其中外泌体介导的RNA递送通过功能分析和成像而评估。整个方案进行约3周。根据本发明的递送或给药可以使用从自我衍生的树突细胞产生的外泌体来进行。根据本文的教导，这可以在本发明的实践中采用。

在另一个实施例中，考虑了瓦尔格伦(Wahlgren)等人的血浆外泌体(《核酸研究》(Nucleic Acids Research)，2012年，第40卷，第17期，e130)。外泌体是由包括树突细胞(DC)、B细胞、T细胞、肥大细胞、上皮细胞和肿瘤细胞在内的许多细胞类型产生的纳米囊泡(30-90nm大小)。这些囊泡通过晚期核内体的向内出芽而形成，并且然后在与质膜融合后释放到细胞外环境中。由于外泌体天然地在细胞之间运送RNA，这种特性在基因治疗中可以是有用的，并且根据本披露可以用于本发明的实践中。

来自血浆的外泌体可以通过如下制备：在900g离心血沉棕黄层持续20分钟以便分离血浆，之后收获细胞上清液，在300g离心10分钟以便去除细胞，并且在16 500g离心30分钟，之后通过0.22mm过滤器进行过滤。通过在120 000g离心70分钟使外泌体沉淀。根据在RNAi人/小鼠启动试剂盒(Quiagen，希尔顿(Hilden)，德国)中的制造商的说明进行siRNA到外泌体中的化学转染。siRNA以终浓度2mmol/ml添加到100ml PBS中。在加入HiPerFect转染试剂之后，将该混合物在室温下孵育10分钟。为了去除过量的胶束，使用醛/硫酸盐乳胶珠再分离外泌体。可以类似于siRNA进行CRISPR Cas到外泌体中的化学转染。外泌体可以与从健康供体的外周血中分离的单核细胞和淋巴细胞共培养。因此，可以考虑的是，可以将含有CRISPR Cas的外泌体引入人单核细胞和淋巴细胞中并且以自体方式再引入。因此，可以使用血浆外泌体进行根据本发明的递送或给药。

脂质体

可以用脂质体进行根据本发明的递送或给药。脂质体是球形囊泡结构，其组成为围绕内部水性区室的单层或多层脂质双层以及相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层。脂质体作为药物递送载体受到了相当的重视，因为它们是生物相容、无毒的，可以递送亲水和亲脂性药物分子，包护它们的负荷物免于被血浆酶降解，并且运送它们的负荷跨过生物膜和血脑屏障(BBB)(对于评述，参见，例如，斯普奇(Spuch)和纳瓦罗(Navarro)《药物递送杂志》(Journal of Drug Delivery)，2011卷，文献标识码469679，第12页，2011.doi:10.1155/2011/469679)。可以从几种不同类型的脂质制造脂质体；然而，磷脂最常用来产生作为药物载体的脂质体。虽然当脂质膜与一种水性溶液混合时脂质体形成是自发的，但也可通过使用一个均质机、超声发生器、或挤出设备以振摇的形式施加力使其加速(对于评述，参见，例如，斯普奇(Spuch)和纳瓦罗(Navarro)《药物递送杂志》(Journal of Drug Delivery)，2011卷，文献标识码469679，第12页，2011.doi:10.1155/2011/469679)。

可以将几种其他的添加剂添加到脂质体，以便修饰其结构和特性。例如，可以将胆固醇或鞘磷脂添加到脂质体混合物中，以便帮助稳定脂质体结构并且防止脂质体内部负荷物的泄漏。此外，从氢化卵磷脂酰胆碱或卵磷脂酰胆碱、胆固醇、和磷酸二鲸蜡脂制备脂质体，并且脂质体的平均囊泡大小被调整到约50至100nm。(对于评述，参见，例如，斯普奇(Spuch)和纳瓦罗(Navarro)《药物递送杂志》(Journal of Drug Delivery)，2011卷，文献标识码469679，第12页，2011.doi:10.1155/2011/469679)。脂质体配制品主要可以由天然磷脂和脂质如1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱和单唾液酸神经节苷酯构成。由于这种配制品仅仅由磷脂组成，脂质体配制品已经遇到了许多挑战，其中之一是在血浆中的不稳定性。已经作出战胜这些挑战的若干尝试，特别是在脂质膜的处理方面。这些尝试之一集中于胆固醇的处理。将胆固醇添加到常规配制品中减缓了封装的生物活性化合物到血浆中的迅速释放，或者添加1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)增加稳定性(对于评述，参见，例如，斯普奇(Spuch)和纳瓦罗(Navarro)《药物递送杂志》(Journal of Drug Delivery)，2011卷，文献标识码469679，第12页，2011.doi:10.1155/2011/469679)。

在一个特别有利的实施例中，特洛伊木马(Trojan Horse)脂质体(也称为分子木马)是令人希望的并且方案可见于http://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5407.long。这些粒子允许转基因在血管内注射之后递送到整个脑。不受到限制，表面结合有特异性抗体的中性脂质粒子允许经由胞吞作用跨过血脑屏障。申请人假定利用特洛伊木马脂质体将核酸酶的CRISPR家族经由血管内注射递送到脑，这将允许全脑转基因动物，而不需要胚胎操作。对于在脂质体中的体内给药，可以考虑约1-5g的DNA或RNA。

在另一个实施例中，该CRISPR Cas系统或其组分可以在脂质体中给药，如稳定的核酸-脂质粒子(SNALP)(参见，例如，莫里西(Morrissey)等人，《自然生物技术》(NatureBiotechnology)，第23卷，第8期，2005年8月)。考虑了约1、3或5mg/kg/天的靶向SNALP中的特异性CRISPR Cas的每日静脉注射。日治疗可以经过约三天，然后每周治疗持续约五周。在另一个实施例中，还考虑了通过以约1或2.5mg/kg的剂量静脉注射给药的封装有特异性CRISPR Cas的SNALP(参见，例如，齐默尔曼(Zimmerman)等人，《自然通讯》(NatureLetters)，第441卷，2006年5月4日)。该SNALP配制品可含有以2:40:10:48的摩尔百分比的脂质3-N-[(w甲氧基聚(乙二醇)2000)氨甲酰]-1,2-二肉豆蔻氧基-丙胺(PEG-C-DMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇，(参见，例如，齐默尔曼(Zimmerman)等人，《自然通讯》(Nature Letters)，第441卷，2006年5月4日)。

在另一个实施例中，已经证明稳定的核酸-脂质粒子(SNALP)将分子有效递送到高度血管化的HepG2-衍生的肝脏肿瘤，但是不递送到血管化不良的HCT-116衍生的肝脏肿瘤(参见，例如，李(Li)，《基因治疗》(Gene Therapy)(2012)19，775-780)。可以通过如下制备这些SNALP脂质体：使用25:1的脂质/siRNA比率和48/40/10/2的胆固醇/D-Lin-DMA/DSPC/PEG-C-DMA的摩尔比，用二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇和siRNA配制D-Lin-DMA和PEG-C-DMA。生成的SNALP脂质体在大小上为约80-100nm。在又另一个实施例中，SNALP可以包含合成胆固醇(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州，美国)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(Avanti Polar Lipids公司，阿拉巴斯特(Alabaster)，阿拉巴马州，美国)、3-N-[(w-甲氧基聚(乙二醇)2000)氨甲酰]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基胺、和阳离子的1,2-二亚油基氧基-3-N,N二甲基氨基丙烷(参见，例如，盖斯伯特(Geisbert)等人，《柳叶刀》(Lancet)2010；375:1896-905)。例如可以考虑静脉推注给予约2mg/kg总CRISPR Cas/剂的剂量。在又另一个实施例中，SNALP可以包含合成胆固醇(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC；Avanti Polar Lipids公司)、PEG-cDMA、和1,2-二亚油基氧基-3-(N；N-二甲基)氨基丙烷(DLinDMA)(参见，例如，贾奇(Judge)，《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)119:661-673(2009))。用于体内研究的配制品可包含约9:1的最终脂质/RNA质量比。

已经由阿尔尼拉姆制药公司(Alnylam Pharmaceuticals)的巴洛斯(Barros)和格罗布(Gollob)评论了RNAi纳米药物的安全性(参见，例如，《先进药物递送评论》(AdvancedDrug Delivery Reviews)64(2012)1730-1737)。稳定的核酸脂质粒子(SNALP)由四种不同的脂质构成-一种在低pH时为阳离子的可电离脂质(DLinDMA)、一种中性辅助脂质、胆固醇、和一种可扩散的聚乙二醇(PEG)-脂质。该粒子直径大约为80nm并且在生理pH时是电中性的。在配制过程中，该可电离脂质用于在粒子形成过程中使脂质与阴离子RNA缩合。当在渐增的酸性内体条件下带正电荷时，该可电离的脂质还介导了SNALP与内体膜的融合，从而使得能够将RNA释放到细胞质中。该PEG-脂质在配制过程中使该粒子稳定并且减少聚集，随后提供中性的亲水性外部，以改进药代动力学特性。

到目前为止，已经使用具有RNA的SNALP配制品开始两个临床项目。Tekmira制药公司最近完成了SNALP-ApoB在具有增高的LDL胆固醇的成年志愿者中的I期单剂量研究。ApoB主要在肝脏和空肠中表达，并且对于VLDL和LDL的组装和分泌是必需的。十七位受试者接受了SNALP-ApoB的单剂量(跨7个剂量水平的剂量递增)。没有肝脏毒性(预期为基于临床前研究的潜在剂量限制性毒性)的证据。处于最高剂量的(两位中的)一位受试者经历了与免疫系统刺激一致的流感样症状，于是做出结束该试验的决定。

阿尔尼拉姆制药公司(Alnylam Pharmaceuticals)已经类似地推出了ALN-TTR01，其采用上述SNALP技术并且靶向突变体和野生型TTR的肝细胞产生，从而治疗TTR淀粉样变性(ATTR)。已经描述了三个ATTR综合征：家族性淀粉样多发性神经病变(FAP)和家族性淀粉样心肌病(FAC)-两者均由TTR中的常染色体显性突变引起；以及由野生型TTR引起的老年全身性淀粉样变性(SSA)。最近在具有ATTR的患者中完成了ALN-TTR01的安慰剂对照单剂量递增I期试验。向31位患者(23位用研究药物，8位用安慰剂)在0.01到1.0mg/kg(基于siRNA)的剂量范围内以15分钟静脉内输注给予ALN-TTR01。治疗耐受良好，其中在肝功能试验中没有显著增加。在≥0.4mg/kg时在23位患者的3位中注意到输注相关反应；对所有患者均做出减慢输注速率的反应并且所有患者继续参与研究。在处于1mg/kg的最高剂量(如根据临床前和NHP研究预期的)的两位患者中注意到血清细胞因子IL-6、IP-10和IL-1ra的最小与瞬时升高。在1mg/kg时观察到ALN-TTR01的预期药理效应，即，血清TTR的降低。

在又另一个实施例中，可以通过将阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质以40:10:40:10的摩尔比分别溶解在例如乙醇中来制作SNALP(参见，森普尔(Semple)等人，《自然生物技术》(Nature Niotechnology)，第28卷，第2期，2010年2月，第172-177页)。将该脂质混合物添加到水性缓冲液中(50mM柠檬酸盐，pH 4)，混合至最终的乙醇和脂质浓度分别为30％(vol/vol)和6.1mg/ml，允许在22℃平衡2分钟，然后挤出。使用Lipex挤出仪(北方脂质公司(Northern Lipids))，在22℃将水合脂质通过两层80nm孔径大小的过滤器(Nuclepore)直到获得70-90nm直径的囊泡时为止，正如通过动态光散射分析测定的。这大致需要1-3次通过。将该siRNA(溶解在50mM柠檬酸盐中，pH为4的含有30％乙醇的水溶液)以约5ml/min的速率在混合下添加到预平衡的(35℃)囊泡中。在达到0.06(wt/wt)的最终靶siRNA/脂质比率之后，将该混合物在35℃另外孵育30分钟，以允许囊泡重组和该siRNA的封装。然后去除乙醇并且通过透析或切向流渗滤用PBS(155mM NaCl、3mM Na2HPO4、1mMKH2PO4，pH 7.5)替换外部缓冲液。使用控制的逐步稀释法工艺将siRNA封装在SNALP中。KC2-SNALP的脂质组分为以57.1:7.1:34.3:1.4的摩尔比使用的DLin-KC2-DMA(阳离子脂质)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC；Avanti Polar Lipids公司)、合成胆固醇(西格玛公司)和PEG-C-DMA。在形成加载的粒子后，将SNALP在PBS中透析并且在使用之前通过0.2μm的滤膜消毒过滤。平均粒径为75-85nm，并且将90％-95％的siRNA封装在脂质粒子内。用于体内测试的在配制品中的最终siRNA/脂质比率是大约0.15(wt/wt)。在使用之前即刻将含有因子VII siRNA的LNP-siRNA系统在无菌PBS中稀释到适当浓度，并且通过侧尾静脉以10ml/kg的总体积静脉内给药。这种方法和这些递送系统可以类推到本发明的CRISPR Cas系统。

其他脂质

其他阳离子脂质，如氨基脂质2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)可以例如类似于SiRNA地用来封装CRISPR Cas系统或其组分或对其进行编码的一个或多个核酸分子(参见，例如，加雅拉曼(Jayaraman)，《德国应用化学》(Angew.Chem.Int.Ed.)2012，51，8529-8533)，并且因此可以在本发明的实践中采用。可以考虑具有下列脂质组成的预成型囊泡：分别处于摩尔比40/10/40/10的氨基脂质、二硬脂酰卵磷脂(DSPC)、胆固醇和(R)-2,3-双(十八烷氧基)丙基-1-(甲氧基聚(乙二醇)2000)丙基碳酸酯(PEG-脂质)，以及大约0.05(w/w)的FVII siRNA/总脂质比率。为了确保在70-90nm范围内的窄粒径分布以及0.11+0.04(n＝56)的低多分散性指数，可以在添加CRISPR Cas RNA之前将粒子通过80nm的膜挤出达三次。可以使用含有高度有效的氨基脂质16的粒子，其中四种脂质组分16、DSPC、胆固醇和PEG-脂质的摩尔比(50/10/38.5/1.5)可以被进一步优化，以增强体内活性。

迈克尔S D科尔曼(Michael S D Kormann)等人(“在小鼠中递送化学修饰的mRNA之后治疗蛋白的表达”(“Expression of therapeutic proteins after delivery ofchemically modified mRNA in mice”):《自然生物技术》(Nature Biotechnology)，第29卷，第154-157页，(2011))描述了脂质包膜用于递送RNA的用途。脂质包膜的用途在本发明中也是优选的。

在另一个实施例中，脂质可以与本发明的CRISPR Cas系统配制在一起而形成脂质纳米粒子(LNP)。脂质包括但不限于，DLin-KC2-DMA4、C12-200和辅助脂质二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-DMG，可以使用自发囊泡形成程序将其与CRISPR Cas而不是siRNA一起配制(参见，例如，Novobrantseva，《分子治疗-核酸》(Molecular Therapy-Nucleic Acids)(2012)1，e4；doi:10.1038/mtna.2011.3)。组分摩尔比可以是约50/10/38.5/1.5(DLin-KC2-DMA或C12-200/二硬脂酰磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-DMG)。在DLin-KC2-DMA和C12-200脂质纳米粒子(LNP)的情况下，最终脂质:siRNA重量比可以分别是约12:1和9:1。配制品可以具有约80nm的平均粒径，具有>90％的包覆效率。可以考虑3mg/kg的剂量。

Tekmira公司在美国和国外具有一组针对LNP和LNP配制品的不同方面的大约95个同族专利(参见，例如，美国专利号7,982,027；7,799,565；8,058,069；8,283,333；7,901,708；7,745,651；7,803,397；8,101,741；8,188,263；7,915,399；8,236,943和7,838,658以及欧洲专利号1766035；1519714；1781593和1664316)，所有这些专利均可用于和/或适用于本发明。

该CRISPR Cas系统或其组分或对其进行编码一个或多个核酸分子可以封装在PLGA微球中进行递送，例如进一步描述于美国公开申请20130252281和20130245107以及20130244279(转让给Moderna Therapeutics公司)中，其涉及包含修饰的核酸分子的组合物的配制品方面，所述核酸分子可以编码蛋白质、蛋白质前体、或该蛋白质或蛋白质前体的部分或完全加工形式。该配制品具有50:10:38.5:1.5-3.0(阳离子脂质:融合脂质:胆固醇:PEG脂质)的摩尔比。该PEG脂质可以选自，但不限于PEG-c-DOMG、PEG-DMG。该融合脂质可以是DSPC。还参见，施鲁姆(Schrum)等人，“工程化核酸的递送和配制”(Delivery andFormulation of Engineered Nucleic Acids)，美国公开申请20120251618。

Nanomerics公司的技术着手解决针对广泛治疗学的生物利用度挑战，包括基于低分子量疏水药物、肽以及核酸(质粒、siRNA、miRNA)的治疗学。该技术已经证明了明显优势的特异性的给药途径包括口服途径、跨血脑屏障的运送、向实体瘤以及眼部的递送。参见，例如，马萨(Mazza)等人，2013，《ACS纳米》(ACS Nano.)2013年2月26日；7(2):1016-26；乌切克布(Uchegbu)和秀(Siew)，2013，《制药科学杂志》(J Pharm Sci.)102(2):305-10和拉拉特萨(Lalatsa)等人，2012，《控释杂志》(J Control Release)，2012年7月20日；161(2):523-36。

美国专利公开号20050019923描述了用于向哺乳动物身体递送生物活性分子例如多核苷酸分子、肽和多肽和/或药剂的阳离子树状聚合物。这些树状聚合物适合于将生物活性分子的递送靶向到例如肝、脾、肺、肾或心脏(或甚至脑)。树状聚合物是从简单的支化单体单元以逐步方式制备的3维大分子，其性质和功能性可以容易地进行控制和改变。经由向多功能核(发散式合成法)或朝向多功能核(收敛式合成法)重复加成结构单元(buildingblocks)而合成树状聚合物，并且结构单元的3维壳的各次加成导致更高级别的树状聚合物的形成。聚丙烯亚胺树状聚合物从二氨基丁烷核开始，通过对伯胺的丙烯腈的双迈克尔加成反应向其上添加两倍数目的氨基基团，继之为腈的氢化。这导致氨基基团的加倍。聚丙烯亚胺树状聚合物含有100％的可质子化氮以及高达64个末端氨基基团(5级，DAB 64)。可质子化基团常常为能够在中性pH时接受质子的胺基。树状聚合物作为基因递送剂的用途在很大程度上集中于聚酰胺-胺和含磷化合物的用途，其中胺/酰胺的混合物或N--P(O2)S分别作为缀合单元，没有报道关于更低级别的聚丙烯亚胺树状聚合物用于基因递送的用途的工作。还研究了作为pH敏感的控制释放系统的聚丙烯亚胺树状聚合物，其用于药物递送以及当被外周氨基酸基团化学修饰时用于它们的客体分子的封装。还研究了聚丙烯亚胺树状聚合物的细胞毒性和与DNA的相互作用以及DAB 64的转染效力。

美国专利公开号20050019923是基于与早期报道相反的观察：阳离子树状聚合物例如聚丙烯亚胺树状聚合物展示出适当的特性，如，特异性靶向和低毒性，其用于在生物活性分子如基因材料的靶向递送中使用。另外，阳离子树状聚合物的衍生物也展示出适当的用于生物活性分子的靶向递送的特性。还参见，《生物活性聚合物》(Bioactive Polymers)、美国公开申请20080267903，其披露了不同的聚合物，包括阳离子聚胺聚合物和树枝状聚合物，其显示具有抗增殖活性，并且因此可用于治疗其特征为不希望的细胞增殖的失调，如新生物和肿瘤、炎性失调(包括自身免疫性失调)、银屑病和动脉粥样硬化。这些聚合物可以作为活性剂单独使用、或者作为其他治疗剂(如药物分子或用于基因治疗的核酸)的递送载体。在这样的情况下，这些聚合物自身固有的抗肿瘤活性可以补足有待递送的药剂的活性。这些专利公开的披露可以与本文针对递送一种或多种CRISPR Cas系统或其一种或多种组分或对其进行编码的一个或多个核酸分子的教导结合使用。

超电荷蛋白

超电荷蛋白是一类具有非常高的正或负理论净电荷的工程化的或天然存在的蛋白质并且可以用于递送一种或多种CRISPR Cas系统或其一种或多种组分或对其进行编码的一个或多个核酸分子。超负电荷蛋白和超正电荷蛋白两者都展示出显著的抵抗热诱导或化学诱导的聚集的能力。超正电荷蛋白还能够渗透哺乳动物细胞。使负荷物与这些蛋白质结合，如质粒DNA、RNA、或其他蛋白质，可使得这些大分子到体外和体内的哺乳动物细胞中的功能递送成为可能。刘大卫实验室(David Liu’s lab)在2007年报道了超电荷蛋白的建立和表征(劳伦斯(Lawrence)等人，2007，《美国化学会志》(Journal of the AmericanChemical Society)129，10110-10112)。

RNA和质粒DNA到哺乳动物细胞中的非病毒递送对于研究和治疗应用都是有价值的(阿肯克(Akinc)等人，2010，《自然生物技术》(Nat.Biotech.)26，561-569)。纯化的+36GFP蛋白(或其他超正电荷蛋白)与RNA在适当的无血清培养基中混合并且允许在添加到细胞中之前复合。在这个阶段的血清的包含将会抑制超电荷蛋白-RNA复合物的形成和降低治疗效果。已经发现以下方案对于多种细胞系是有效的(麦克诺顿(McNaughton)等人，2009，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)106，6111-6116)。然而，应当进行改变蛋白质和RNA剂量的先导实验来优化用于特异性细胞系的程序。

(1)在治疗前一天，以1x>5个细胞/孔铺板于48孔板中。

(2)在治疗当天，在无血清的培养基中稀释纯化的+36GFP蛋白直到终浓度200nM。添加RNA到50nM的终浓度。涡旋混合并且在室温孵育10分钟。

(3)在孵育过程中，抽吸培养基离开细胞并且再次用PBS洗涤。

(4)在孵育+36GFP和RNA之后，向细胞加入蛋白质-RNA复合物。

(5)将细胞与复合物在37℃孵育4小时。

(6)在孵育之后，抽出培养基并且用20U/mL的肝素PBS洗涤三次。用含血清培养基另外孵育细胞48小时或更长，这取决于用于活性的试验。

(7)通过免疫印迹、qPCR、表型分析、或其他适当的方法分析细胞。

刘大卫实验室(David Liu’s lab)已经进一步发现+36GFP在一些列细胞中是一种有效的质粒递送试剂。由于质粒DNA是一种比siRNA大的负荷物，有效复合质粒需要成比例地更大的+36GFP蛋白。为了有效质粒递送，申请人已经开发了一种带有C末端HA2肽标签的+36GFP变体，这种肽是一种已知的从流感病毒血凝素蛋白衍生的内体破坏肽。下列方案在多种细胞中是有效的，但是如上所述，建议针对特异性细胞系和递送应用优化质粒DNA的超电荷蛋白的剂量。

(1)在治疗前一天，以1x>5/孔铺板于48孔板中。

(2)在治疗当天，在无血清的培养基中稀释纯化的GFP蛋白直到终浓度2mM。加入1mg的质粒DNA。涡旋混合并且在室温孵育10分钟。

(3)在孵育过程中，抽吸培养基离开细胞并且再次用PBS洗涤。

(4)在孵育GFP和质粒DNA之后，向细胞轻轻加入蛋白质-DNA复合物。(5)将细胞与复合物在37℃孵育4小时。

(6)在孵育之后，抽出培养基并且用PBS洗涤。在含血清培养基中孵育细胞，并且另外孵育24-48小时。

(7)在适当时分析质粒递送(例如，通过质粒驱动的基因表达)。

还参见，例如，麦克诺顿(McNaughton)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)106，6111-6116(2009)；克罗尼肯(Cronican)等人，《ACS化学生物学》(ACS Chemical Biology)5，747-752(2010)；克罗尼肯(Cronican)等人，《化学与生物学》(Chemistry&Biology)18，833-838(2011)；汤普森(Thompson)等人，《酶学方法》(Methods in Enzymology)503，293-319(2012)；汤普森(Thompson)D.B.，等人，《化学与生物学》(Chemistry&Biology)19(7)，831-843(2012)。超电荷蛋白的这些方法可以使用和/或适用于本发明的CRISPR Cas系统的递送。吕博士(Dr.Lui)以及与本文的教导结合的本文的文献的这些系统可以用于递送一种或多种CRISPR Cas系统或其一种或多种组分或对其进行编码的一个或多个核酸分子。

细胞穿透肽(CPP)

在又另一个实施例中，考虑了细胞穿透肽(CPP)用于递送CRISPR Cas系统。CPP是短肽，其促进细胞吸收不同分子负荷物(从纳米级粒子到小化学分子和DNA的大片段)。如在此使用的术语“负荷物”包括但不限于下组，该组由以下各项组成：治疗剂、诊断探针、肽、核酸、反义寡核苷酸、质粒、蛋白质、纳米粒子、脂质体、发色团、小分子和放射性物质。在本发明的多个方面，该负荷物还可包括CRISPR Cas系统的任何组分或整个功能性CRISPR Cas系统。本发明的多个方面进一步提供了用于将希望的负荷物递送到受试者体内的方法，这些方法包括：(a)制备一种复合物，其包含本发明的细胞穿透肽以及希望的负荷物，并且(b)经口服、关节内、腹膜内、鞘内、动脉内(intrarterially)、鼻内、实质内、皮下、肌内、静脉内、真皮、直肠内地、或局部给予该复合物至一位受试者。负荷物是通过化学键经由共价键或通过非共价相互作用与这些肽相关联。

CPP的功能是将该负荷物递送进入细胞，这是一种通常通过内吞作用发生的过程，其中该负荷物被递送到活体哺乳动物细胞的内体。细胞穿透肽具有不同的大小、氨基酸序列、和电荷，但所有CPP具有一种不同的特征，该特征是转位质膜并协助将各种分子量的负荷物递送到细胞质或细胞器的能力。CPP转位可以分为三个主要的进入机制：直接渗透于膜中、内吞作用-介导的进入、和通过形成暂时性结构转位。CPP已经发现在治疗不同疾病中在药物(包括癌症和病毒抑制剂)中作为药物递送剂的许多应用、连同在用于细胞标记的造影剂中的许多应用。后者的实例包括充当用于GFP、MRI造影剂、或量子点的载体。CPP具有很大的作为用于研究和医学的体外和体内递送载体的潜力。CPP典型地具有一种氨基酸组合物，该氨基酸组合物包含高相对丰度的带负电荷的氨基酸，例如赖氨酸或精氨酸，或具有包含交替模式的极性/带电荷的氨基酸和非极性疏水性氨基酸的序列。这两种类型的结构分别称为聚阳离子或两亲性的。第三类CPP是仅含有非极性残基的疏水性肽，具有低净电荷或具有对于细胞摄入关键的疏水氨基酸基团。发现的初始CPP之一是来自人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)的反式-激活转录激活因子(Tat)，发现其高效地从周围介质被许多培养中的细胞类型摄取。从此以后，已知CPP的数目已经显著扩大，并且已经产生具有更有效蛋白转导特性的小分子合成类似物。CPP包括但不限于穿透素、Tat(48-60)、转运素(Transportan)、以及(R-AhX-R4)(Ahx＝氨基己酰基)。

美国专利8,372,951提供了来源于嗜酸性粒细胞阳离子蛋白质(ECP)的CPP，它展示出高度细胞穿透效率和低毒性。还提供了将CPP与其内负荷物递送进脊椎动物受试者中的多个方面。CPP的其他方面及其递送描述于美国专利8,575,305；8,614,194和8,044,019中。CPP可以用来递送CRISPR-Cas系统或其组分。可以采用CPP递送CRISPR-Cas系统或其组分，也被提供于原稿“通过细胞穿透肽介导的对Cas9蛋白和指导RNA的递送进行的基因破坏(Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9proteinand guide RNA)”，苏雷什罗摩克里希纳(Suresh Ramakrishna)，阿布-博恩塞拉夸库达迪(Abu-Bonsrah Kwaku Dad)，贾格迪什博卢尔(Jagadish Beloor)等人，《基因组研究》(Genome Res.)2014年4月2日[电子出版先于印刷]，通过引用以其全文结合，其中证实了用CPP-缀合的重组Cas9蛋白和CPP-复合的指导RNA进行治疗导致在人类细胞系中的内源基因破坏。在该论文中，Cas9蛋白经由硫醚键缀合至CPP，而指导RNA与CPP复合，形成形成缩合的、带负电荷的纳米粒子。已经显示，用修饰的Cas9和指导RNA同时和顺序地治疗人类细胞，包括胚胎干细胞、真皮成纤维细胞、HEK293T细胞、海拉(HeLa)细胞、和胚胎癌细胞，导致有效的基因破坏，伴随相对于质粒转染而言降低的脱靶突变。

可植入装置

在另一个实施例中，还考虑可植入装置用于递送该CRISPRCas系统或其一种或多种组分或对其进行编码的一个或多个核酸分子。例如，美国专利公开20110195123披露了一种可植入医用装置，其局部地并且在延长的时期内洗脱药物，包括几种类型的这种装置、实施的治疗方式和植入方法。该装置包含聚合物基材，例如，用作装置主体的基质、以及药物，并且在一些情况下包含另外的支架材料，如金属或另外的聚合物，以及增强可见度和成像的材料。可植入递送装置在提供局部的并且在延长的时期内的释放方面可以是有利的，其中药物直接释放到患病区域的细胞外基质(ECM)，所述患病区域如肿瘤、炎症、退化，或用于针对症状的目的，或者释放到受损的平滑肌细胞，或者用于预防。如上文披露的，一类药物是RNA，并且这个系统可以用于和/或适用于本发明的CRISPR Cas系统。在一些实施例中，植入方式为用于包括近距离放射疗法和针吸活组织检查在内的其他治疗的、当今开发和使用的现有植入程序。在这样的情况下，在本发明中描述的新植入物的尺寸类似于初始植入物。典型地在相同的治疗程序中植物很少的装置。

美国专利公开20110195123提供了药物递送可植入或可插入系统，包括适用于空腔例如腹腔和/或其中药物递送系统未被锚定或附接的任何其他类型的给药，其包含生物稳定的和/或可降解的和/或生物可吸收的聚合物基材，其可以例如任选地是基质。应当指出的是术语“插入”也包括植入。该药物递送系统优选地被实施为如美国专利公开20110195123中描述的“装填器(Loder)”。

聚合物或多种聚合物是生物相容的，其结合一种药剂和/或多种药剂，使得药剂以控制的速率释放，其中该聚合物基材如基质的总体积，例如在一些实施例中是任选地并且优选地不大于容许达到该药剂的治疗水平的最大体积。作为非限制性实例，这样的体积优选在0.1m³至1000mm³的范围内，正如该药剂负荷的体积所要求的。该装填器任选地是更大的，例如当结合有一个其大小由功能性决定的装置时，例如而不限于，膝关节、宫内节育环或子宫颈环等等。

在一些实施例中，该药物递送系统(用于递送该组合物)被设计为优选地采用可降解聚合物，其中主要释放机制是本体溶蚀(Bulk erosion)；或者在一些实施例中，使用了不可降解的、或缓慢降解的聚合物，其中主要释放机制是扩散而不是本体溶蚀，使得外部部分用作一种膜，而其内部部分用作一种储药池，该储药池在一个延长的时期内(例如从约一周到约几个月)实际上不受环境的影响。还可以任选地使用具有不同释放机制的不同聚合物的组合。在总药物释放期的重要时段期间，在表面处的浓度梯度优选地被维持有效地恒定，并且因此扩散速率是有效地恒定的(称为“零模式”扩散)。关于术语“恒定”，它意指优选地维持在治疗效果的低阈值以上的扩散速率，但是可以仍然任选地具有初期突释的特征和/或可以波动，例如增加和降低到一定程度。该扩散速率优选地被如此维持一个延长的时期，并且它被考虑为相对于一定的水平是恒定的，以便优化治疗有效期，例如该有效沉默期。

该药物递送系统任选地并且优选地被设计为保护基于核苷酸的治疗剂免于降解，而不论化学性质或由于受试者体内的酶和其他因素的攻击。

美国专利公开20110195123的药物递送系统任选地与传感和/或激活器具相关联，这些器具通过激活和/或加速/减速的无创和/或微创方法在该装置的植入之时和/或之后被操作，例如任选地包括但不限于热力加热和冷却、激光束和超声波，包括聚焦超声和/或RF(射频)方法或装置。

根据美国专利公开20110195123的以下实施例，用于局部递送的部位可以任选地包括其特征为高度异常的细胞增殖、受到抑制的细胞凋亡的靶部位，包括肿瘤、活动性和/或慢性炎症和感染，包括自身免疫性疾病状态、退化组织(包括肌肉和神经组织)、慢性疼痛、退行性部位，以及用于增强组织再生的骨折位置以及其他伤口位置，以及损伤的心肌、平滑肌和横纹肌。

用于植入该组合物的部位、或靶部位，优选地其特征为用于靶向局部递送的足够小的半径、面积和/或体积。例如，该靶部位任选地具有在从约0.1mm到约5cm范围内的直径。

该靶部位的位置优选地针对最大治疗效力而选择。例如，该药物递送系统的组合物(任选地与如上所述的用于植入的装置一起)任选地并且优选地被植入在肿瘤环境或与之相关的血供之内或者附近。

例如该组合物(任选地与该装置一起)任选地植入在胰脏、前列腺、乳房、肝脏之内或附近，通过乳头，在血管系统之内，等等。

靶位置任选地选自下组，该组由以下各项组成(仅仅作为非限制性实例，因为任选地在身体内的任何部位可以适合于植入一个装填器)：1.在退行性部位的脑，像在帕金森病或阿尔茨海默病中的基底神经节、白质和灰质；2.如在肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的情况下的脊柱；3.预防HPV感染的子宫颈；4.活动性或慢性炎性关节；5.在银屑病情况下的真皮；6.用于止痛作用的交感神经部位和感觉神经部位；7.骨内植入；8.急性和慢性感染部位；9.阴道内；10.耳内--听觉系统、内耳的迷路、前庭系统；11.气管内；12.心内；冠状动脉、心外膜；13.膀胱；14.胆道系统；15.实质组织，包括且不限于肾脏、肝脏、脾脏；16.淋巴结；17.唾液腺；18.牙龈；19.关节内(进入关节)；20.眼内；21.脑组织；22.脑室；23.空腔，包括腹腔(例如但不限于，卵巢癌)；24.食管内以及25.直肠内。

任选地，该系统(例如含有该组合物的装置)的插入与向在该靶部位和该部位附近的ECM注射材料有关，从而影响该靶部位和这个部位附近的ECM中的局部pH和/或温度和/或影响该药物的扩散和/或药物动力学的其他生物因素。

任选地，根据一些实施例，所述药剂的释放可以与传感和/或激活器具相关联，这些器具通过激活和/或加速/减速的无创和/或微创方法和/或别的方法在插入之前和/或之时和/或之后被操作，所述方法包括激光束、放射、热力加热和冷却、和超声波，包括聚焦超声和/或RF(射频)方法或装置、以及化学激活剂。

根据美国专利公开20110195123的其他实施例，该药物优选地包括RNA，例如，对于局限性癌症情况，在乳房、胰脏、脑、肾脏、膀胱、肺、以及前列腺中，如下文所述。尽管用RNAi进行示例，但是许多药物可适用于封装在装填器中，并且可以与本发明相关联，只要这样的药物可以被封装在装填器基材(例如像一种基质)中即可，并且这种系统可以使用和/或适配来递送本发明的CRISPR Cas系统。

作为特殊应用的另一个实例，神经肌肉退行性疾病由于异常基因表达而发生。RNA的局部递送可以具有干扰这样的异常基因表达的治疗特性。包括小分子药物和大分子在内的抗凋亡、抗炎和抗退行性药物的局部递送也可以任选地是治疗性的。在这样的情况下，该装填器用于以恒定速率和/或通过单独植入的专用装置延长释放。这都可以用于和/或适用于本发明的CRISPR Cas系统。

作为特殊应用的又另一个实例，用基因修饰剂治疗精神和认知障碍。基因敲低是治疗选项。向中枢神经系统部位局部递送药剂的装填器是对于精神和认知障碍的治疗选项，这些精神和认知障碍包括但不限于，精神病、双极性疾病、神经性障碍和行为疾病(behavioral maladies)。这些装填器也可以在特定脑部位进行植入时局部递送包括小分子药物和大分子的药物。这都可以用于和/或适用于本发明的CRISPR Cas系统。

作为特殊应用的另一个实例，在局部部位的先天性和/或适应性免疫介质的沉默使得能够预防器官移植排斥。用植入到移植器官和/或植入部位的装填器局部递送RNA和免疫调节试剂致使经由排斥性免疫细胞(如针对移植器官而被激活的CD8)的局部免疫抑制。这都可以用于和/或适用于本发明的CRISPR Cas系统。

作为特殊应用的另一个实例，包括VEGF和血管生成素及其他在内的血管生长因子对于新血管形成是必需的。这些因子、肽、肽模拟物的局部递送或抑制它们的抑制物是一种重要的治疗模式；使阻遏物沉默以及用装填器局部递送刺激血管发生的这些因子、肽、大分子和小分子药物对于周围血管疾病、全身性血管疾病和心血管疾病是治疗性的。

插入的方法，如植入，可以任选地已用于其他类型的组织植入和/或用于组织取样，任选地在这样的方法中没有修改，或者可替代地任选地仅仅具有非重点修改。这样的方法任选地包括但不限于，近距离放射治疗方法、活组织检查、用和/或不用超声的内窥镜检查如ERCP、进入脑组织的立体定向法、腹腔镜检查，包括用腹腔镜进入关节、腹腔器官、膀胱壁和体腔的植入。

在本文讨论的可植入装置技术可以与本文的教导一起使用并且因此根据本披露和本领域的知识，可以经由可植入装置递送CRISPR-Cas系统或其组分或其核酸分子或编码或提供组分的核酸分子。

流体递送装置方法

在另一个实施例中，可以考虑用具有针阵列的流体递送装置(参见例如，转让给弗雷德·哈钦森癌症研究中心的美国专利公开号20110230839)将CRISPR Cas递送至实体组织。用于将流体递送至实体组织的美国专利公开号20110230839的装置可以包括多个排列为阵列的针；多个储库，每个储库都与该多个针中的对应的针处于流体联通；以及多个致动器，这些致动器可操作地耦合至该多个储库中的对应的储库并被配置为控制该储库内的流体压力。在某些实施例中，该多个致动器中的每个都可以包括多个柱塞中的一个，该多个柱塞中的每个的第一端都被接收进该多个储库中的对应的储库中，并且在某些另外的实施例中，该多个柱塞中的柱塞在其对应的第二端被可操作地耦合在一起，以便可以同时被按下。某些仍另外的实施例可以包括一个柱塞驱动器，该柱塞驱动器被配置为以选择性地可变速率按下所有该多个柱塞。在其他实施例中，该多个致动器中的每个都可以包括多个流体传输线中的一个，这些流体传输线具有第一和第二端，该多个流体传输线中的每个的第一端被耦合至该多个储库中的对应的储库。在其他实施例中，该装置可以包括一个流体压力源，并且该多个致动器中的每个在该流体压力源与该多个储库中的对应的储库之间都包括一个液压耦合器。在另外的实施例中，该流体压力源可以包括压缩机、真空蓄能器、蠕动泵、主缸、微流体泵以及阀中的至少一个。在另一个实施例中，该多个针中的每个都可以包括多个沿其长度分布的端口。

患者特异性筛选方法

靶向核苷酸(例如三核苷酸重复)的CRISPR-Cas系统可以用于针对此类重复的存在对患者或患者样品进行筛选。这些重复可以是该CRISPR-Cas系统的RNA的靶标，并且如果被该CRISPR-Cas系统结合至其上，则可以检测到该结合，以由此指示存在这样一个重复。因此，CRISPR-Cas系统可以用于针对该重复的存在对患者或患者样品进行筛选。然后可以向该患者给予一种或多种适合的化合物以解决该病症；或者，可以向该患者给予CRISPR-Cas系统，该系统结合到并且引起插入、缺失或突变并且减轻该病症。

骨

奥克斯(Oakes)和利伯曼(Lieberman)《临床矫形学及相关学科研究》(ClinOrthop Relat Res.)2000年10月；(379增刊):S101-12)论述了向骨的基因递送。通过将基因转移到在特定解剖部位的细胞中，可以使用持续一段时间的生理学剂量的生长因子的骨诱导特性来促进更显著的愈合反应。该特定的解剖部位、骨的质量、以及软组织包膜，影响区域性基因治疗的靶细胞的选择。在骨诱导载体中递送到治疗部位的基因治疗载体产生了有希望的结果。若干研究者在动物模型中使用离体和体内区域性基因治疗显示出令人兴奋的结果。这样的系统可以用于和/或适用于递送到骨的本发明的CRISPR Cas系统。

靶向缺失、治疗应用

基因的靶向缺失是优选的。因此优选的是涉及胆固醇生物合成、脂肪酸生物合成、以及其他代谢障碍的基因，编码涉及淀粉样蛋白以及其他疾病的错误折叠蛋白的基因，导致细胞转化的癌基因，潜伏病毒基因，以及导致负显性疾病(dominant-negativedisorder)、其他失调的基因。在这里作为示例，申请人提出使用病毒或纳米粒子递送系统向对其有需要的受试者或患者的眼(眼睛的)、耳(耳朵的)、上皮、造血、或另一种组织进行CRISPR-Cas系统的基因递送，该受试者或患者具有代谢障碍、淀粉样变性、蛋白聚积相关疾病、由于基因突变和基因异位所致的细胞转化、基因突变的负显性作用、潜伏病毒感染、以及其他相关症状。该CRISPR-Cas系统的治疗应用包括遗传性眼病，包括但不限于色素性视网膜炎、全色盲、黄斑变性、青光眼等。在本文提供了眼病的列表(参见标题为眼基因治疗的部分)。

作为一个实例，可以治疗或预防由HIV-1引起的慢性感染。为了实现这个目标，可以产生靶向绝大多数HIV-1基因组的CRISPR-Cas指导RNA，同时考虑HIV-1株变体，以使覆盖面和效力最大。通过宿主免疫系统的常规腺病毒或慢病毒介导的感染，可以实现CRISPR-Cas系统的递送。取决于途径，宿主免疫细胞可以是a)分离的、用CRISPR-Cas转导的、选择的、并且重新引入该宿主中的或b)通过全身递送CRISPR-Cas系统体内转导的。第一种途径允许产生抗性免疫群体，而第二种更可能靶向宿主体内的潜伏病毒储库。这在实例部分中更详细地论述。

在另一个实例中，转让给桑加莫生物科学公司(Sangamo BioSciences，Inc.)的美国专利公开号20130171732涉及抗HIV转基因到该基因组中的插入，其方法可应用于本发明的CRISPR Cas系统。在另一个实施例中，该CXCR4基因可以被靶向并且转让给桑加莫生物科学公司(Sangamo BioSciences，Inc.)的美国专利公开号20100291048的TALE系统可以被修饰为本发明的CRISPR Cas系统。转让给桑加莫生物科学公司(Sangamo BioSciences，Inc.)美国专利公开号20130137104和20130122591以转让给Cellectis公司的美国专利公开号20100146651的方法通常可应用于转基因表达，因为它涉及修饰用于增加基因修饰的频率的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)座位。

还可以设想的是，本发明产生一个基因敲除细胞文库。每个细胞可以有单基因被敲除。

人们可以制作ES细胞的文库，其中每个细胞有单基因被敲除，并且ES细胞的整个文库将有每个单基因被敲除。此文库对于筛选细胞过程以及疾病的基因功能是有用的。为了制作这个细胞文库，人们可以将由诱导型启动子(例如，多西环素诱导型启动子)驱动的Cas9整合到ES细胞中。另外，人们可以将靶向特异性基因的单个指导RNA整合到ES细胞中。为了制作ES细胞文库，人们可以简单地将ES细胞与编码靶向人类基因组中的每个基因的指导RNA的基因的文库混合。人们可以首先将单个BxB1attB位点引入到人ES细胞的AAVS1座位中。然后可以使用BxB1整合酶来促进单独的指导RNA基因整合到AAVS1座位中的BxB1attB位点中。为了促进整合，每个指导RNA基因可以被包含在携带单个attP位点的质粒上。这样，BxB1将使基因组中的attB位点与含有指导RNA的质粒上的attP位点重组。为了生成该细胞文库，人们可以采用具有整合的单个指导RNA的细胞的文库，并且诱导Cas9表达。在诱导之后，Cas9介导由该指导RNA指定的位点处的双链断裂。

蛋白质治疗剂的长期给药可以引出针对该特殊蛋白质的不可接受的免疫反应。蛋白质药物的免疫原性可以归因于少数免疫显性辅助性T淋巴细胞(HTL)表位。降低包含在这些蛋白质内的这些HTL表位的MHC结合亲和力可以产生具有更低免疫原性的药物(腾格里S(Tangri S)等人“具有降低免疫原性的合理工程化的治疗蛋白”(“Rationally engineeredtherapeutic proteins with reduced immunogenicity”《免疫学杂志》(J Immunol.)2005年3月15日；174(6):3187-96。)在本发明中，可以具体地遵循首先由腾格里(Tangri)等人针对促红细胞生成素提出并且随后开发的方法来降低该CRISPR酶的免疫原性。因此，定向演化或合理设计可以用来降低在宿主物种(人类或其他物种)中的CRISPR酶(例如Cas9)的免疫原性。

在一个示例性实施例中，申请人已经显示了使用3种感兴趣的指导RNA的靶向的体内切割并且这些指导RNA能够将仅仅发生在一个小的细胞亚群中的有效体内DNA切割可视化。(参见例如，实例1)具体地说，这说明了也可以在高级生物(如哺乳动物)体内实现特异性靶向。还强调的多元方面在于，可以同时使用多重指导序列(即，分开的靶标)(从共同递送的意义上说)。换言之，申请人使用了多重途径，其中几种不同的序列被同时而独立地靶向。

血液

本发明还考虑了向血液递送该CRISPR-Cas系统。

瓦尔格伦(Wahlgren)等人的血浆外泌体(《核酸研究》(Nucleic AcidsResearch)，2012年，第40卷，第17期，e130)可以被利用为向血液递送该CRISPR Cas系统。其他递送手段或RNA也是优选的，如经由纳米粒子(卓(Cho)，S.、金伯格(Goldberg)，M.、松(Son)，S.、许(Xu)，Q.、杨(Yang)，F.、梅(Mei)，Y.、博加特廖夫(Bogatyrev)，S.、朗格(Langer)，R.和安德森(Anderson)，D.，用于小干扰RNA的脂质样纳米粒子(Lipid-likenanoparticles for small interfering RNA)

还考虑本发明的CRISPR Cas系统用来治疗血红蛋白病，如地中海贫血和镰状细胞病。参见，例如，可以被本发明的CRISPR Cas系统靶向的潜在靶标的国际专利公开号WO2013/126794。德拉科波罗(Drakopoulou)，“综述文章，用于β-地中海贫血的基于造血干细胞的基因疗法的持续挑战(Review Article,The Ongoing Challenge of HematopoieticStem Cell-Based Gene Therapy forβ-Thalassemia)”，《国际干细胞》(Stem CellsInternational)，第2011卷，文章ID 987980，10页，doi:10.4061/2011/987980，通过引用并入本文连同它引用的文献，如同完整地陈述一样，讨论了使用递送β-球蛋白或γ-球蛋白的基因的慢病毒修饰HSC。与使用慢病毒相对照，根据本领域的知识和本披露的教导，就β-地中海贫血而言，本领域技术人员可以使用靶向并校正突变的CRISPR-Cas9系统来校正HSC(例如，用递送β-球蛋白或γ-球蛋白(有利地是非镰状化β-球蛋白或γ-球蛋白)的编码序列的适合的HDR模板)；确切地说，sgRNA可以靶向引起β-地中海贫血的突变，并且HDR可以为β-球蛋白或γ-球蛋白的正确表达提供编码。在此方面提及的是：卡瓦扎娜(Cavazzana)，“经由离体地用慢病毒β^A-T87Q-球蛋白载体转导的自体造血干细胞移植的用于重型β-地中海贫血的基因治疗的成果(Outcomes>A-T87Q-Globin>

转让给Cellectis公司的美国专利公开号20110225664、20110091441、20100229252、20090271881和20090222937，涉及CREI变体，其中两个I-CreI单体的至少一个具有至少两个取代，一个在分别位于从I-CreI的位置26到40以及44到77的LAGLIDADG核心域的两个功能性亚结构域的每一个中，能够从人白细胞介素2受体γ链(IL2RG)基因切割DNA靶序列的所述变体也称为普通细胞因子受体γ链基因或γC基因。在美国专利公开号20110225664、20110091441、20100229252、20090271881和20090222937中鉴定的靶序列可以用于本发明的CRISPR Cas系统。

由于在淋巴细胞T成熟方面的缺陷所致的严重联合免疫缺陷(SCID)总是与淋巴细胞B的功能缺陷相关联(卡瓦扎纳-卡尔沃(Cavazzana-Calvo)等人，《医学年鉴》(Annu.Rev.Med.)，2005，56，585-602；费舍尔(Fischer)等人，《免疫学评论》(Immunol.Rev.)，2005，203，98-109)。总发病率估计为每75 000个出生人数有1个。患有未经治疗的SCID的患者遭受多重机会性微生物感染，并且通常不能活过一年。SCID可以通过同种异体造血干细胞(来自家族供体)转移进行治疗。对于供体而言的组织相容性可在很大程度上变化。在腺苷脱氨酶(ADA)缺陷的情况下，SCID之一形成，患者可以通过注射酶重组腺苷脱氨酶进行治疗。

由于已经显示ADA基因在SCID患者中突变(吉布勒特(Giblett)等人，《柳叶刀》(Lancet)，1972，2，1067-1069)，已经鉴定了几种其他的涉及SCID的基因(卡瓦扎纳-卡尔沃(Cavazzana-Calvo)等人，《医学年鉴》(Annu.Rev.Med.)，2005，56，585-602；费舍尔(Fischer)等人，《免疫学评论》(Immunol.Rev.)，2005，203，98-109)。对于SCID有四种主要原因：(i)最常见的SCID形式，SCID-X1(X连锁的SCID或X-SCID)，是由IL2RG基因的突变引起的，导致成熟T淋巴细胞和NK细胞的缺乏。IL2RG编码γC蛋白(野口(Noguchi)等人，《细胞》(Cell)，1993，73，147-157)，其为至少五种白细胞介素受体复合物的一种共有组分。这些受体通过JAK3激酶激活几种靶标(马基(Macchi)等人，《自然》(Nature)，1995，377，65-68)，其失活导致与γC失活相同的综合征；(ii)ADA基因的突变导致嘌呤代谢缺陷，这对于淋巴细胞前体是致命的，进而导致B、T和NK细胞的准缺乏；(iii)V(D)J重组在免疫球蛋白和T淋巴细胞受体(TCR)的成熟中是一个重要步骤。在涉及这个过程的三种基因重组活化基因1和2(RAG1和RAG2)以及阿蒂米斯(Artemis)中的突变导致成熟T和B淋巴细胞的缺乏；以及(iv)还报道了在涉及T细胞特异性信号传导的其他基因如CD45中的突变，虽然它们代表少数情形(卡瓦扎纳-卡尔沃(Cavazzana-Calvo)等人，《医学年鉴》(Annu.Rev.Med.)，2005，56，585-602；费舍尔(Fischer)等人，《免疫学评论》(Immunol.Rev.)，2005，203，98-109)。

出于两个主要原因，自从它们的遗传基础已经鉴定以来，不同的SCID形式已经成为基因治疗方法的范例(费舍尔(Fischer)等人，《免疫学评论》(Immunol.Rev.)，2005，203，98-109)。设想了离体治疗。造血干细胞(HSC)可以从骨髓恢复，并且在较少的细胞分裂中保持了它们的多能性。因此，可以将它们进行体外处理，然后重新注射到患者中，它们入驻骨髓中。由于淋巴细胞的成熟在SCID患者中受损，经校正的细胞具有选择性优势。因此，少量的校正细胞可恢复功能性免疫系统。这种假设已经借助于下列各项在其他系统中得到确认：(i)与SCID患者中的突变的逆转相关联的免疫功能的部分恢复(赫希霍恩(Hirschhorn)等人，《自然-遗传学》(Nat.Genet.)，1996，13，290-295；斯蒂芬(Stephan)等人，《新英格兰医学杂志》(N.Engl.J.Med.)，1996，335，1563-1567；布索(Bousso)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.，Acad.Sci.USA)，2000，97，274-278；和田(Wada)等人，《美国国家科学院院刊》，2001，98，8697-8702；西小森(Nishikomori)等人，《血液》(Blood)，2004，103，4565-4572)，(ii)在造血细胞中的体外SCID-X1缺陷的校正(坎多蒂(Candotti)等人，《血液》，1996，87，3097-3102；卡瓦扎纳-卡尔沃(Cavazzana-Calvo)等人，《血液》，1996，《血液》，88，3901-3909；泰勒(Taylor)等人，《血液》，1996，87，3103-3107；哈辛-贝(Hacein-Bey)等人，《血液》，1998，92，4090-4097)，(iii)SCID-X1的校正(苏戴斯(Soudais)等人，《血液》，2000，95，3071-3077；蔡(Tsai)等人，《血液》，2002，100，72-79)，JAK-3(邦廷(Bunting)等人，《自然医学》(Nat.Med.)，1998，4，58-64；邦廷等人，《人类基因治疗》(Hum.Gene Ther.)，2000，11，2353-2364)和RAG2(耶茨(Yates)等人，《血液》，2002，100，3942-3949)在动物模型中的体内缺陷以及(iv)基因治疗临床试验的结果(卡瓦扎纳-卡尔沃等人，《科学》，2000，288，669-672；艾尔迪(Aiuti)等人，《自然医学》(Nat.Med.)，2002；8，423-425；加斯帕(Gaspar)等人，《柳叶刀》(Lancet)，2004，364，2181-2187)。根据本披露，人们可以使用靶向与SCID相关的突变中的一个或多个的CRISPR-Cas9系统，例如具有一种或多种sgRNA和一种或多种HDR模板的CRISPR-Cas9系统，这一种或多种sgRNA和这一种或多种HDR模板对应地靶向引起SCID的突变IL2RG并且提供γC蛋白的校正表达。

转让给儿童医疗中心有限公司(Children’s Medical Center Corporation)和哈弗大学(President and Fellows of Harvard College)的美国专利公开号20110182867涉及经由BCL11A表达或活性抑制剂(如RNAi和抗体)在造血祖细胞中调节胎儿血红蛋白(HbF)表达的方法和用途。在美国专利公开号20110182867中披露的靶标，如BCL11A，可以被本发明的CRISPR Cas系统靶向，以便调节胎儿血红蛋白表达。对于另外的BCL11A靶标，还参见鲍尔(Bauer)等人(《科学》(Science)2013年10月11日：第342卷，第6155期，第253-257页)和许(Xu)等人(《科学》2011年11月18日：第334卷，第6058期，第993-996页)。

耳

本发明还考虑了向一只或两只耳递送该CRISPR-Cas系统。

研究者正在调查基因治疗是否可以用来辅助当前的耳聋治疗—即，耳蜗植入物。耳聋常常由毛细胞的缺失或损害引起，其不能将信号传递到听觉神经元。在这样的情况下，可以使用耳蜗植入物对声音做出响应并且将电信号传输到神经细胞。但是，由于受损的毛细胞释放释放更少的生长因子，这些神经元常常退化并从耳蜗缩回。

美国专利申请20120328580描述了例如使用一个注射器(例如单剂量注射器)将一种药物组合物注射到耳中(例如，耳部施用)，如注射到耳蜗的腔(luminae)中(例如，中阶、前庭阶、和鼓阶)。例如，可以通过鼓室内注射(例如，进入中耳)、和/或注射到外耳、中耳、和/或内耳给予本文描述的一种或多种化合物。这样的方法在本领域中常规使用，例如，用于将甾体和抗生素给予到人耳中。例如，可以通过耳的圆窗或通过耳蜗囊进行注射。其他内耳施用方法是本领域已知的(参见，例如，索尔特(Salt)和普兰特克(Plontke)，《今日药物发现》(Drug Discovery Today)，10:1299-1306，2005)。

在另一种给药方式中，可以经由一根导管或泵原位施用该药物组合物。导管或泵可以，例如，将药物组合物导向到耳蜗腔或耳的圆窗和/或结肠腔中。适合于将本文所述的一种或多种化合物施用到耳(例如，人耳)中的示例性药物递送设备和方法由麦肯纳(McKenna)等人，(美国公开号2006/0030837)和雅各布森(Jacobsen)等人，(美国专利号7,206,639)描述。在一些实施例中，可以在外科手术过程中将导管或泵定位在例如患者的耳中(例如，外耳、中耳和/或内耳)。在一些实施例中，可以将导管或泵定位在例如患者的耳中(例如，外耳、中耳和/或内耳)，而不需要外科手术。

可替代地或另外地，本文所述的一种或多种化合物可以与一种佩戴在外耳中的机械装置(如一种耳蜗植入物或助听器)联合使用。适合于与本发明一起使用的示例性耳蜗植入物由埃奇(Edge)等人(美国公开号2007/0093878)描述。

在一些实施例中，上述给药方式可以按照任何顺序组合并且可以是同时的或者散布的。

可替代地或另外地，本发明可以根据食品药品监督管理局批准的任何方法给药，例如，如描述于《CDER数据标准手册》(CDER Data Standards Manual)，版本号004(在fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm可获得)。

一般而言，在美国专利申请20120328580中描述的这些细胞治疗方法可以用来体外促进细胞向或朝向内耳的成熟细胞类型(例如，毛细胞)的完全或部分分化。从这样的方法得到的细胞然后可以移植或植入到需要这种治疗的患者中。下面描述了实践这些方法所需的细胞培养方法，包括用于鉴定和选择适当细胞类型的方法、用于促进选定细胞的完全或部分分化的方法、用于鉴定完全或部分分化的细胞类型的方法、以及用于植入完全或部分分化的细胞的方法。

适合于在本发明中使用的细胞包括但不限于，当与本文所述的一种或多种化合物例如体外接触时能够完全或部分分化成内耳的成熟细胞，例如，毛细胞(例如，内耳和/或外耳毛细胞)的细胞。能够分化成毛细胞的示例性细胞包括但不限于干细胞(例如，内耳干细胞、成体干细胞、骨髓源性干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞、iPS细胞、和脂肪来源干细胞)、祖细胞(例如，内耳祖细胞)、支持细胞(例如，戴特斯细胞(Deiters'cell)、柱细胞、内指状细胞、顶盖细胞和汉森细胞)、和/或生殖细胞。干细胞用于替代内耳感觉细胞的用途描述于Li等人(美国公开号2005/0287127)和李(Li)等人(美国专利序列号11/953,797)。骨髓源性干细胞用于替代内耳感觉细胞的用途描述于埃奇(Edge)等人的PCT/US2007/084654。iPS细胞描述于，例如，高桥(Takahashi)等人，《细胞》(Cell)，第131卷，第5次发行，第861-872页(2007)；高桥(Takahashi)和山中(Yamanaka)，《细胞》126，663-76(2006)；冲田(Okita)等人，《自然》(Nature)448，260-262(2007)；余(Yu)J.等人，《科学》(Science)318(5858):1917-1920(2007)；中川(Nakagawa)等人，《自然生物技术》(Nat.Biotechnol.)26:101-106(2008)；以及扎瑞斯(Zaehres)和肖勒(Scholer)，《细胞》131(5):834-835(2007)。

可以通过分析(例如，定性或定量)一种或多种组织特异型基因的存在来鉴定这种适合的细胞。例如，可以通过检测一种或多种组织特异型基因的蛋白质产物来检测基因表达。蛋白质检测技术包括使用针对适当抗原的抗体将蛋白质染色(例如，使用细胞提取物或全细胞)。在这种情况下，该适当抗原是该组织特异型基因表达的蛋白质产物。虽然在原则上可以标记第一抗体(即，结合该抗原的抗体)，更普遍的是(并且改进可视化)使用针对该第一抗体的第二抗体(例如，一种抗IgG)。这种第二抗体与荧光染料、或适当的用于比色反应的酶、或金珠(用于电子显微镜检查)、或者与生物素-亲和素系统结合，使得该一级抗体进而该抗原的位置可以被识别。

通过将药物组合物直接应用于外耳，本发明的CRISPR Cas分子可以递送到耳，其中组合物从美国公开申请20110142917修改而来。在一些实施例中，该药物组合物应用于耳道。递送至耳还可以称为听觉或耳递送。

在一些实施例中，本发明的RNA分子在脂质体或阳离子脂质体配制品等等中进行递送并且可以通过本领域技术人员熟知的方法进行制备。这样的方法描述于，例如，美国专利号5,593,972、5,589,466、和5,580,859中，将其通过引用并入本文。

已经开发了专门针对增强和改进递送siRNA到哺乳动物细胞中的递送系统，(参见，例如，沈(Shen)等人《欧洲生化学会联合会快报》(FEBS Let.)2003，539:111-114；夏(Xia)等人，《自然生物技术》(Nat.Biotech.)2002，20:1006-1010；赖希(Reich)等人，《分子视界》(Mol.Vision.)2003，9:210-216；索伦森(Sorensen)等人，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)2003，327:761-766；路易斯(Lewis)等人，《自然遗传学》(Nat.Gen.)2002，32:107-108以及西梅奥尼(Simeoni)等人，NAR 2003，31，11:2717-2724)并且可以将其应用于本发明。最近，siRNA已经成功用于抑制灵长动物中的基因表达(参见例如托伦蒂诺(Tolentino)等人，《视网膜》(Retina)24(4):660，它也可应用于本发明。

齐(Qi)等人披露了通过可应用于本发明的CRISPR Cas系统的新蛋白质递送技术经由完整圆窗到内耳的有效siRNA转染方法(参见，例如，齐(Qi)等人，《基因治疗》(GeneTherapy)(2013)，1-9)。具体地说，可将Cy3标记的siRNA经由完整圆窗渗透转染到内耳的细胞中(包括内和外毛细胞、壶腹嵴、椭圆囊斑和球囊斑)的TAT双链RNA结合结构域(TAT-DRBD)成功用于体内递送双链siRNA，用于治疗各种内耳疾病和保留听觉功能。可以考虑约40μl的10mM RNA作为施用至耳的剂量。

根据瑞嘉利(Rejali)等人(《听力研究》(Hear Res.)2007年6月；228(1-2):180-7)，耳蜗植入物的功能借助于良好保留螺旋神经节神经元而得以改善，这些神经元是经由植入物电刺激的靶标，并且先前已经表明脑源性神经营养因子(BDNF)在实验性变聋的耳中增强了螺旋神经节的存活。瑞嘉利(Rejali)等人测试了耳蜗植入物电极的改良设计，该电极包括被具有BDNF基因插入片段的病毒载体转导的成纤维细胞的涂层。为了完成这种类型的离体基因转移，瑞嘉利(Rejali)等人用具有BDNF基因盒插入片段的腺病毒转导豚鼠，并且确定这些细胞分泌BDNF，进而将BDNF分泌细胞经由琼脂糖凝胶附着在该耳蜗植入物电极上，并且将该电极植入鼓阶中。瑞嘉利(Rejali)等人确定，该BDNF表达电极与对照电极相比在植入48天之后能够保留显著更多的在耳蜗底回中的螺旋神经节神经元，并且证明了耳蜗植入物治疗与用于增强螺旋神经节神经元存活的离体基因转移相结合的可行性。这样一种系统可以应用于递送到耳的本发明的CRISPR Cas系统。

穆科吉(Mukherjea)等人(《抗氧化剂与氧化还原信号》(Antioxidants&RedoxSignaling)，第13卷，第5期，2010)证明，使用短干扰(si)RNA敲低NOX3消除了顺铂的耳毒性，正如保护OHC免于损害以及在听觉脑干反应(ABR)中降低的阈值位移所证明。将不同剂量的siNOX3(0.3、0.6、和0.9μg)施用至大鼠并且通过实时RT-PCR评估NOX3表达。当与序列打乱的(scrambled)siRNA的经鼓膜施用或未治疗的耳蜗比较时，使用的最低剂量的NOX3siRNA(0.3μg)未显示对NOX3mRNA的任何抑制。然而，与序列打乱的对照siRNA相比，给予更高剂量的NOX3siRNA(0.6和0.9μg)降低了NOX3表达。这样一种系统系统可应用于经鼓膜给药的本发明的CRISPR Cas系统，其中向人类给药的CRISPR Cas的剂量为约2mg到约4mg。

荣格(Jung)等人(《分子治疗》(Molecular Therapy)，第21卷，第4期，834-841，2013年4月)证明，在椭圆囊中的Hes5水平在应用siRNA之后降低，并且在这些椭圆囊中的毛细胞的数目显著大于对照处理之后的数目。这些数据表明，siRNA技术可以用于诱导内耳中的修复和再生，并且Notch信号通路对于特异性基因表达抑制是一个潜在有用的靶标。荣格(Jung)等人将通过将无菌生理盐水加入冻干siRNA而制备的8μg的Hes5siRNA以2μl体积注射到耳的前庭上皮。这样一种系统系统可应用于向耳的前庭上皮给药的本发明的CRISPRCas系统，其中向人类给药的CRISPR Cas的剂量为约1到约30mg。

品荣(Pinyon)J.L.等人(《科学转化医学》(Sci.Transl Med.)2014年4月23日；6(233):233ra54.doi:10.1126/scitranslmed.3008177.使用人工耳蜗电极阵列的近场电穿孔基因递送增强仿生耳(Close-field electroporation gene delivery using thecochlear implant electrode array enhances the bionic ear).)报道了他们的豚鼠研究，显示整合到人工耳蜗中的神经营养素基因治疗通过刺激螺旋神经节神经突再生而改进其性能。诸位作者使用人工耳蜗电极阵列进行新型“近场”电穿孔以用裸DNA基因构建体转导内衬有耳蜗外淋巴管的间充质细胞，该基因构建体驱动脑源性神经营养因子(BDNF)和绿色荧光蛋白(GFP)报告子的表达。通过具体人工耳蜗电极构型对电场进行调焦导致向邻近间充质细胞的出人意料地有效的基因递送。在双侧感音性耳聋模型中，所得BDNF表达刺激螺旋神经节神经突的再生，这些神经突在耳毒性治疗后2周已经萎缩。在这个模型中，仅有GFP的对照载体的递送未能重建神经元结构，并且萎缩的神经元与未植入的耳蜗不可区分。通过BDNF治疗，再生的螺旋神经节神经突延伸靠近人工耳蜗电极，伴随局部异位分支。这种神经重塑允许经由人工耳蜗阵列进行双极刺激，其中刺激阈值较低并且耳蜗神经动态范围得到扩展，经由电诱发的听脑干反应确定的。这种发展可以广泛地改进神经接口并且扩展分子医学应用。

阿特金森(Atkinson)P.J.等人(《公共科学图书馆-综合》(PLoS One)2014年7月18日；9(7):e102077.doi:10.1371/journal.pone.0102077.eCollection2014.ATOH1基因治疗后严重失聪的成年豚鼠的耳蜗中的毛细胞再生(Hair cell regeneration afterATOH1gene therapy in the cochlea of profoundly deaf adult guinea pigs).)报道了一项研究的结果，该研究的目标在于通过引入ATOH1(一种已知毛细胞发育所必需的转录因子)和引入神经营养因子促进成熟耳蜗中的感觉毛细胞再生及其与听觉神经元的再连接。在耳毒性失聪后四天，将含有单独的ATOH1或与神经营养素-3和脑源性神经营养因子一起的腺病毒载体注射进豚鼠耳蜗的下基蜗管(lower basal scala media)中。当处理后3周进行检查时，与对侧的未经处理的耳蜗相比，单独地用ATOH1基因治疗处理的豚鼠具有显著更多数目的表达毛细胞标记的细胞。然而，这种增加并没有使得听觉阈值得到相称的改进，突触带也没有增加，如通过在单独的ATOH1处理后或者当与神经营养素结合时通过CtBP2点测量的。然而，在用ATOH1和神经营养因子同时处理后毛细胞形成和突触发生仍是不确定的，因为当将样品组合时由于病毒滴度减半，病毒转导降低。诸位作者得出的结论是共同地，这些数据表明，虽然ATOH1单独可以在成熟耳蜗中驱动非感觉细胞朝向未成熟的感觉毛细胞表型，但是在氨基糖苷诱导的耳聋后这并不产生功能性改进。

耳聋和听觉损伤基因治疗描述

听觉损伤和平衡障碍的一个主要原因是人耳蜗内的毛细胞的损失。损失可以是由于噪声、耳毒性损伤等。不幸的是，没有证据支持在成年哺乳动物(包括人类)中可以自发地产生新的毛细胞，并且没有可靠地刺激哺乳动物中的毛细胞再生的方法。

出生后的耳蜗

尽管如此，但是最近的报道已经显示某些基因(如人ATOH1)的过表达可以诱导新的毛细胞的产生。ATOH1是一种碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子，已经显示它是毛细胞再生中的关键调节子。因此，使用CRISPR-Cas9系统经由表观遗传工程调节ATOH1体内表达可以被用作人类耳聋或其他类型的听觉损伤的潜在治疗方法。用于这种类型的听觉疾病的有效基因治疗发展的主要挑战是：(a)缺乏可容易地设计的基因组工程：这通过CRISPR-Cas9技术得到了解决。具体而言，产生Cas9蛋白的非切割突变形式(dCas9)的能力，该突变形式能够结合到靶DNA序列但是不引入任何DNA损伤或修饰。(b)体内递送的效率低：这通过小Cas9(来自金黄色葡萄球菌的SaCas9)得到改进，所述小Cas9可以被容易地包装到单个AAV载体中，从而既表达dCas9蛋白、融合效应子，又表达对应的一个或多个嵌合指导RNA。(c)表观遗传调节的效率低，这是由于必须应用多个指导物来操纵单一基因并且因此需要共递送多个病毒载体。

申请人已经通过优化dCas9和融合效应子、嵌合指导RNA设计而解决了多指导物问题。具体而言，可以通过串联插入将多个MS2结合位点工程化到嵌合RNA骨架中。以此方式，通过由dCas9、修饰的嵌合指导RNA和融合效应子组成的三组分复合物进行表观遗传工程。融合效应子具有MS2蛋白和表观遗传改性剂，如VP64、p65、KRAB、SID或SID4X结构域。重要的是，还可以按相同方式探索其他RNA-蛋白质相互作用。另外，多载体问题还通过引入小SaCas9得到改善，所述小SaCas9将进行实验所需的病毒载体的数目从(总计2或3个载体)降至仅(总计1或2个载体)。

申请人的使用SaCas9的基因组工程化系统可以被有效地包装到AAV或Ad病毒中，并且具体而言可以用于在体内修饰哺乳动物细胞中的内源表观遗传状态，由此调节疾病相关基因或基因组座位的表达水平，以实现治疗效果。单载体设计中的该系统的组分示于图24中，该图显示了基于dCas9的表观遗传调节系统的设计(示出了该系统的3种组分，即dSaCas9、融合效应子和sgRNA)。这个系统可以与基于腺相关病毒(AAV)、腺病毒(Ad)或其他递送载体的递送方法组合，以在体内修饰细胞的表观遗传状态。

使用dSaCas9刺激ATOH1表达以治疗耳聋或听觉损伤的非限制性实例提供在本文的实例6以及图24和25中。

眼

本发明还考虑了向一只或两只眼耳递送该CRISPR-Cas系统。

在本发明的又另一个方面，该CRISPR-Cas系统可以用来矫正几种基因突变引起的眼部缺陷，其进一步描述于《眼的遗传疾病》(Genetic Diseases of the Eye)，第二次编辑，由伊莱亚斯(Elias)I.特拉布勒西(Traboulsi)编辑，牛津大学出版社，2012年。

为了向眼部给药，慢病毒载体，尤其是马传染性贫血病毒(EIAV)是特别优选的。

在另一个实施例中，还考虑了基于马传染性贫血病毒(EIAV)的最小非灵长类慢病毒载体，尤其是对于眼基因治疗而言(参见，例如，巴鲁谷安(Balagaan)，《基因医学杂志》(JGene Med)2006；8:275-285，2005年11月21日在《威利在线期刊》(Wiley InterScience)(www.interscience.wiley.com).DOI:10.1002/jgm.845)在线公开。考虑这些载体具有驱动靶基因表达的巨细胞病毒(CMV)启动子。前房内、视网膜下、眼内和玻璃体内注射菌均予以考虑(参见，例如，巴鲁谷安(Balagaan)，《基因医学杂志》(J Gene Med)2006；8:275-285，2005年11月21日在《威利在线期刊》(Wiley InterScience)(www.interscience.wiley.com).DOI:10.1002/jgm.845)在线公开。可以在手术显微镜的辅助下进行眼内注射。为了视网膜下和玻璃体内注射，通过轻轻指压可以使眼睛突出，并且使用接触镜系统看见眼底，该接触镜系统包含在角膜上的一滴耦合介质溶液，角膜用玻璃显微镜载玻片盖玻片覆盖。为了视网膜下注射，安装在5-μl的汉密尔顿注射器上的10-mm34号针的尖端可以在直接可视化之下穿过巩膜赤道部上部朝向后极切向行进，直到该针的孔在视网膜下空间中可见时为止。然而，可以注射2μl的载体悬浮液以产生上部泡状视网膜脱离，从而证实视网膜下载体给药。这种方法建立了一种自我愈合的巩膜切开术，允许载体悬浮液保留在视网膜下空间中，直到它在该操作的48小时之内被RPE吸收为止。可以在半球下方重复这个操作以产生下部视网膜脱离。这种技术导致大约70％的感觉神经性视网膜和RPE暴露于该载体悬浮液。为了玻璃体内注射，针尖可以在角巩膜缘后方1mm穿过巩膜并且将2μl的载体悬浮液注射到玻璃体腔中。为了前房内注射，针尖可以通过角巩膜缘穿刺朝向中央角膜行进，并且可以注射2μl的载体悬浮液。为了前房内注射，针尖可以通过角巩膜缘穿刺朝向中央角膜行进，并且可以注射2μl的载体悬浮液。可以1.0-1.4×10¹⁰或1.0-1.4×10⁹个转导单位(TU)/ml的滴度注射这些载体。

在另一个实施例中，还考虑了一种经由视网膜下注射用于治疗湿型的年龄相关性黄斑变性的表达血管生成抑制蛋白(内皮抑素和血管抑素)的基于马传染性贫血病毒的慢病毒基因治疗载体(参见，例如，宾利(Binley)等人，《人类基因治疗》(HUMANGENE THERAPY)23:980-991(2012年9月))。这样一种载体可以改良为本发明的CRISPR-Cas系统。每只眼可以用以1.1x>5个转导单位/眼(TU/眼)以总体积100μl进行治疗。

在另一个实施例中，对于递送至眼可以考虑E1-、部分E3-、E4-缺失的腺病毒载体。对患有晚期新生血管性年龄相关性黄斑变性(AMD)的二十八位患者给予表达人色素上皮源性因子(AdPEDF.ll)的E1-、部分E3-、E4-缺失的腺病毒载体的单次玻璃体内注射(参见，例如，坎波基亚罗(Campochiaro)等人，《人类基因治疗》(Human Gene Therapy)17:167-176(2006年2月))。研究了从10⁶到10^9.5个粒子单位(PU)范围的剂量，没有与AdPEDF.ll有关的严重不良事件且没有剂量限制性毒性(参见，例如，坎波基亚罗(Campochiaro)等人，《人类基因治疗》(Human>

在另一个实施例中，RXi制药公司(RXi Pharmaceuticals)的系统可以用于和/或适用于将CRISPR Cas递送至眼。在这个系统中，3μg的sd-rxRNA的单次玻璃体内给药导致PPIB mRNA水平的序列特异性降低，持续14天。该系统可以应用于本发明的CRISPR Cas系统，考虑向人类给药的剂量为约3到20mg的CRISPR。

米林顿-华德(Millington-Ward)等人(《分子治疗》(Molecular Therapy)，第19卷，第4期，642-649，2011年4月)描述了腺相关病毒(AAV)载体，其用来递送基于RNA干扰(RNAi)的视紫红质抑制剂和由于在RNAi靶位点上的简并位置处的核苷酸改变而抵抗抑制的密码子修饰的视紫红质代替基因。由米林顿-华德(Millington-Ward)等人将6.0x>8vp或1.8x>10vp AAV的注射剂经视网膜下注射到眼中。米林顿-华德(Millington-Ward)等人的AAV载体可以应用于本发明的CRISPR Cas系统，考虑向人类给药的剂量为约2x>11到约6x>13vp。

戴尔卡拉(Dalkara)等人(《科学转化医学》(Sci Transl Med)5，189ra76(2013))还涉及用于形成一种AAV载体的体内定向演化，该AAV载体在将野生型缺陷型基因无损伤地注射到眼的玻璃体液中之后递送至整个视网膜。戴尔卡拉(Dalkara)描述了7聚体肽展示文库和通过从AAV1、2、4、5、6、8、和9的cap基因的DNA改组构建的AAV文库。将这些rcAAV文库和在CAG或Rho启动子之下表达GFP的rAAV载体进行包装，并且通过定量PCR获得抗脱氧核糖核酸酶的基因组滴度。汇集这些文库，并且进行两轮演化，每轮演化包括初始文库多样化继之以三个体内选择步骤。在每个这样的步骤中，用2ml的碘克沙醇纯化的磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析的文库以约1×10¹²vg/ml的基因组滴度对P30rho-GFP小鼠进行玻璃体内注射。戴尔卡拉(Dalkara)等人的AAV载体可以应用于本发明的CRISPR Cas系统，考虑向人类给药的剂量为约1x>15到约1x>16vg/ml。

在另一个实施例中，该视紫红质基因可以被靶向用于治疗色素性视网膜炎(RP)，其中转让给桑加莫生物科学公司(Sangamo BioSciences，Inc.)的美国专利公开号20120204282的系统可以依照本发明的CRISPR Cas系统进行修饰。

在另一个实施例中，针对从人类视紫红质基因切割靶序列的方法的转让给Cellectis公司的美国专利公开号20130183282的方法也可以针对本发明的CRISPR Cas系统进行修改。

转让给台湾中央研究院(Academia Sinica)的美国专利公开号20130202678涉及用于治疗视网膜病变和视力威胁性眼科疾病(sight-threatening ophthalmologicdisorders)的方法，这些方法涉及向眼的视网膜下或玻璃体内空间中递送Puf-A基因(在眼组织的视网膜神经节和色素细胞中表达并且展示出独特的抗凋亡活性)。具体地说，令人希望的靶标是zgc:193933、prdm1a、spata2、tex10、rbb4、ddx3、zp2.2、Blimp-1和HtrA2，均可以由本发明的CRISPR Cas系统靶向。

吴(Wu)(《细胞—干细胞》(Cell Stem Cell)，13:659-62，2013)设计了一种指导RNA，其将Cas9导向到单个碱基突变，该突变在小鼠中引起白内障，其中它诱导DNA切割。然后，在突变小鼠中，使用针对接合子修复机制给予的另一种野生型等位基因或寡核苷酸(oligos)校正断裂的等位基因的序列并且校正引起白内障的基因缺陷。

美国专利公开号20120159653描述了使用锌指核酸酶基因修饰与黄斑变性(MD)相关的细胞、动物以及蛋白质。黄斑变性(MD)是老年人视力损害的主要原因，但也是儿童疾病如斯塔加特病(Stargardt disease)、索斯比基底营养不良(Sorsby fundus)、和儿童致死性神经变性疾病(在如婴儿期一般年幼的年龄就开始)的标志性症状。由于对视网膜的损害，黄斑变性导致视野中心(黄斑)的视力丧失。当前存在的动物模型并未概括该疾病的主要标志，因为它是在人类中观察到的。包含编码与MD相关的蛋白质的突变基因的可得到的动物模型也产生高度可变的表型，使得针对人类疾病和治疗开发的翻译是有问题的。

美国专利公开号20120159653的一个方面包括编辑任何编码与MD相关的蛋白质的染色体序列，这些序列可以应用于本发明的CRISPR Cas系统。典型地，基于与MD相关的蛋白质与MD病症的实验性关联，选择与MD相关的蛋白质。例如，相对于缺乏MD病症的群体，在具有MD病症的群体中，与MD相关的蛋白质的产生率或循环浓度可以升高或降低。可以使用蛋白质组技术评估蛋白质水平差异，包括但不限于蛋白质印迹、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)以及质谱法。可替代地，可以使用基因组技术通过获得编码这些蛋白质的基因的基因表达谱而鉴定与MD相关的蛋白质，包括但不限于DNA微阵列分析、基因表达系列分析(SAGE)以及定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR)。

通过非限制性实例的方式，与MD相关的蛋白质包括但不限以下蛋白质：(ABCA4)ATP结合盒，亚家族A(ABC1)，成员4、ACHM1全色盲(视杆单色色盲)1、ApoE，载脂蛋白E(ApoE)、C1QTNF5(CTRP5)，C1q和肿瘤坏死因子相关蛋白5(C1QTNF5)、C2补体，补体2(C2)、C3补体，补体(C3)、CCL2，趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、CCR2，趋化因子(C-C基序)受体2(CCR2)、CD36分化抗原簇36、CFB，补体受体B、CFH，补体因子CFH H、CFHR1，补体因子H相关1、CFHR3，补体因子H相关3、CNGB3环核苷酸门控通道β3、CP血浆铜蓝蛋白(CP)、CRP，C反应蛋白(CRP)、CST3半胱氨酸蛋白酶抑制剂C或半胱氨酸蛋白酶抑制剂3(CST3)、CTSD，组织蛋白酶D(CTSD)、CX3CR1，趋化因子(C-X3-C基序)受体1、ELOVL4，超长链脂肪酸延伸4、ERCC6，切除修复交叉互补啮齿动物修复缺陷，互补群6、FBLN5，抗衰老蛋白-5，FBLN5，抗衰老蛋白5、FBLN6，抗衰老蛋白6FSCN2聚束蛋白(FSCN2)、HMCN1，半椎蛋白1，HMCN1，半椎蛋白1、HTRA1，HtrA丝氨酸肽酶1(HTRA1)，HTRA1、HtrA丝氨酸肽酶1、IL-6，白细胞介素6、IL-8，白细胞介素8、LOC387715、假定蛋白、PLEKHA1、含血小板白细胞C激酶底物同源性域家族A成员1(PLEKHA1)、PROM1，普罗敏蛋白1(PROM1或CD133)、PRPH2，外周蛋白-2RPGR色素性视网膜炎GTP酶调节剂、SERPING1，丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制剂，进化枝G，成员1(C1-抑制剂)、TCOF1，糖蜜TIMP3金属蛋白酶抑制剂3(TIMP3)、TLR3Toll样受体3。

与MD相关的其染色体序列被编辑的蛋白质的一致性可以并且应该变化。在优选的实施例中，与其染色体序列被编辑的MD相关的蛋白质可以是ATP结合盒、由ABCR基因编码的亚家族A(ABC1)成员4蛋白(ABCA4)、由APOE基因编码的载脂蛋白E蛋白(APOE)、由CCL2基因编码的趋化因子(C-C基序)配体2蛋白(CCL2)、由CCR2基因编码的趋化因子(C-C基序)受体2蛋白(CCR2)、由CP基因编码的血浆铜蓝蛋白蛋白(CP)、由CTSD基因编码的组织蛋白酶D蛋白(CTSD)、或由TIMP3基因编码的金属蛋白酶抑制剂3蛋白(TIMP3)。在一个示例性实施例中，该遗传修饰的动物是大鼠，并且与编码与MD相关的蛋白质的编辑的染色体序列可以是：(ABCA4)ATP结合盒NM_000350亚家族A(ABC1)，成员4、APOE，载脂蛋白ENM_138828(APOE)、CCL2，趋化因子(C-C NM_031530基序)配体2(CCL2)、CCR2趋化因子(C-C NM_021866基序)受体2(CCR2)、CP血浆铜蓝蛋白(CP)NM_012532、CTSD组织蛋白酶D(CTSD)NM_134334、TIMP3金属蛋白酶NM_012886抑制剂3(TIMP3)。该动物或细胞可以包括1、2、3、4、5、6、7个或更多个破坏的编码与MD相关的蛋白质的染色体序列以及零、1、2、3、4、5、6、7个或更多个编码破坏的与MD相关的蛋白质的染色体整合序列。

编辑的或整合的染色体序列可以被修饰为编码一种改变的与MD相关的蛋白质。MD相关染色体序列中的几种突变已经与MD相关。在与MD相关的染色体序列中的突变的非限制性实例包括可引起MD的那些，包括在ABCR蛋白中的：E471K(即，在位置471的谷氨酸被改变为赖氨酸)、R1129L(即，在位置1129处的精氨酸被改变为亮氨酸)、T1428M(即，在位置1428处的苏氨酸被改变为甲硫氨酸)、R1517S(即，在位置1517处的精氨酸被改变为丝氨酸)、I1562T(即，在位置1562处的异亮氨酸被改变为苏氨酸)、以及G1578R(即，在位置1578处的甘氨酸被改变为精氨酸)；在CCR2蛋白中的：V64I(即，在位置192处的缬氨酸被改变为异亮氨酸)；在CP蛋白质中的：G969B(即，在位置969处的甘氨酸被改变为天冬酰胺或天冬氨酸)；在TIMP3蛋白中的：S156C(即，在位置156处的丝氨酸被改变为半胱氨酸)、G166C(即，在位置166处的甘氨酸被改变为半胱氨酸)、G167C(即，在位置167处的甘氨酸被改变为半胱氨酸)、Y168C(即，在位置168处的酪氨酸被改变为半胱氨酸)、S170C(即，在位置170处的丝氨酸被改变为半胱氨酸)、Y172C(即，在位置172处的酪氨酸被改变为半胱氨酸)以及S181C(即，在位置181处的丝氨酸被改变为半胱氨酸)。MD相关基因和疾病的遗传变体的其他关联在本领域是已知的。

眼病基因治疗

存在许多类型的遗传性视网膜疾病，已经在其遗传基础上对这些疾病进行了广泛映射并且因此为采用基因组工程技术开发用于治疗人类患者的这些病症的有效基因疗法提供了良好的途径。基于可行性，在下表中示出了眼病的清单连同关于其遗传学和遗传模式的注释。

疾病列表和注释

用于眼病的有效基因治疗发展的主要挑战是：(a)缺乏可容易地设计的基因组工程；(b)体内递送效率低；以及(c)HDR的效率低，这是由于多种病毒载体的共递送。申请人已经表明，该CRISPR-Cas9技术有效地解决这些挑战并且为这些挑战提供了解决方案。申请人已经表明，体内递送效率低以及HDR的效率低和共递送的挑战通过小Cas9(来自金黄色葡萄球菌的SaCas9)得到了解决，该小Cas9可以被容易地包装进单个腺相关病毒(AAV)载体中来表达Cas9蛋白及其相应的一种或多种sgRNA两者。此外，申请人已经表明引入小SaCas9已经将进行同源定向修复(HDR)所需的病毒载体数目从3个载体降至2个载体。

使用基于SaCas9的CRISPR-Cas基因组工程系统体内地修饰哺乳动物细胞中的内源基因组序列：

申请人已经表明，使用SaCas9的基因组工程系统可以被有效地包装进AAV中，并且具体而言可以用于体内地修饰哺乳动物细胞中的内源基因组序列。

申请人的SaCas9系统的基本特征示于图15中。这个系统可以与基于腺相关病毒(AAV)的递送方法组合以在体内编辑有丝分裂后细胞并且当与特异性递送载体组合时，对于人类视网膜中的许多细胞类型来说是有效的。在视网膜疾病治疗的情况下，采用两个递送途径：AAV被注射进眼的玻璃体液中的玻璃体内AAV注射可以用于靶向视网膜神经节细胞和穆勒(Muller)神经胶质细胞，或用于维持眼部细胞内的转基因的长期表达。另一方面，少量的流体被注射到视网膜下方的视网膜下AAV注射有效地靶向光感器和视网膜颜料上皮(RPE)细胞。

AAV血清型2和8(AAV2和AAV8)是可以用于使用玻璃体内途径为神经节和穆勒细胞进行递送的最有效血清型。AAV血清型1、2、5、7、8、DJ可以用来经由视网膜下注射程序将转基因递送到光感器和RPE细胞中。使用这个系统进行基因治疗的详细模型示于图16中。

应当容易理解的是，本文描述的、在图16中展示的并且在实例2-5中示例的体内治疗性基因组工程方法可以用于校正眼部系统中的致病突变或其他类型的基因组异常。该方案可以被总结成以下步骤：(i)体外靶标和HDR模板验证；(ii)病毒产生；(iii)病毒纯化；以及(iv)眼部注射。

用于色素性视网膜炎的体内治疗性基因组工程

色素性视网膜炎(RP)是一种可以导致视力受损并且在一些情况下导致失明的遗传性眼部障碍。它是一种类型的退行性眼病，通常由涉及在人眼中的光感器细胞或视网膜色素上皮(RPE)细胞的功能或调节中的基因的错义突变引起。RP是最常见形式的遗传性视网膜变性之一。

RP的分子遗传学中的关键基因是视紫红质基因(RHO)。RHO基因编码光感器外节的主要蛋白质。研究显示，这个基因的突变负责大约25％的染色体显性形式的RP。

引起RP的RHO突变的一个实例是密码子23处的CCC至CAC的核苷酸取代，其在RHO基因的位置23或RHO(P23H)处编码组氨酸取代苯丙氨酸。P23H突变是常染色体显性色素性视网膜炎的最常见原因之一(图18A)。杂合患者的表型主要是视网膜病变和进行性视网膜变性。对于这种疾病而言纯合的患者展现出更严重的表型。已经观察到突变P23H蛋白的糖基化严重减少。一般而言，作为周边视野退化的结果，患者可能经历有缺陷的亮到暗、暗到亮适应或夜盲。在一些情况下还观察到中心视觉丧失。RP可以是非综合征性的或与耳聋、共济失调等是综合征性的。

其他RP疾病突变/基因组异常的清单

如以上指出的，应当容易理解的是，本文描述的并且在图5中示出的申请人的体内治疗性基因组工程方法可以用于校正眼部系统中的致病突变或其他类型的基因组异常。在本文的实例2和3中讨论了靶向RHO基因的用于色素性视网膜炎基因治疗的申请人的基因组工程方法。

用于全色盲的体内治疗性基因组工程

全色盲(ACHM)是一种由患者在高光水平(即室外日光)下不能感知颜色、维持正常视敏度描述的医学病症。虽然它可以指代获得性病症，但是典型地它是指常染色体隐性先天性色觉病症。该病症还可以表现为被定义为色觉障碍的不完全形式。一般群体中的估计发生率是33,000人中约有1人。

存在五种与ACHM相关的主要症状，即全色盲、弱视、昼盲、眼球震颤和虹膜操作异常。

ACHM的分子遗传学中的关键基因是锥细胞环核苷酸门控的离子通道基因CNGA3、CNGB3以及转导基因GNAT2。这些基因的突变将导致视网膜光转导途径的故障。确切地说，这种类型的先天性ACHM被认为是由于锥细胞不能通过超极化而适当地对光输入做出响应造成的。由CNGA3突变引起的全色盲被分类为ACHM2，由CNGB3突变引起的全色盲被分类为ACHM3，并且由GNAT2突变引起的全色盲被分类为ACHM4。这些是ACHM的主要类型，同时一些少数情况由基因PDE6C和其他基因的突变引起，被称为ACHM5。

靶向CNGA3和CNGB3突变的用于ACHM基因治疗的申请人的基因组工程方法描述于本文的实例4中。

对于CNGA3(ACHM2)，存在四种主要突变，即arg277向cys(R277C)、arg283向trp(R283W)、arg436向trp(R435W)以及phe547向leu(F547L)。这些致病突变占所有检测到的突变的41.8％(来自维辛格(Wissinger)等人2001，《美国人类遗传学杂志》(Am.J.Hum.Genet.)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11536077的报告)。这里申请人选择第一个和第二个突变(R277C和R283W)作为实例。由于它们极为接近，可以用相同的策略、构建体、病毒载体集和程序来校正这两个突变。

对于CNGB3(ACHM3)，1148delC突变是致病突变的普遍形式并且已经报道对75％的患者负有责任(维斯尼维斯基(Wiszniewski)等人2007，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17265047)。并且用HR模板载体通过Cas9介导的基因组工程方法校正这个突变能够挽救疾病表型。

其他全色盲疾病突变/基因组异常的清单

用于年龄相关性黄斑变性的体内治疗性基因组工程

年龄相关性黄斑变性(AMD或ARMD)是通常影响老年人并且由于对视网膜的损伤导致视野中心视力丧失的医学病症。它以“干”和“湿”形式发生。在50岁的成年人中，它是失明和视力损害的主要原因。

存在两种类型的ARMD，即湿式和干式。湿式或渗出形式的ARMD的特征为来自视网膜的脉络膜的血管发生。这些新血管是脆的并且可以导致黄斑下出血和蛋白质渗漏。来自这些血管的出血、渗漏和结瘢最终导致对光感器的不可逆性损伤并且因此如果不做处理的话导致视力快速减退。由于生长的血管，视网膜可以变得脱离。

在干式或非渗出形式中，称为玻璃疣的细胞碎片在视网膜与脉络膜之间积累，并且这影响患者的视力并且最终还可以导致视网膜脱离。

用于治疗年龄相关性黄斑变性的分子靶

潜在地可以用基因疗法治疗的最相关形式的ARMD是‘湿’式的ARMD。在这种情况下，通过血管内皮生长因子(VEGF)、或人类基因组中的基因组座位VEGFA刺激视网膜中的异常血管增生。因此，可以阻遏VEGF表达或抑制其活性的方法可以停止或在一些情况下逆转血管的生长。这是一种用于有效治疗人类患者的这种类型的ARMD的有希望的分子方法。

用于治疗年龄相关性黄斑变性的基因治疗的示例性、非限制性基因组工程方法示例于本文的实例5和图23A-B中。

心脏

本发明还考虑了向心脏递送该CRISPR-Cas系统。对于心脏，心肌热带腺相关病毒(AAVM)优选的，尤其是在心脏中显示出优先基因转移的AAVM41(参见，例如，林-扬加(Lin-Yanga)等人，PNAS，3月10日，2009年，第106卷，第10期)。给药可以是全身性的或局部的。对于全身给药可以考虑约1-10x>14个载体基因组的剂量。还参见，例如，埃拉里奥(Eulalio)等人(2012)《自然》(Nature)492:376和索马森达拉姆(Somasuntharam)等人(2013)《生物材料》(Biomaterials)34:7790。

例如，美国专利公开号20110023139描述了使用锌指核酸酶基因修饰与心血管疾病相关的细胞、动物以及蛋白质。心血管疾病通常包括高血压、心脏病发作、心力衰竭、以及中风和TIA。涉及心血管疾病的任何染色体序列或由涉及心血管疾病的任何染色体序列编码的蛋白质都可以在本披露中描述的方法中加以利用。典型地，基于心血管相关蛋白与心血管疾病的发展的实验性关联，选择心血管相关蛋白。例如，相对于缺乏心血管障碍的群体，在具有心血管障碍的群体中，心血管相关蛋白的产生率或循环浓度可以升高或降低。可以使用蛋白质组技术评估蛋白质水平差异，包括但不限于蛋白质印迹、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)以及质谱法。可替代地，可以使用基因组技术通过获得编码这些蛋白质的基因的基因表达谱而鉴定心血管相关蛋白，包括但不限于DNA微阵列分析、基因表达系列分析(SAGE)以及定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR)。

作为举例，该染色体序列可以包括但不限于，IL1B(白细胞介素1，β)、XDH(黄嘌呤脱氢酶)、TP53(肿瘤蛋白p53)、PTGIS(前列腺素12(前列环素)合酶)、MB(肌红蛋白)、IL4(白细胞介素4)、ANGPT1(血管生成素1)、ABCG8(ATP结合盒，亚家族G(白)，成员8)、CTSK(组织蛋白酶K)、PTGIR(前列腺素12(前列环素)受体(IP))、KCNJ11(内向整流钾通道，亚家族J，成员11)、INS(胰岛素)、CRP(C反应蛋白，正五聚蛋白相关的)、PDGFRB(血小板源生长因子受体，β多肽)、CCNA2(细胞周期蛋白A2)、PDGFB(血小板源生长因子β多肽(猴肉瘤病毒(v-sis)癌基因同源物))、KCNJ5(内向整流钾通道，亚家族J，成员5)、KCNN3(钾中间小电导钙激活通道，亚家族N，成员3)、CAPN10(卡配因10)、PTGES(前列腺素E合酶)、ADRA2B(肾上腺素能，α-2B-，受体)、ABCG5(ATP结合盒，亚家族G(WHITE)、成员5)、PRDX2(过氧化物氧化还原酶2)、CAPN5(卡配因5)、PARP14(聚(ADP-核糖)聚合酶家族，成员14)、MEX3C(mex-3同源物C(秀丽隐杆线虫))、ACE血管紧张素I转化酶(肽基二肽酶A)1)、TNF(肿瘤坏死因子(TNF超家族，成员2))、IL6(白细胞介素6(干扰素，β2))、STN(抑制素)、SERPINE1(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制剂，进化枝E(微管连接蛋白，纤溶酶原激活物抑制剂1型)、成员1)、ALB(白蛋白)、ADIPOQ(脂联素，含C1Q和胶原蛋白域)、APOB(载脂蛋白B(包括Ag(x)抗原))、APOE(载脂蛋白E)、LEP(瘦素)、MTHFR(5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(NADPH))、APOA1(载脂蛋白A-I)、EDN1(内皮素1)、NPPB(利钠肽前体B)、NOS3(一氧化氮合酶3(内皮细胞))、PPARG(过氧化物酶体增殖物活化受体γ)、PLAT(纤溶酶原激活物，组织)、PTGS2(前列腺素内过氧化物合酶2(前列腺素G/H合酶和环加氧酶))、CETP(胆固醇酯转移蛋白，血浆)、AGTR1(血管紧张素II受体，1型)、HMGCR(3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶)、IGF1(胰岛素样生长因子1(生长素调节素C))、SELE(选择素E)、REN(肾素)、PPARA(过氧化物酶体增殖物活化受体α)、PON1(对氧磷酶1)、KNG1(激肽原1)、CCL2(趋化因子(C-C基序)配体2)、LPL(脂蛋白脂酶)、VWF(冯·维勒布兰德因子)、F2(凝血因子II(凝血酶))、ICAM1(细胞间粘附分子1)、TGFB1(转化生长因子，β1)、NPPA(利钠肽前体A)、IL10(白细胞介素10)、EPO(促红细胞生成素)、SOD1(超氧化物歧化酶1，可溶性)、VCAM1(血管细胞粘附分子1)、IFNG(干扰素，γ)、LPA(脂蛋白，Lp(a))、MPO(髓过氧化物酶)、ESR1(雌激素受体1)、MAPK1(丝裂原活化蛋白激酶1)、HP(触珠蛋白)、F3(凝血因子III(促凝血酶原激酶，组织因子))、CST3(半胱氨酸蛋白酶抑制剂C)、COG2(寡聚高尔基复合体成分2)、MMP9(基质金属肽酶9(明胶酶B，92kDa明胶酶，92kDa IV型胶原酶))、SERPINC1(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制剂，进化枝C(抗凝血酶)、成员1)、F8(凝血因子VIII，促凝血成分)、HMOX1(血红素加氧酶(解环)1)、APOC3(载脂蛋白C-III)、IL8(白细胞介素8)、PROK1(前动力蛋白1)、CBS(胱硫醚-β-合酶)、NOS2(一氧化氮合酶2，诱导型)、TLR4(toll样受体4)、SELP(选择素P(颗粒膜蛋白140kDa，抗原CD62))、ABCA1(ATP结合盒，亚家族A(ABC1)、成员1)、AGT(血管紧张素原(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制剂，进化枝A，成员8))、LDLR(低密度脂蛋白受体)、GPT(谷丙转氨酶(丙氨酸转氨酶))、VEGFA(血管内皮生长因子A)、NR3C2(细胞核受体亚家族3，型C，成员2)、IL18(白细胞介素18(干扰素-γ-诱导因子))、NOS1(一氧化氮合酶1(神经元的))、NR3C1(细胞核受体亚家族3，C组，成员1(糖皮质激素受体))、FGB(纤维蛋白原β链)、HGF(肝细胞生长因子(肝细胞生长因子A；分散因子))、IL1A(白细胞介素1，α)、RETN(抵抗素)、AKT1(v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物1)、LIPC(脂肪酶，肝脏的)、HSPD1(热休克60kDa蛋白1(伴侣蛋白))、MAPK14(丝裂原活化蛋白激酶14)、SPP1(分泌磷蛋白1)、ITGB3(整合素，β3(血小板糖蛋白111a，抗原CD61))、CAT(过氧化氢酶)、UTS2(尾加压素2)、THBD(血栓调节蛋白)、F10(凝血因子X)、CP(血浆铜蓝蛋白(亚铁氧化酶))、TNFRSF11B(肿瘤坏死因子受体超家族，成员11b)、EDNRA(内皮素A型受体)、EGFR(表皮生长因子受体(红白血病病毒(v-erb-b)癌基因同源物，鸟类的))、MMP2(基质金属肽酶2(明胶酶A，72kDa明胶酶，72kDa IV型胶原酶))、PLG(纤维蛋白溶酶原)、NPY(神经肽Y)、RHOD(ras同源物基因家族，成员D)、MAPK8(丝裂原活化蛋白激酶8)、MYC(V-Myc骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物(鸟类的))、FN1(纤连蛋白1)、CMA1(糜酶1，肥大细胞)、PLAU(纤溶酶原激活物，尿激酶)、GNB3(鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)、β多肽3)、ADRB2(肾上腺素能，β-2-，受体，表面)、APOA5(载脂蛋白A-V)、SOD2(超氧化物歧化酶2，线粒体的)、F5(凝血因子V(促凝血球蛋白原，不稳定因子))、VDR(维生素D(1,25-二羟维生素D3)受体)、ALOX5(花生四烯酸盐5-脂氧合酶)、HLA-DRB1(主要组织相容性复合物，I类I，DRβ1)、PARP1(聚(ADP-核糖)聚合酶1)、CD40LG(CD40配体)、PON2(对氧磷酶2)、AGER(晚期糖基化终末产物特异性受体)、IRS1(胰岛素受体底物1)、PTGS1(前列腺素内过氧化物合酶1(前列腺素G/H合酶和环加氧酶))、ECE1(内皮素转化酶1)、F7(凝血因子VII(血清凝血酶原转变加速因子))、URN(白细胞介素1受体拮抗剂)、EPHX2(环氧化物水解酶2，细胞质的)、IGFBP1(胰岛素样生长因子结合蛋白1)、MAPK10(丝裂原活化蛋白激酶10)、FAS(Fas(TNF受体超家族，成员6))、ABCB1(ATP结合盒，亚家族B(MDR/TAP)，成员1)、JUN(jun癌基因)、IGFBP3(胰岛素样生长因子结合蛋白3)、CD14(CD14分子)、PDE5A(磷酸二酯酶5A，cGMP特异性)、AGTR2(血管紧张素II受体，2型)、CD40(CD40分子，TNF受体超家族成员5)、LCAT(卵磷脂胆甾醇酰基转移酶)、CCR5(趋化因子(C-C基序)受体5)、MMP1(基质金属肽酶1(间质胶原酶))、TIMP1(TIMP金属肽酶抑制剂1)、ADM(肾上腺髓质素)、DYT10(肌张力障碍10)、STAT3(信号传导和转录激活因子3(急性期反应因子))、MMP3(基质金属肽酶3(基质溶解素1，前白明胶酶))、ELN(弹性蛋白)、USF1(上游转录因子1)、CFH(补体因子H)、HSPA4(热休克70kDa蛋白4)、MMP12(基质金属肽酶12(巨噬细胞弹性蛋白酶))、MME(膜金属肽链内切酶)、F2R(凝血因子II(凝血酶)受体)、SELL(选择素L)、CTSB(组织蛋白酶B)、ANXA5(膜联蛋白A5)、ADRB1(肾上腺素能，β-1-，受体)、CYBA(细胞色素b-245，α多肽)、FGA(纤维蛋白原α链)、GGT1(γ-谷氨酰转肽酶1)、LIPG(脂肪酶，内皮的)、HIF1A(缺氧诱导因子1，α亚基(碱性-螺旋-环-螺旋转录因子))、CXCR4(趋化因子(C-X-C基序)受体4)、PROC(蛋白C(凝血因子Va和VIIIa抑制因子)、SCARB1(清道夫受体B类，成员1)、CD79A(CD79a分子，免疫球蛋白相关α)、PLTP(磷脂转移蛋白)、ADD1(内收蛋白1(α))、FGG(纤维蛋白原γ链)、SAA1(血清淀粉样蛋白A1)、KCNH2(电压门控钾离子通道，亚家族H(触角电位相关)、成员2)、DPP4(二肽基肽酶4)、G6PD(6-磷酸葡萄糖脱氢酶)、NPR1(钠尿肽受体A/鸟苷酸环化酶A(心房钠尿肽受体A))、VTN(玻连蛋白)、KIAA0101(KIAA0101)、FOS(FBJ鼠科骨肉瘤病毒癌基因同源物)、TLR2(toll样受体2)、PPIG(肽基脯氨酰异构酶G(亲环素G))、IL1R1(白细胞介素1受体，I型)、AR(雄激素受体)、CYP1A1(细胞色素P450，家族1，亚家族A，多肽1)、SERPINA1(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制剂，进化枝A(α-1抗蛋白酶，抗胰蛋白酶)，成员1)、MTR(5-甲基四氢叶酸高半胱胺酸甲基转移酶)、RBP4(视黄醇结合蛋白4，血浆)、APOA4(载脂蛋白A-IV)、CDKN2A(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(黑素瘤p16，抑制CDK4))、FGF2(成纤维细胞生长因子2(碱性))、EDNRB(内皮素受体B型)、ITGA2(整合素，α2(CD49B，VLA-2受体α2亚基))、CABIN1(钙调神经磷酸酶结合蛋白1)、SHBG(性激素结合球蛋白)、HMGB1(高迁移率族1)、HSP90B2P(热休克蛋白90kDaβ(Grp94)，成员2(假基因))、CYP3A4(细胞色素P450，家族3，亚家族A，多肽4)、GJA1(间隙连接蛋白，α1，43kDa)、CAV1(小窝蛋白1，细胞质膜微囊蛋白，22kDa)、ESR2(雌激素受体2(ERβ))、LTA(淋巴毒素α(TNF超家族，成员1))、GDF15(生长分化因子15)、BDNF(脑源性神经营养因子)、CYP2D6(细胞色素P450，家族2，亚家族D，多肽6)、NGF(神经生长因子(β多肽))、SP1(Sp1转录因子)、TGIF1(TGFB-诱导因子同源框1)、SRC(v-src肉瘤(施密特-鲁平(Schmidt-Ruppin)A-2)病毒癌基因同源物(鸟类的))、EGF(表皮生长因子(β-抑胃素))、PIK3CG(磷酸肌醇-3-激酶，催化的，γ多肽)、HLA-A(主要组织相容性复合物，I类，A)、KCNQ1(电压门控钾通道，KQT样亚家族，成员1)、CNR1(大麻素受体1(脑))、FBN1(微纤维蛋白1)、CHKA(胆碱激酶α)、BEST1(卵黄状黄斑病蛋白1)、APP(淀粉样蛋白β(A4)前体蛋白)、CTNNB1(连环蛋白(钙粘着蛋白关联蛋白)，β1，88kDa)、IL2(白细胞介素2)、CD36(CD36分子(凝血酶敏感蛋白受体))、PRKAB1(蛋白激酶，AMP活化的，β1非催化亚基)、TPO(甲状腺过氧化物酶)、ALDH7A1(醛脱氢酶7家族，成员A1)、CX3CR1(趋化因子(C-X3-C基序)受体1)、TH(酪氨酸羟化酶)、F9(凝血因子IX)、GH1(生长激素1)、TF(转铁蛋白)、HFE(血色素沉着病)、IL17A(白细胞介素17A)、PTEN(磷酸酯酶与张力蛋白同源物)、GSTM1(谷胱甘肽S-转移酶μ1)、DMD(肌营养不良蛋白)、GATA4(GATA结合蛋白4)、F13A1(凝血因子XIII，A1多肽)、TTR(转甲状腺素蛋白)、FABP4(脂肪酸结合蛋白4，脂肪细胞)、PON3(对氧磷酶3)、APOC1(载脂蛋白C-I)、INSR(胰岛素受体)、TNFRSF1B(肿瘤坏死因子受体超家族，成员1B)、HTR2A(5-羟色胺(血清素)受体2A)、CSF3(集落刺激因子3(粒细胞))、CYP2C9(细胞色素P450，家族2，亚家族C，多肽9)、TXN(硫氧还蛋白)、CYP11B2(细胞色素P450，家族11，亚家族B，多肽2)、PTH(甲状旁腺素、CSF2(集落刺激因子2(粒细胞-巨噬细胞))、KDR(激酶插入结构域受体受体(III型受体酪氨酸激酶))、PLA2G2A(磷脂酶A2，型IIA(血小板，滑液))、B2M(β-2-微球蛋白)、THBS1(凝血酶敏感蛋白1)、GCG(胰高血糖素)、RHOA(ras同源物基因家族，成员A)、ALDH2(醛脱氢酶2家族(线粒体的))、TCF7L2(转录因子7样2(T细胞特异性HMG盒))、BDKRB2(缓激肽受体B2)、NFE2L2(红细胞衍生核因子2样蛋白)、NOTCH1(Notch同源物1，易位相关的(果蝇))、UGT1A1(UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A1)、IFNA1(干扰素，α1)、PPARD(过氧化物酶体增殖物活化受体δ)、SIRT1(长寿蛋白(沉默交配型信息调控2同源物)1(酿酒酵母))、GNRH1(促性腺素释放激素1(黄体生成素释放激素))、PAPPA(妊娠相关血浆蛋白A，冠毛素1)、ARR3(抑制蛋白3，视网膜的(X-抑制蛋白))、NPPC(利钠肽前体C)、AHSP(α血红蛋白稳定蛋白)、PTK2(PTK2蛋白酪氨酸激酶2)、IL13(白细胞介素13)、MTOR(雷帕霉素机械靶(丝氨酸/苏氨酸激酶))、ITGB2(整合素，β2(补体成分3受体3和4亚基))、GSTT1(谷胱甘肽S-转移酶θ1)、IL6ST(白细胞介素6信号传导因子(gp130，抑瘤素M受体))、CPB2(羧肽酶B2(血浆))、CYP1A2(细胞色素P450，家族1，亚家族A，多肽2)、HNF4A(肝细胞核因子4，α)、SLC6A4(溶质载体家族6(神经递质转运蛋白，血清素)，成员4)、PLA2G6(磷脂酶A2，型VI(细胞溶质的，钙依赖性))、TNFSF11(肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员11)、SLC8A1(溶质载体家族8(钠/钙交换蛋白)，成员1)、F2RL1(凝血因子II(凝血酶)受体样1)、AKR1A1(醛酮还原酶家族1，成员A1(醛还原酶))、ALDH9A1(醛脱氢酶9家族，成员A1)、BGLAP(骨γ-羧谷氨酸(gla)蛋白)、MTTP(微粒体甘油三酯转移蛋白)、MTRR(5-甲基四氢叶酸-高半胱氨酸甲基转移酶还原酶)、SULT1A3(磺基转移酶家族，细胞溶质的，1A，酚优选，成员3)、RAGE(肾肿瘤抗原)、C4B(补体成分4B(奇都血型)、P2RY12(嘌呤能受体P2Y，G-蛋白偶联的，12)、RNLS(肾酶，FAD依赖性胺氧化酶)、CREB1(cAMP应答元件结合蛋白1)、POMC(阿黑皮素原)、RAC1(ras相关C3肉毒毒素底物1(rho家族，小GTP结合蛋白Rac1))、LMNA(核纤层蛋白NC)、CD59(CD59分子，补体调节蛋白)、SCN5A(钠通道，电压门控，V型，α亚基)、CYP1B1(细胞色素P450，家族1，亚家族B，多肽1)、MIF(巨噬细胞游走抑制因子(糖基化抑制因子))、MMP13(基质金属肽酶13(胶原酶3))、TIMP2(TIMP金属肽酶抑制剂2)、CYP19A1(细胞色素P450，家族19，亚家族A，多肽1)、CYP21A2(细胞色素P450，家族21，亚家族A，多肽2)、PTPN22(蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体型22(淋巴样))、MYH14(肌球蛋白，重链14，非肌肉)、MBL2(甘露糖结合凝集素(蛋白C)2，可溶性(调理素缺陷))、SELPLG(选择素P配体)、AOC3(胺氧化酶，含铜3(血管粘附蛋白1))、CTSL1(组织蛋白酶L1)、PCNA(增殖细胞核抗原)、IGF2(胰岛素样生长因子2(生长素调节素A))、ITGB1(整合素，β1(纤连蛋白受体，β多肽，抗原CD29包括MDF2，MSK12))、CAST(钙蛋白酶抑制蛋白)、CXCL12(趋化因子(C-X-C基序)配体12(基质细胞衍生因子1))、IGHE(免疫球蛋白恒定区ε)、KCNE1(电压门控钾通道，Isk相关家族，成员1)、TFRC(转铁蛋白受体(p90，CD71))、COL1A1(胶原，I型，α1)、COL1A2(胶原，I型，α2)、IL2RB(白细胞介素2受体，β)、PLA2G10(磷脂酶A2，型X)、ANGPT2(血管生成素2)、PROCR(蛋白C受体，内皮的(EPCR))、NOX4(NADPH氧化酶4)、HAMP(海帕西啶抗微生物肽)、PTPN11(蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体类型11)、SLC2A1(溶质载体家族2(易化葡萄糖转运蛋白)，成员1)、IL2RA(白细胞介素2受体，α)、CCL5(趋化因子(C-C基序)配体5)、IRF1(干扰素调节因子1)、CFLAR(CASP8和FADD样凋亡调节因子)、CALCA(降钙素相关多肽α)、EIF4E(真核翻译起始因子4E)、GSTP1(谷胱甘肽S-转移酶pi 1)、JAK2(Janus激酶2)、CYP3A5(细胞色素P450，家族3，亚家族A，多肽5)、HSPG2(类肝素硫酸蛋白聚糖2)、CCL3(趋化因子(C-C基序)配体3)、MYD88(髓性分化原发反应基因(88))、VIP(血管活性肠肽)、SOAT1(甾醇O-酰基转移酶1)、ADRBK1(肾上腺素能，β，受体激酶1)、NR4A2(细胞核受体亚家族4，型A，成员2)、MMP8(基质金属肽酶8(中性白细胞胶原酶))、NPR2(钠尿肽受体B/鸟苷酸环化酶B(心房钠尿肽受体B))、GCH1(GTP环化水解酶1)、EPRS(谷氨酰-脯氨酰-tRNA合成酶)、PPARGC1A(过氧化物酶体增殖物活化受体γ，共激活剂1α)、F12(凝血因子XII(哈格曼因子))、PECAM1(血小板/内皮细胞粘附分子)、CCL4(趋化因子(C-C基序)配体4)、SERPINA3(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制剂，进化枝A(α-1抗蛋白酶，抗胰蛋白酶)，成员3)、CASR(钙传感受体)、GJA5(间隙连接蛋白，α5，40kDa)、FABP2(脂肪酸结合蛋白2，肠)、TTF2(转录终止因子，RNA聚合酶II)、PROS1(蛋白S(α))、CTF1(心脏营养素1)、SGCB(肌聚糖，β(43kDa肌营养不良蛋白相关糖蛋白))、YME1L1(YME1样1(酿酒酵母))、CAMP(卡色力西丁抗微生物肽)、ZC3H12A(含锌指CCCH型12A)、AKR1B1(醛酮还原酶家族1，成员B1(醛糖还原酶))、DES(结蛋白)、MMP7(基质金属肽酶7(基质溶解因子，子宫的))、AHR(芳香烃受体)、CSF1(集落刺激因子1(巨噬细胞))、HDAC9(组蛋白去乙酰化酶9)、CTGF(结缔组织生长因子)、KCNMA1(大电导钙激活钾通道，亚家族M，α成员1)、UGT1A(UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A复合体座位)、PRKCA(蛋白激酶C，α)、COMT(儿茶酚-β-甲基转移酶)、S100B(S100钙结合蛋白B)、EGR1(早期生长反应蛋白1)、PRL(催乳素)、IL15(白细胞介素15)、DRD4(多巴胺受体D4)、CAMK2G(钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIγ)、SLC22A2(溶质载体家族22(有机阳离子转运蛋白)，成员2)、CCL11(趋化因子(C-C基序)配体11)、PGF(B321胎盘生长因子)、THPO(血小板生成素)、GP6(糖蛋白VI(血小板))、TACR1(速激肽受体1)、NTS(神经降压肽)、HNF1A(HNF1同源框A)、SST(生长抑素)、KCND1(电压门控钾通道，Shal相关亚家族，成员1)、LOC646627(磷脂酶抑制剂)、TBXAS1(血栓烷A合酶1(血小板))、CYP2J2(细胞色素P450，家族2，亚家族J，多肽2)、TBXA2R(血栓烷A2受体)、ADH1C(醇脱氢酶1C(I类)，γ多肽)、ALOX12(花生四烯酸盐12-脂氧合酶)、AHSG(α-2-HS-糖蛋白)、BHMT(甜菜碱同型半胱氨酸甲基转移酶)、GJA4(间隙连接蛋白，α4,37kDa)、SLC25A4(溶质载体家族25(线粒体载体；腺嘌呤核苷酸转运蛋白)，成员4)、ACLY(ATP柠檬酸裂合酶)、ALOX5AP(花生四烯酸盐5-脂氧合酶-活化蛋白)、NUMA1(核有丝分裂器蛋白1)、CYP27B1(细胞色素P450，家族27，亚家族B，多肽1)、CYSLTR2(半胱氨酰白三烯受体2)、SOD3(超氧化物歧化酶3，细胞外的)、LTC4S(白三烯C4合酶)、UCN(尿皮质素)、GHRL(胃促生长素/肥胖抑制素前体肽)、APOC2(载脂蛋白C-II)、CLEC4A(C型凝集素结构域家族4，成员A)、KBTBD10(Kelch重复和BTB(POZ)域包含蛋白)、TNC(腱生蛋白C)、TYMS(胸苷酸合成酶)、SHCl(SHC(含Src同源物2域)转化蛋白1)、LRP1(低密度脂蛋白受体相关蛋白1)、SOCS3(细胞因子信号传导抑制因子3)、ADH1B(醇脱氢酶1B(I类)，β多肽)、KLK3(激肽释放酶相关肽酶3)、HSD11B1(羟基固醇(11-β)脱氢酶1)、VKORC1(生素K环氧化物还原酶复合体，亚基1)、SERPINB2(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制剂，进化枝B(卵清蛋白)，成员2)、TNS1(张力蛋白1)、RNF19A(环指蛋白9A)、EPOR(促红细胞生成素受体)、ITGAM(整合素，αM(补体成分3受体3亚基))、PITX2(配对样同源域2)、MAPK7(丝裂原活化蛋白激酶7)、FCGR3A(IgG的Fc片段，低亲和力111a，受体(CD16a))、LEPR(瘦素受体)、ENG(内皮糖蛋白)、GPX1(谷胱甘肽过氧化酶1)、GOT2(谷草转氨酶2，线粒体(天冬氨酸氨基转移酶2))、HRH1(组胺受体H1)、NR112(细胞核受体亚家族1，型I，成员2)、CRH(促肾上腺皮质素释放激素)、HTR1A(5-羟色胺(血清素)受体1A)、VDAC1(电压依赖性阴离子通道1)、HPSE(类肝素酶)、SFTPD(表面活性蛋白D)、TAP2(转运蛋白2，ATP结合盒，亚家族B(MDR/TAP))、RNF123(环指蛋白123)、PTK2B(PTK2B蛋白酪氨酸激酶2β)、NTRK2(神经营养酪氨酸激酶，受体，2型)、IL6R(白细胞介素6受体)、ACHE(乙酰胆碱酯酶(Yt血型))、GLP1R(胰高血糖素样肽1受体)、GHR(生长激素受体)、GSR(谷胱甘肽还原酶)、NQO1(NAD(P)H脱氢酶，醌1)、NR5A1(细胞核受体亚家族5，型A，成员1)、GJB2(间隙连接蛋白，β2，26kDa)、SLC9A1(溶质载体家族9(钠/氢交换体)、成员1)、MAOA(单胺氧化酶A)、PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/科信9型)、FCGR2A(IgG的Fc片段，低亲和力IIa，受体(CD32))、SERPINF1(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制剂，进化枝F(α-2抗纤维蛋白溶酶，色素上皮衍生因子)，成员1)、EDN3(内皮素3)、DHFR(二氢叶酸还原酶)、GAS6(生长停滞特异蛋白6)、SMPD1(鞘磷脂磷酸二酯酶1，酸溶酶体)、UCP2(解偶联蛋白2(线粒体的，质子载体))、TFAP2A(转录因子AP-2α(激活增强子结合蛋白2α))、C4BPA(补体成分4结合蛋白，α)、SERPINF2(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制剂，进化枝F(α-2抗纤维蛋白溶酶，色素上皮衍生因子)，成员2)、TYMP(胸苛酸磷酸化酶)、ALPP(碱性磷酸酶，胎盘的(Regan同工酶))、CXCR2(趋化因子(C-X-C基序)受体2)、SLC39A3(溶质载体家族39(锌转运蛋白)、成员3)、ABCG2(ATP结合盒，亚家族G(WHITE)、成员2)、ADA(腺苷脱氨酶)、JAK3(Janus激酶3)、HSPA1A(热休克70kDa蛋白1A)、FASN(脂肪酸合酶)、FGF1(成纤维细胞生长因子1(酸性))、F11(凝血因子XI)、ATP7A(ATP酶，Cu++转运的，α多肽)、CR1(补体成分(3b/4b)受体1(Knops血型))、GFAP(胶质细胞原纤维酸性蛋白)、ROCK1(Rho相关，含卷曲螺旋蛋白激酶1)、MECP2(甲基CpG结合蛋白2(雷特综合征))、MYLK(肌球蛋白轻链激酶)、BCHE(丁酰胆碱酯酶)、LIPE(脂肪酶，激素敏感的)、PRDX5(过氧化物氧化还原酶5)、ADORA1(腺苷A1受体)、WRN(维尔纳综合征，RecQ解旋酶样)、CXCR3(趋化因子(C-X-C基序)受体3)、CD81(CD81分子)、SMAD7(SMAD家族成员7)、LAMC2(层粘连蛋白，γ2)、MAP3K5(丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶5)、CHGA(嗜铬粒蛋白A(甲状旁腺分泌蛋白1))、IAPP(胰岛淀粉样蛋白多肽)、RHO(视紫红质)、ENPP1(外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1)、PTHLH(甲状旁腺激素样激素)、NRG1(神经调节蛋白1)、VEGFC(血管内皮生长因子C)、ENPEP(谷氨酰基氨肽酶(氨基肽酶A))、CEBPB(CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)，β)、NAGLU(N-乙酰氨基葡糖苷酶，α-)、F2RL3(凝血因子II(凝血酶)受体样3)、CX3CL1(趋化因子(C-X3-C基序)配体1)、BDKRB1(缓激肽受体B1)、ADAMTS13(具有凝血酶敏感蛋白1型基序的ADAM金属肽酶，13)、ELANE(弹性蛋白酶，嗜中性粒细胞表达的)、ENPP2(外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2)、CISH(细胞因子诱导的含SH2的蛋白)、GAST(胃泌素)、MYOC(肌纤蛋白，小梁网可诱导糖皮质激素应答)、ATP1A2(ATP酶，Na+/K+转运的，α2多肽)、NF1(神经纤维瘤蛋白1)、GJB1(间隙连接蛋白，β1，32kDa)、MEF2A(肌细胞增强因子2A)、VCL(纽蛋白)、BMPR2(骨形态发生蛋白受体，II型(丝氨酸/苏氨酸激酶))、TUBB(微管蛋白，β)、CDC42(细胞分裂周期42(GTP结合蛋白，25kDa))、KRT18(角蛋白18)、HSF1(热休克转录因子1)、MYB(v-myb成髓细胞瘤病毒癌基因同源物(鸟类))、PRKAA2(蛋白激酶，AMP活化的，α2催化亚基)、ROCK2(Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶2)、TFPI(组织因子途径抑制物(脂蛋白相关凝血抑制剂))、PRKG1(蛋白激酶，cGMP依赖性，I型)、BMP2(骨形态发生蛋白2)、CTNND1(连环蛋白(钙粘着蛋白关联蛋白)，δ1)、CTH(胱硫醚酶(胱硫醚γ-裂解酶))、CTSS(组织蛋白酶S)、VAV2(vav 2鸟苷酸交换因子)、NPY2R(神经肽Y受体Y2)、IGFBP2(胰岛素样生长因子结合蛋白2，36kDa)、CD28(CD28分子)、GSTA1(谷胱甘肽S-转移酶α1)、PPIA(肽基脯氨酰异构酶A(亲环素A))、APOH(载脂蛋白H(β-2-糖蛋白I))、S100A8(S100钙结合蛋白A8)、IL11(白细胞介素11)、ALOX15(花生四烯酸盐15-脂氧合酶)、FBLN1(腓骨蛋白1)、NR1H3(细胞核受体亚家族1，型H，成员3)、SCD(硬脂酰基-辅酶A去饱和酶(Δ-9-去饱和酶))、GIP(抑胃多肽)、CHGB(嗜铬粒蛋白B(分泌粒蛋白1))、PRKCB(蛋白激酶C，β)、SRD5A1(类固醇-5-α还原酶α多肽1(3-氧代-5α-类固醇δ4-脱氢酶α1))、HSD11B2(羟基固醇(11-β)脱氢酶2)、CALCRL(降钙素受体样)、GALNT(UDP-N-乙酰基-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(GalNAc-T2))、ANGPTL4(血管生成素样4)、KCNN4(钾中间/小电导钙激活通道，亚家族N，成员4)、PIK3C2A(磷酸肌醇-3-激酶，2类，α多肽)、HBEGF(肝素结合EGF样生长因子)、CYP7A1(细胞色素P450，家族7，亚家族A，多肽1)、HLA-DRB5(主要组织相容性复合物，II类，DRβ5)、BNIP3(BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3)、GCKR(葡糖激酶(己糖激酶4)调节蛋白)、S100A12(S100钙结合蛋白A12)、PADI4(肽基精氨酸脱亚氨酶，IV型)、HSPA14(热休克70kDa蛋白14)、CXCR1(趋化因子(C-X-C基序)受体1)、H19(H19，母系印记表达转录物(非蛋白质编码))、KRTAP19-3(角蛋白关联蛋白19-3)、IDDM2(胰岛素依赖型糖尿病2)、RAC2(ras相关C3肉毒毒素底物2(rho家族，小GTP结合蛋白Rac2))、RYR1(兰尼碱受体1(骨骼))、CLOCK(clock同源物(小鼠))、NGFR(神经生长因子受体(TNFR超家族，成员16))、DBH(多巴胺β-羟化酶(多巴胺β-单加氧酶))、CHRNA4(胆碱能受体，烟碱的，α4)、CACNA1C(钙通道，电压依赖性，L型，α1C亚基)、PRKAG2(蛋白激酶，AMP激活的，γ2非催化亚基)、CHAT(胆碱乙酰转移酶)、PTGDS(前列腺素D2合酶21kDa(脑))、NR1H2(细胞核受体亚家族1，型H，成员2)、TEK(TEK酪氨酸激酶，内皮的)、VEGFB(血管内皮生长因子B)、MEF2C(肌细胞增强因子2C)、MAPKAPK2(丝裂原活化的蛋白激酶活化的蛋白激酶2)、TNFRSF11A(肿瘤坏死因子受体超家族，成员11a，NFKB激活剂)、HSPA9(热休克70kDa蛋白9(致死蛋白))、CYSLTR1(半胱胺酰白三烯受体1)、MAT1A(甲硫氨酸腺苷转移酶I，α)、OPRL1(阿片受体样1)、IMPA1(肌醇(肌肉)-1(或4)-单磷酸酶1)、CLCN2(氯通道2)、DLD(二氢硫辛酰胺脱氢酶)、PSMA6(蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，α型，6)、PSMB8(蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β型，8(大型多功能肽酶7))、CHI3L1(壳多糖酶3样1(软骨糖蛋白-39))、ALDH1B1(醛脱氢酶1家族，成员B1)、PARP2(聚(ADP-核糖)聚合酶2)、STAR(类固醇生成性急性期调节蛋白)、LBP(脂多糖结合蛋白)、ABCC6(ATP结合盒，亚家族C(CFTR/MRP)，成员6)、RGS2(G蛋白信号传导调节因子2，24kDa)、EFNB2(肝配蛋白-B2)、GJB6(间隙连接蛋白，β6，30kDa)、APOA2(载脂蛋白A-II)、AMPD1(腺苷单磷酸脱氨酶1)、DYSF(迪斯弗林(dysferlin)，肢带型肌营养不良2B(常染色体隐性))、FDFT1(法呢酰二磷酸酯法呢酰基转移酶1)、EDN2(内皮素2)、CCR6(趋化因子(C-C基序)受体6)、GJB3(间隙连接蛋白，β3，31kDa)、IL1RL1(白细胞介素1受体样1)、ENTPD1(外核苷三磷酸二磷酸水解酶1)、BBS4(巴-比二氏综合征(Bardet-Biedl syndrome)4)、CELSR2(钙粘着蛋白，EGF LAG七经G型受体2(火烈鸟同源物，果蝇))、F11R(F11受体)、RAPGEF3(Rap鸟苷酸交换因子(GEF)3)、HYAL1(透明质酸葡糖胺酶1)、ZNF259(锌指蛋白259)、ATOX1(ATX1抗氧化剂蛋白1同源物(酵母))、ATF6(活化转录因子6)、KHK(已酮糖激酶(果糖激酶))、SAT1(亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶1)、GGH(γ-谷氨酰水解酶(结合酶，叶酰聚γ谷氨酰水解酶))、TIMP4(TIMP金属肽酶抑制剂4)、SLC4A4(溶质载体家族4，碳酸氢钠协同转运蛋白，成员4)、PDE2A(磷酸二酯酶2A，cGMP刺激的)、PDE3B(磷酸二酯酶3B，cGMP抑制的)、FADS1(脂肪酸去饱和酶1)、FADS2(脂肪酸去饱和酶2)、TMSB4X(胸腺素β4，X连锁的)、TXNIP(硫氧还蛋白相互作用蛋白)、LIMS1(LIM和衰老细胞抗原样域1)、RHOB(ras同源物基因家族，成员B)、LY96(淋巴细胞抗原96)、FOXO1(叉头框O1)、PNPLA2(含Patatin样磷脂酶域2)、TRH(促甲状腺激素释放激素)、GJC1(间隙连接蛋白，γ1，45kDa)、SLC17A5(溶质载体家族17(阴离子/糖转运蛋白)，成员5)、FTO(脂肪量和肥胖相关)、GJD2(间隙连接蛋白，δ2，36kDa)、PSRC1(富含脯氨酸/丝氨酸卷曲螺旋蛋白1)、CASP12(半胱天冬酶12(基因/假基因))、GPBAR1(G蛋白耦联胆汁酸受体1)、PXK(含PX域丝氨酸/苏氨酸激酶)、IL33(白细胞介素33)、TRIB1(tribbles同源物1(果蝇))、PBX4(前B细胞白血病同源框4)、NUPR1(核蛋白，转录调节子，1)、15-Sep(15kDa硒蛋白)、CILP2(软骨中间层蛋白2)、TERC(端粒酶RNA组分)、GGT2(γ-谷氨酰转肽酶2)、MT-CO1(线粒体编码细胞色素c氧化酶I)、以及UOX(尿酸氧化酶，假基因)。

在另一个实施例中，该染色体序列可以进一步选自Pon1(对氧磷酶1)、LDLR(LDL受体)、ApoE(载脂蛋白E)、Apo B-100(载脂蛋白B-100)、ApoA(载脂蛋白(a))、ApoA1(载脂蛋白A1)、CBS(胱硫醚(Cystathione)B-合酶)、糖蛋白IIb/IIb、MTHRF(5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(NADPH)、及其组合。在一次迭代中，这些染色体序列和由涉及心血管疾病的染色体序列编码的蛋白质可以选自Cacna1C、Sod1、Pten、Ppar(α)、Apo E、瘦素、及其组合。

肺

本发明还考虑了向一个或两个肺递送该CRISPR-Cas系统。

虽然基于AAV-2的载体最初被提议用于向CF气道的CFTR递送，但其他血清型如AAV-1、AAV-5、AAV-6、和AAV-9在肺上皮细胞的多种模型中也展示出提高的基因转移效率(参见，例如，李(Li)等人，《分子治疗》(Molecular Therapy)，第17卷，第12期，2067-2077，2009年12月)。在体外转导人气道上皮细胞上，AAV-1被证明比AAV-2和AAV-5更有效约100倍，虽然AAV-1体内转导的鼠类气管气道上皮具有与AAV-5相等的效率。其他研究已经表明，在针对体外人气道上皮(HAE)的基因递送上，AAV-5比AAV-2更有效50倍，并且在体内小鼠肺气道上皮中显著更有效。还已经表明，在体外人气道上皮细胞中以及在体内鼠类气道中，AAV-6比AAV-2更有效。8更为近期的分离物，AAV-9，显示出在体内鼠类鼻和肺泡上皮中展示了比AAV-5更好的基因转移效率，其中检测出基因表达持续超过9个月，表明AAV可使得体内长期基因表达成为可能，这是对于CFTR基因递送载体而言的理想特性。此外，证明了AAV-9可以被再次给予至鼠类的肺部，而不丧失CFTR表达并且具有最低限度的免疫后果。可以在CF和非CF HAE培养物的顶面用100μl的AAV载体接种，维持数小时(参见，例如，李(Li)等人，《分子治疗》(Molecular Therapy)，第17卷，第12期，2067-2077，2009年12月)。MOI可以从1×10³到4×10⁵个载体基因组/细胞而变化，这取决于病毒浓度和这些实验的目的。以上引用的载体被考虑用于本发明的递送和/或给药。

萨莫拉(Zamora)等人(《美国呼吸道与危重护理学杂志》(Am J Respir Crit CareMed)第183卷，第531-538页，2011年)报道了针对人类感染性疾病治疗的RNA干扰治疗法的应用以及抗病毒药物在呼吸道合胞病毒(RSV)感染的肺移植受体中的随机试验。萨莫拉(Zamora)等人进行了一项在具有RSV呼吸道感染的LTX受体中的随机化、双盲、安慰剂对照的试验。容许患者接受针对RSV的护理标准。每天给予雾化的ALN-RSV01(0.6mg/kg)或安慰剂，持续3天。这项研究证明，可以安全地向具有RSV感染的LTX受体给予靶向RSV的RNAi治疗剂。ALN-RSV01的三个每日剂量并不导致任何呼吸道症状的恶化或肺功能的损害，并且未展示任何出全身性致炎作用，如细胞因子或CRP的诱导。在吸入之后，药代动力学仅仅显示出低的短暂的全身性暴露，与临床前动物数据一致，表明静脉内或通过吸入给予的ALN-RSV01通过外切核酸酶介导的消化和肾脏排泄而从循环中迅速清除。萨莫拉(Zamora)等人的方法可以应用于本发明的CRISPR Cas系统，并且雾化的CRISPR Cas，例如以0.6mg/kg的剂量，可以被考虑用于本发明。

CFTRδ508嵌合指导RNA已经用于使用腺相关病毒(AAV)粒子将CRISPR-Cas系统在对其有需要的受试者或患者的气道中进行基因转移或基因递送，所述受试者或患者患有囊性纤维化或囊性纤维化(CF)相关症状。这种修复策略示例了针对囊性纤维化δF508突变的用途。这种策略类型可应用于所有生物。特别提到CF，适合的患者可以包括：人类、非人类灵长动物、犬、猫、牛、马和其他家养动物。申请人利用包含Cas9酶的CRISPR-Cas系统来靶向δF508或其他CFTR诱导的突变。

在这种情况下，这些经治疗的受试者的每一侧肺接受支气管内递送的药学上有效量的雾化AAV载体系统，同时自然地呼吸。像这样，通常对于AAV递送而言，雾化递送是优选的。腺病毒或AAV粒子可以用于递送。每一者都可操作地连接至一个或多个调节序列上的适合的基因构建体可以被克隆到递送载体中。在这种情况下，提供下列构建体作为实例：用于Cas9的Cbh或EF1a启动子、用于嵌合指导RNA的U6或H1启动子。一种优选的安排是使用靶向嵌合指导物的CFTRδ508、用于δF508突变的修复模板以及密码子优化的Cas9酶(优选的Cas9是具有核酸酶或切口酶活性的那些)，所述酶具有任选地一个或多个核定位信号或序列(NLS)，例如，两个(2)NLS。还设想了没有NLS的构建体。

为了鉴定该Cas9靶位点，申请人分析了人CFTR基因组座位并且鉴定了该Cas9靶位点。优选地，一般而言并且在这种CF的情况下，该PAM可以含有NGG或NNAGAAW基序。

因此，在CF的情况下，本发明方法包括操纵感兴趣的基因组座位中的靶序列，包括递送包含病毒载体系统的非天然存在的或工程化的组合物，该载体系统包含一种或多种病毒载体，该一种或多种病毒载体可操作地编码用于其表达的组合物，其中该非天然存在的或工程化的组合物包括：

非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，这一种或多种载体包含

I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到CRISPR-Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含

(a)指导序列，该指导序列能够杂交到适合的哺乳动物细胞中的CF靶序列上，

(b)tracr配对序列，和

(c)tracr序列，以及

II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列上，该CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列，

其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，

其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶。就CF而言，优选的靶DNA序列包含该CFTRδ508突变。上文描述了优选的PAM。优选的CRISPR酶是任何Cas。对于CF的替代物包括任何基因缺陷并且这些实例是众所周知的。本发明的另一个优选方法或用途是用于校正EMP2A和EMP2B基因的缺陷，这些基因已经被鉴定为与拉福拉病(Lafora disease)相关。

在一些实施例中，“指导序列”可以与“指导RNA”不同。指导序列可以是指在该指导RNA内的大约20bp的序列，其指定该靶位点。在一些实施例中，该Cas9是(或衍生自)SpCas9。在这样的实施例中，优选的突变是在SpCas9的任何或所有的10、762、840、854、863和/或986位置或在其他Cas9的相应位置(其可以例如通过标准序列比较工具进行确定)。具体地说，在SpCas9中的任何或所有下列突变是优选的：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和/或D986A；并且还设想了这些置换氨基酸中的任何的保守性取代。在其他Cas9中的相应位置处的相同取代(或这些突变的保守性取代)也是优选的。特别优选的是在SpCas9中的D10和H840。然而，在其他Cas9中，相应于SpCas9D10和H840的残基也是优选的。这些是有利的，因为它们提供了切口酶活性。这样的突变可以应用于本发明的所有方面，不仅是治疗CF。施万克(Schwank)等人(《细胞—干细胞》(Cell Stem Cell)，13:653-58,2013)使用了CRISPR/Cas9来校正在人类干细胞中的与囊性纤维化相关联的缺陷。该研究组的目标是离子通道囊性纤维化跨膜传导受体(CFTR)的基因。在CFTR中的缺失引起该蛋白质在囊性纤维化患者中的错误折叠。使用从患有囊性纤维化的两个儿童的细胞样品中发育而来的培养的肠干细胞，施万克(Schwank)等人能够利用CRISPR连同含有有待插入的修补序列的供体质粒来校正该缺陷。然后这些研究者使这些细胞生长成肠“类器官”或微型肠，并且显示它们正常地起作用。在这种情况下，约一半的克隆类器官经历正确的基因校正。

肌肉

本发明还考虑了向肌肉递送该CRISPR-Cas系统。

Bortolanza等人(《分子治疗》(Molecular Therapy)第19卷，第11期，2055-2064，2011年11月)表明，在面肩肱型肌营养不良(FSHD)发作之后的FRG1小鼠中，干扰RNA表达盒的全身性递送导致剂量依赖性长期FRG1敲低，而没有毒性征象。博尔托兰扎(Bortolanza)等人发现，单次静脉内注射5×10¹²vg的rAAV6-sh1FRG1挽救了FRG1小鼠的肌肉组织病理学和肌肉功能。详细而言，使用一个25号的泰尔茂(Terumo)注射器将200μl的含有2×10¹²或5×10¹²vg的在生理溶液中的载体注射到尾静脉中。Bortolanza等人的方法可以应用于表达CRISPR>15或2×10¹⁶vg载体的剂量注射到人体内。

Dumonceaux等人(《分子治疗》(Molecular Therapy)第18卷，第5期，881-887，2010年5月)使用针对肌肉生长抑制素受体AcvRIIb mRNA(sh-AcvRIIb)的RNA干扰技术抑制了肌肉生长抑制素途径。由矢量化(vectorized)U7外显子跳跃技术(U7-DYS)介导准肌营养不良蛋白(quasi-dystrophin)的恢复。将携带单独的sh-AcvrIIb构建体、单独的U7-DYS构建体、或这两种构建体的组合的腺相关载体注射到营养不良mdx小鼠的胫骨前肌(TA)肌肉中。以10¹¹个AAV病毒基因组进行注射。杜蒙赛奥斯(Dumonceaux)等人的方法可以应用于表达CRISPR>14到10¹⁵vg载体的剂量注射到人体内。

木内(Kinouchi)等人(《基因治疗》(Gene Therapy)(2008)15，1126-1130)报道了通过未经化学修饰的siRNA与缺端胶原(ATCOL)的纳米粒子形成的到正常或患病小鼠骨骼肌的体内siRNA递送的有效性。靶向肌肉生长抑制素(一种骨骼肌生长的负调节剂)的siRNA的ATCOL介导的在小鼠骨骼肌中的局部应用或者经由静脉内在应用之后几周之内引起肌肉质量的显著增加。这些结果暗示siRNA的ATCOL介导的应用是一种强大的用于包括肌肉萎缩在内的疾病的未来治疗用途的工具。根据制造商的说明，将Mst-siRNA(终浓度，10mM)与ATCOL(对于局部给药的终浓度，0.5％)(AteloGene，高研株式会社(Kohken)，东京，日本)混合。在通过戊巴比妥钠(25mg/kg，腹膜内注射)麻醉小鼠(20周大，雄性C57BL/6)之后，将Mst-siRNA/ATCOL复合物注射到咬肌和股二头肌中。木内(Kinouchi)等人的方法可以应用于CRISPR Cas，并且例如将其以40μM溶液的约500到1000ml的剂量注射到人体内。

哈格斯特龙(Hagstrom)等人(《分子治疗》(Molecular Therapy)第10卷，第2期，2004年8月)描述了一种使得能够将核酸有效且可重复地递送到遍及哺乳动物四肢肌肉的肌细胞(肌纤维)的血管内、非病毒方法。该程序涉及注射裸质粒DNA或siRNA到暂时由止血带或血压袖带分离的肢体的远端静脉中。通过以足够的体积将其迅速注射，促进了向肌纤维的核酸递送，使得该核酸溶液能够溢出到肌肉组织中。在小动物和大动物中都以最低毒性实现了在骨骼肌中的高水平转基因表达。还获得了向四肢肌肉递送siRNA的证据。为了将质粒DNA静脉注射到恒河猴中，将一个三通旋塞连接到各自加载有单个注射器的两个注射器泵(型号PHD 2000；哈佛仪器公司(Harvard Instruments))上。在罂粟碱注射五分钟之后，以1.7或2.0ml/s的速率注射pDNA(15.5到25.7mg，在40-100ml盐水中)。对于本发明的表达CRISPR Cas的质粒DNA，这可以按比例增加，对于人类，注射在800到2000ml盐水中的约300到500mg。对于到大鼠中的腺病毒载体注射，注射在3ml的生理盐水溶液中的(NSS)2x10⁹个感染粒子。对于本发明的表达CRISPR Cas的腺病毒载体，这可以按比例增加，对于人类，注射在10升NSS中的约1x>13个感染粒子。对于siRNA，以12.5μg的siRNA注射到大鼠的大隐静脉中，并且以750μg的siRNA注射到灵长动物的大隐静脉中。对于本发明的CRISPRCas，这可以按比例增加，例如，向人的大隐静脉注射约15到约50mg。

皮肤

本发明还考虑了向皮肤递送该CRISPR-Cas系统。希克森(Hickerson)等人(《分子治疗—核酸》(Molecular Therapy—Nucleic Acids)(2013)2，e129)涉及一种用于向人类和鼠类皮肤递送自我递送(sd)-siRNA的机动化的微针阵列皮肤递送装置。将基于siRNA的皮肤治疗剂转化到临床的主要挑战是有效递送系统的开发。在多种皮肤递送技术中已经投入了实质性的努力，但是成功有限。在其中用siRNA治疗皮肤的临床研究中，与皮下针注射相关的剧烈疼痛预先排除了试验中额外患者的纳入，这凸显了对于改进的、更为“患者友好的”(即，很少或没有疼痛)递送方法的需要。微针代表行包括siRNA在内的大的带电负荷物跨越一级屏障、角质层进行递送的有效途径，并且通常被认为比常规皮下针疼痛更少。机动化的“冲压型”微针装置，包括由希克森(Hickerson)等人使用的机动化的微针阵列(MMNA)装置，已经显示在无毛小鼠研究中是安全的并且引起很少的或没有疼痛，其证据为：(i)在美容业中广泛使用以及(ii)其中几乎所有志愿者发现使用该装置比流感疫苗针剂(flushot)疼痛少得多的有限测试，表明使用这种装置的siRNA递送将产生比使用皮下针注射的先前临床试验中所体验的少得多的疼痛。该MMNA装置(作为Triple-M或Tri-M由韩国首尔的Bomtech电子有限公司在市场上销售)适用于将siRNA递送到小鼠和人类皮肤。将sd-siRNA溶液(高达300μl的0.1mg/ml RNA)引入被设定为0.1mm深度的一次性Tri-M针盒(Bomtech)的腔室中。为了处理皮肤，在处理之前将未鉴定的皮肤(在外科手术之后立即获得)手动拉伸并且钉在软木平台上。使用具有28号0.5英寸针头的胰岛素注射器进行所有皮内注射。该MMNA装置和希克森(Hickerson)等人的方法可以用于和/或适用于，例如，以高达300μl的0.1mg/ml CRISPR Cas的剂量向皮肤递送本发明的CRISPR>

里奇曼(Leachman)等人(《分子治疗》(Molecular Therapy)，第18卷，第2期，442-446，2010年2月)涉及利用基于针对皮肤的第一短干扰RNA(siRNA)的治疗剂用于治疗罕见的皮肤病症先天性厚甲(PC)的Ib期临床试验，先天性厚甲为一种常染色体显性综合征，其包括致残性的掌跖角化病。这种siRNA，称为TD101，特异性地并且有力地靶向角蛋白6a(K6a)N171K突变体mRNA，而不影响野生型K6a mRNA。剂量递增计划提出如下：

最初，向对称的胼胝给予0.1ml的TD101或单独的载体(没有钙或镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水)的1.0mg/ml溶液。完成六个渐增的剂量体积，对于增加没有不良反应：每次注射0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、和2.0ml的1.0mg/ml TD101溶液。由于最高计划体积(2.0ml)被良好耐受，然后每周将TD101的浓度从1mg/ml增加到8.5mg/ml的终浓度。对于给予特异性地并且有力地靶向角蛋白6a(K6a)N171K突变体mRNA的CRISPR Cas考虑了相似的剂量。

郑(Zheng)等人(PNAS，7月24日，2012年，第109卷，第30期，11975-11980)表明，球形核酸纳米粒子结合物(SNA-NC)，由高度定向的、共价固定的siRNA的致密壳围绕的金核，在应用之后数小时之内在体外自由地穿透几乎100％的角化细胞、小鼠皮肤、以及人表皮。郑(Zheng)等人证明，在人类皮肤中单次应用25nM的表皮生长因子受体(EGFR)SNA-NC持续60小时显示出有效的基因敲低。对于向皮肤给予固定在SNA-NC中的CRISPR Cas可以考虑了相似的剂量。

核酸、氨基酸和蛋白质、调节序列、载体等

核酸、氨基酸和蛋白质：本发明使用核酸结合靶DNA序列。这是有利的，因为产生核酸比产生蛋白质容易且价廉得多，并且特异性可以根据其中寻求同源性的拉伸长度而变化。例如多指的复杂3-D复杂定位是不需要的。术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换地使用。它们是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连接分析定义的多个座位(一个座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。该术语还涵盖具有合成骨架的核酸样结构，参见，例如，埃克斯坦(Eckstein)，1991；巴塞加(Baserga)等人，1992；米利根(Milligan)，1993；WO 97/03211；WO 96/39154；马塔(Mata)，1997；施特劳斯-绍库普(Strauss-Soukup)，1997；和扎姆斯塔(Samstag)，1996。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。如本文所用的术语“野生型”是本领域技术人员所理解的术语，并且表示生物、菌株、基因的典型形式或者当它在自然界存在时区别于突变体或变体形式的特征。“野生型”可以是基线。如本文所用的术语“变体”应当被理解为表示具有衍生自在自然界中存在的模式的性质的展示。术语“非天然存在的”或“工程化的”可互换地使用并且表面人工的参与。这些术语，当指核酸分子或多肽时，表示该核酸分子或多肽至少基本上从它们在自然界中或如发现于自然界中的与其结合的至少另一种组分游离出来。“互补性”是指核酸与另一个核酸序列借助于传统的沃森-克里克碱基配对或其他非传统类型形成一个或多个氢键的能力。互补百分比表示一个核酸分子中可与一个第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个之中有5、6、7、8、9、10个即为50％、60％、70％、80％、90％、和100％互补)。“完全互补”表示一个核酸序列的所有连续残基与一个第二核酸序列中的相同数目的连续残基形成氢键。如本文使用的“基本上互补”是指在一个具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的互补程度，或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。如本文使用的对于杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的一个核酸主要地与该靶序列杂交并且基本上不杂交到非靶序列上的条件。严格条件通常是序列依赖性的，并且取决于许多因素而变化。一般而言，该序列越长，则该序列特异性地杂交到其靶序列上的温度就越高。严格条件的非限制性实例描述于蒂森(Tijssen)(1993)的《生物化学和分子生物学中的实验室技术-核酸探针杂交》(LaboratoryTechniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With NucleicAcid Probes)，第I部分，第二章，“杂交原理概述和核酸探针分析策略”(“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”)，爱思唯尔(Elsevier)，纽约。在提及一个多核苷酸序列时，那么也设想了互补的或部分互补的序列。能够在高严格条件下杂交到参考序列上的这些序列是优选的。通常，为了使杂交率最大化，选择了相对低严格性的杂交条件：低于热熔点(T_m)约20℃到25℃。T_m是50％的特异性靶序列在具有规定的离子强度和pH的溶液中杂交到完全互补的探针上的温度。通常，为了要求杂交序列的至少约85％的核苷酸互补性，高严格洗涤条件被选择为低于T_m约5℃到15℃。为了要求杂交序列的至少约70％的核苷酸互补性，中等严格洗涤条件被选择为低于T_m约15℃到30℃。高容许(极低严格性)洗涤条件可以低至在T_m之下50℃，从而允许在杂交序列之间的高水平错配。本领域技术人员将认识到，在杂交和洗涤阶段中的其他物理和化学参数也可以改变，从而影响来自在靶序列与探针序列之间的特定同源性水平的可检测杂交信号的结果。优选的高严格条件包括在50％甲酰胺、5×SSC、和1％SDS中在42℃孵育，或者在5×SSC和1％SDS中在65℃孵育，在0.2×SSC和0.1％SDS中在65℃洗涤。“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应形成一种复合物的反应，该复合物经由这些核苷酸残基之间的碱基的氢键键合而稳定化。氢键键合可以借助于沃森-克里克碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式而发生。该复合物可包含形成一个双链体的两条链、形成多链复合物的三条或多条链、单个自我杂交链、或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛的过程(如PCR的开始、或经由一种酶的多核苷酸的切割)中的步骤。能够与给定序列杂交的序列被称为该给定序列的“互补物”。如本文使用的，术语“基因组座位(locus)”或“座位(locus)”(复数是座位(loci))是在染色体上的基因或DNA序列的特定位置。“基因”是指编码多肽或RNA链的DNA或RNA的段(stretch)，其在生物中发挥功能作用并且因此是活生物体遗传的分子单元。出于本发明的目的，可以考虑包括调节基因产物的产生的区域的基因，而不论这样的调节序列是否接近编码和/或转录的序列。因此，基因包括而不必限于，启动子序列、终止子、翻译调节序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、隔离子、边界元件、复制起点、核基质附着位点和座位控制区。如本文使用的“基因组座位的表达”或“基因表达”是藉此在功能性基因产物的合成中使用来自基因的信息的过程。基因表达的产物常常是蛋白质，但是在非蛋白质编码基因如rRNA基因或tRNA基因中，产物是功能性RNA。基因表达的过程由所有已知的生物利用-产生功能性产物以便存活的真核生物(包括多细胞生物)、原核生物(细菌和古细菌)以及病毒。如本文使用的基因或核酸的“表达”不仅涵盖细胞基因表达，而且涵盖在克隆系统中或在任何其他背景下的一个或多个核酸的转录和翻译。如本文使用的“表达”是指藉此从DNA模板转录成多核苷酸(如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后藉此翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以总称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换地使用，是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物；这些修饰例如二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵，如与标记组分的结合。如本文使用的术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。如本文使用的，术语“结构域”或“蛋白质结构域”是指可以独立于该蛋白质链的其余部分而存在并且起作用的蛋白质序列的一部分。正如在本发明的多个方面中所描述，序列一致性与序列同源性有关。可以通过肉眼、更通常地借助于可得的序列比较程序来进行同源性比较。这些可商购的计算机程序可以计算在两个或更多个序列之间的同源性的百分比(％)并且还可以计算由两个或更多个氨基酸或核酸序列共享的序列一致性。在一些优选的实施例中，本文描述的dTALE的封端区具有与本文提供的封端区氨基酸序列至少95％一致性或共享一致性的序列。可以通过本领域已知的许多计算机程序(例如BLAST或FASTA等等)来生成序列同源性。用于进行这样的比对的适合的计算机程序是GCG威斯康星Bestfit软件包(美国威斯康星大学；德弗罗(Devereux)等人，1984，《核酸研究》(Nucleic>TM(日立软件公司(Hitachi>

本发明的实施例包括可包含同源取代(本文使用取代和置换两者来表示现有氨基酸残基或核苷酸与替代残基和核苷酸之间的互换)的序列(多核苷酸或多肽两者)，该同源取代，即，在氨基酸的情况下发生同类取代(like-for-like substitution)，如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性。也可以发生非同源取代，即，从一类残基到另一类残基，或者可替代地涉及包含非天然氨基酸如鸟氨酸(在下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(在下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(在下文称为O)、吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。变体氨基酸序列可以包括适合的可插入在该序列的任何两个氨基酸残基之间的间隔基团，包括除了氨基酸间隔物(如甘氨酸或β-丙氨酸)之外的烷基基团，如甲基、乙基或丙基基团。一个另外的变化形式，其涉及处于类肽形式的一个或多个氨基酸残基的存在，也是本领域技术人员熟知的。为避免疑义，“该类肽形式”用来指代变体氨基酸残基，其中该α-碳取代基在该残基的氮原子上，而不是在该α-碳上。用于制备处于该类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如西蒙RJ(Simon RJ)等人，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和豪威尔DC(Horwell DC)，《生物技术趋势》(Trends Biotechnol.)(1995)13(4)，132-134。

出于本发明的目的，扩增意指利用引物和聚合酶的能够以合理的保真度复制靶序列的任何方法。可以通过天然或重组DNA聚合酶，如TaqGold^TM、T7DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段以及逆转录酶进行扩增。一种优选的扩增方法是PCR。

在某些方面，本发明涉及载体。如本文使用的，“载体”是一种允许或促进一个实体从一个环境转移到另一个环境中的工具。它是一种复制子，如质粒、噬菌体、或粘粒，另一个DNA片段可以插入其中，从而引起该插入的片段的复制。通常，当与适当的控制元件关联时，一种载体能够复制。一般而言，术语“载体”是指一种核酸分子，其能够运送与其连接的另一种核酸分子。载体包括但不限于，单链、双链、或部分双链的核酸分子；包括一个或多个自由端、无自由端(例如环状的)的核酸分子；包括DNA、RNA、或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多样的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以例如通过标准分子克隆技术插入另外的DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于用于包装病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒、以及腺相关病毒(AAV))的载体中。病毒载体还包含由用于转染到一种宿主细胞中的病毒携带的多核苷酸。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到该宿主细胞的基因组中，并且由此与该宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。这样的载体在此被称为“表达载体”。在重组DNA技术中使用的普通表达栽体通常是质粒形式。

重组表达载体可包含处于适合于在宿主细胞中的核酸表达的形式的本发明的核酸，这意味着这些重组表达载体包含基于待用于表达的宿主细胞而选择的一种或多种调节元件，所述调节元件可操作地连接至待表达的核酸序列。在重组表达载体内，“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调节元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。关于重组和克隆方法，提及2004年9月2日以US 2004-0171156 A1公开的美国专利申请10/815,730，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。

本发明的多个方面涉及用于嵌合的RNA与Cas9的双顺反子载体。用于嵌合的RNA与Cas9的双顺反子表达载体是优选的。一般而言并且特别地，在这个实施例中，Cas9优选由CBh启动子驱动。嵌合RNA可以优选地由Pol III启动子(如U6启动子)驱动。理想地，将这两者结合。嵌合的指导RNA典型地由20bp指导序列(N)组成并且这可以接合到tracr序列上(从下链的第一个“U”到该转录物的结尾)。该tracr序列可以在如指示的不同位置被截短。指导序列和tracr序列被该tracr配对序列隔开，该tracr配对序列可以是GUUUUAGAGCUA。这之后可以是如所示的环序列GAAA。这两者都是优选的实例。申请人已经通过SURVEYOR测定证明了在人EMX1和PVALB座位处的Cas9介导的indel。ChiRNA由其“+n”标志指示，并且crRNA是指指导序列和tracr序列被表达为分开的转录物的杂交体RNA。贯穿本申请，嵌合RNA也可以被称为单指导、或合成指导RNA(sgRNA)。该环优选地是GAAA，但是并并限于这个序列或者实际上在长度上仅仅为4bp。实际上，用于在发夹结构中使用的优选环形成序列在长度上为四个核苷酸，并且最优选地具有序列GAAA。然而，可以使用更长或更短的环序列，正如可替代的序列。这些序列优选地包括三联体(例如，AAA)、和另外的核苷酸(例如C或G)。环形成序列的实例包括CAAA和AAAG。在实践在此披露的任何方法中，可以经由本领域已知的一种或多种方法将适合的载体引入进细胞或胚胎中，这些方法包括但不限于，显微注射、电穿孔、声致穿孔、基因枪、磷酸钙介导的转染、阳离子转染、脂质体转染、树枝状聚合物转染、热休克转染、核转染、磁转染、脂转染、刺穿转染(impalefection)、光学转染、专有剂增强的核酸摄取以及经由脂质体、免疫脂质体、病毒颗粒或人工病毒体进行递送。在一些方法中，通过显微注射将该载体引入进胚胎中。可以将这个或这些载体显微注射进胚胎的细胞核或细胞质中。在一些方法中，通过核转染将这个或这些载体引入进细胞中。

术语“调节元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。这样的调节序列例如描述于戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(1990)中。调节元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。调节元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在一些实施例中，一个载体包含一个或多个pol III启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个pol III启动子)、一个或多个pol II启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个pol II启动子)、一个或多个pol I启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个pol I启动子)、或其组合。pol III启动子的实例包括但不限于U6和H1启动子。pol II启动子的实例包括但不限于逆转录劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见，例如，波沙特(Boshart)等人，《细胞》(Cell)41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子以及EF1α启动子。还被术语“调节元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。载体可以被引入到宿主细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的核酸编码的融合蛋白或肽(例如，成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)转录物、蛋白质、酶、其突变体形式、其融合蛋白，等等)。关于调节序列，提及美国专利申请10/491,026，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。关于启动子，提及PCT公开WO 2011/028929和美国申请12/511,940，这些专利的内容通过引用以其全文并入本文。

载体可以被设计为用于在原核或真核细胞中表达CRISPR转录物(例如核酸转录物、蛋白质、或酶)。例如，CRISPR转录物可表达于例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞、或哺乳动物细胞中。适合的宿主细胞进一步讨论于Goeddel(戈德尔)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS INENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(Calif.)(1990年)中。可替代地，重组表达载体可在体外例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶来转录和翻译。

载体可以被引入原核生物或原核细胞中并且在其中增殖。在一些实施例中，原核生物用来扩增有待引入真核细胞中的载体的多个拷贝，或者作为有待引入真核细胞中的载体的产生中的中间载体(例如，扩增质粒作为病毒载体包装系统的一部分)。在一些实施例中，原核生物用来扩增一个载体的多个拷贝并且表达一种或多种核酸，如提供用于递送到宿主细胞或宿主生物中的一种或多种蛋白质的来源。蛋白质在原核生物中的表达最经常在大肠杆菌中用含有指导融合或非融合蛋白的表达的组成型或诱导型启动子的载体来进行。融合载体将多个氨基酸添加到在其中编码的蛋白质上，如该重组蛋白的氨基端上。这样的融合载体可以用于一个或多个目的，如：(i)增加重组蛋白的表达；(ii)增加重组蛋白的溶解性；以及(iii)通过在亲和纯化中充当配体来辅助重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体中，将蛋白切割位点引入至融合部分与重组蛋白的接合处以使得能够在纯化融合蛋白之后将重组蛋白与融合部分分离。这类酶以及它们的同源识别序列包括因子Xa、凝血酶以及肠激酶。示例性融合表达载体包括pGEX(发玛西亚生物技术有限公司(Pharmacia BiotechInc)；史密斯和约翰逊，1988.《基因》(Gene)67:31-40)、pMAL(纽英伦生物技术公司(NewEngland Biolabs)，贝弗利(Beverly)，马萨诸塞州(Mass.))以及pRIT5(发玛西亚公司，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州(N.J.))，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合至靶重组蛋白。适合的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amrann(阿姆兰)等人，(1988年)《基因》(Gene)69:301-315)以及pET 11d(Studier(斯图迪尔)等人，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS INENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(Calif.)(1990年)60-89。在一些实施例中，载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒中表达的载体的实例包括pYepSec1(巴尔戴利(Baldari)等人，1987，《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J)6:229-234)、pMFa(库尔坚(Kurjan)和赫斯库伍特兹(Herskowitz)，1982，《细胞》(Cell)30:933-943)、pJRY88(舒尔茨(Schultz)等人，1987，《基因》(Gene)54:113-123)、pYES2(英杰公司(Invitrogen Corporation)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(Calif))、以及picZ(英杰公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)。在一些实施例中，使用杆状病毒载体，载体驱动昆虫细胞中的蛋白质表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如，SF9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(史密斯(Smith)等人，1983，《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)3:2156-2165)和pVL系列(拉克瑙(Lucklow)和萨莫斯(Summers)，1989，《病毒学》(Virology)170:31-39)。

在一些实施例中，使用哺乳动物表达载体，载体能够驱动一种或多种序列在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(锡德(Seed)，1987，《自然》(Nature)329:840)和pMT2PC(考夫曼(Kaufman)等人，1987，《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)6:187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能典型地由一种或多种调节元件提供。例如，常用的启动子来源于多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒、猿猴病毒40、以及本文所述和本领域已知的其他病毒。对于用于原核细胞和真核细胞两者的其他适合的表达系统参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人的《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：A LaboratoryManual.)(第2版)的第16和第17章，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约，1989。

在一些实施例中，重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异型调节元件来表达核酸)。组织特异型调节元件是本领域中已知的。适合的组织特异型启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝脏特异性的；平克特(Pinkert)等人，1987.《基因发育》(Genes Dev.)1:268-277)，淋巴特异性启动子(卡里曼(Calame)和伊顿(Eaton)，1988.《免疫学进展》(Adv.Immunol)43:235-275)，特别是T细胞受体的启动子(维纳图(Winoto)和巴尔迪莫(Baltimore)，1989.《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)8:729-733)和免疫球蛋白(巴纳吉(Baneiji)等人，1983.《细胞》(Cell)33:729-740；奎恩(Queen)和巴尔迪莫(Baltimore)，1983.《细胞》(Cell)33:741-748)，神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；伯恩(Byrne)和鲁德尔(Ruddle)，1989.《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci USA)86:5473-5477)，胰腺特异性启动子(艾德兰德(Edlund)等人，1985.《科学》(Science)230:912-916)，以及乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。还涵盖发育型调节启动子，例如，鼠科动物同源框蛋白(hox)启动子凯赛尔((Kessel)和格鲁斯(Gruss)，1990.《科学》(Science)249:374-379)和α-甲胎蛋白启动子(卡姆皮斯(Campes)和蒂尔曼(Tilghman)，1989.《基因发育》(Genes Dev.)3:537-546)。关于这些原核和真核载体，提及美国专利6,750,059，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。本发明的其他实施例可涉及病毒载体的使用，关于它提及美国专利申请13/092,085，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。组织特异型调节元件是本领域中已知的，并且在这个方面提及美国专利7,776,321，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，调节元件可操作地连接至CRISPR系统的一个或多个元件，从而驱动该CRISPR系统的该一个或多个元件的表达。一般而言，CRISPR(规律间隔成簇短回文重复)，也称为SPIDR(SPacer间隔开的同向重复)，构成通常对于特定细菌物种而言特异性的DNA基因座的家族。该CRISPR座位包含在大肠杆菌中被识别的间隔开的短序列重复(SSR)的一个不同类(石野(Ishino)等人，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，169:5429-5433[1987]；和中田(Nakata)等人，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，171:3553-3556[1989])、以及相关基因。类似的间隔开的SSR已经鉴定于地中海富盐菌(Haloferaxmediterranei)、化脓链球菌、鱼腥藻属、和结核分枝杆菌中(参见，格鲁恩(Groenen)等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，10:1057-1065[1993]；霍(Hoe)等人，《新发感染性疾病》(Emerg.Infect.Dis.)，5:254-263[1999]；马斯波尔(Masepohl)等人，《生物化学与生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)1307:26-30[1996]；以及莫吉卡(Mojica)等人，《分子微生物学》，17:85-93[1995])。这些CRISPR座位典型地不同于其他SSR的重复结构，这些重复已被称为规律间隔的短重复(SRSR)(詹森(Janssen)等人，《OMICS：整合生物学杂志》(OMICS J.Integ.Biol.)，6:23-33[2002]；以及莫吉卡(Mojica)等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，36:244-246[2000])。一般而言，这些重复是以簇存在的短元件，其被具有基本上恒定长度的独特间插序列规律地间隔开(莫吉卡(Mojica)等人，[2000]，同上)。虽然重复序列在菌株之间是高度保守的，许多间隔开的重复和这些间隔区的序列一般在菌株与菌株之间不同(冯·埃姆登(van Embden)等人，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，182:2393-2401[2000])。已经在40种以上的原核生物中鉴定出CRISPR座位(参见，例如，詹森(Janssen)等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，43:1565-1575[2002]；以及莫吉卡(Mojica)等人，[2005])，包括但不限于：气火菌属(Aeropyrum)、热棒菌属(Pyrobaculum)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、古球菌属(Archaeoglobus)、盐盒菌属(Halocarcula)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷火菌属(Methanopyrus)、焦球菌属(Pyrococcus)、嗜酸菌属(Picrophilus)、热原体属(Thermoplasma)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、产水菌属(Aquifex)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、绿菌属(Chlorobium)、栖热菌属(Thermus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、利斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、梭菌属(Clostridium)、好热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、支原体属(Mycoplasma)、梭杆菌属(Fusobacterium)、固氮弓菌属(Azarcus)、色杆菌属(Chromobacterium)、奈瑟菌属(Neisseria)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、地杆菌属(Geobacter)、粘球菌属(Myxococcus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、类杆菌属(Wolinella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、欧文菌属(Erwinia)、埃希菌属(Escherichia)、军团杆菌属(Legionella)、甲基球菌属(Methylococcus)、巴斯德菌属(Pasteurella)、发光细菌属(Photobacterium)、沙门菌属(Salmonella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、耶尔森菌属(Yersinia)、密螺旋体属(Treponema)以及栖热袍菌属(Thermotoga)。

在一些实施例中，该CRISPR酶是包含一个或多个异源蛋白结构域(例如除了该CRISPR酶之外的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个结构域)的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何其他蛋白质，以及任选地在任何两个结构域之间的连接序列。可以融合到CRISPR酶上的蛋白质结构域的实例包括但不限于，表位标签、报告基因序列、以及具有下列活性的一者或多者的蛋白质结构域：甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感病毒血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签、和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的实例包括，但不限于，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、以包括蓝色荧光蛋白(BFP)的自发荧光蛋白。CRISPR酶可以融合到编码一种蛋白质或蛋白质片段的基因序列上，所述蛋白质或蛋白质片段结合DNA分子或结合其他细胞分子，其包括，但不限于，麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-tag、Lex ADNA结合结构域(DBD)融合物、GAL4DNA结合结构域融合物、以及单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合物。可以形成包含CRISPR酶的融合蛋白的一部分的另外的结构域描述于US 20110059502中，通过引用将其并入本文。在一些实施例中，使用标记的CRISPR酶来鉴定靶序列的位置。

在一些实施例中，CRISPR酶可以形成可诱导系统的组分。该系统的诱导性质将允许该系统利用一种能量形式对基因编辑或基因表达进行时空控制。该能量形式可以包括但不限于，电磁辐射、声能、化学能和热能。可诱导系统的实例包括四环素诱导型启动子(Tet-开(Tet-On)或Tet-关(Tet-Off))、小分子双杂交体转录激活系统(FKBP、ABA等)或光可诱导系统(光敏素、LOV结构域或隐花色素)。在一个实施例中，该CRISPR酶可以是以序列特异性方式指导转录活性的变化的光诱导的转录效应因子(LITE)的一部分。光的组分可以包括CRISPR酶、光响应细胞色素异二聚体(例如，来自拟南芥)、以及转录激活/抑制结构域。诱导型DNA结合蛋白和关于使用它们的方法的其他实例提供在US 61/736465和US 61/721,283中，特此通过引用以其全文并入。

除非另有说明，本发明的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些在本领域的技能之内。参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2:实用方法》(PCR 2:APRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,ALABORATORY MANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。

重组模板(例如，HDR模板)

在一些实施例中，还提供了重组模板。重组模板可以是如本文所述的另一个载体的组分，其被包含在一个分开的载体中，或者被提供为一个分开的多核苷酸。在一些实施例中，重组模板被设计为用作在同源重组中的模板，如在被作为CRISPR复合物的一部分的CRISPR酶切开或切割的靶序列之内或在其附近。模板多核苷酸可以具有任何适合的长度，如约或多于约10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000个、或更多个核苷酸长度。在一些实施例中，该模板多核苷酸与包含该靶序列的多核苷酸的一部分互补。当进行最佳比对时，模板多核苷酸可能与靶序列的一个或多个核苷酸(例如约或多于约1、5、10、15、20个、或更多个核苷酸)重叠。在一些实施例中，当一个模板序列与包含靶序列的多核苷酸进行最佳比对时，该模板多核苷酸的最近的核苷酸在距离该靶序列的约1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000、5000、10000个、或更多个核苷酸之内。

修饰靶标

在一个方面，本发明提供了修饰真核细胞中的靶多核苷酸的方法，这些方法可以在体内、离体或在体外。在一些实施例中，该方法包括从人或非人动物或植物取样细胞或细胞群，并且修饰该细胞或这些细胞。培养可以发生在离体的任何阶段。该细胞或这些细胞甚至可以被重新引入该非人动物或植物中。对于重新引入的细胞，特别优选的是这些细胞是干细胞。

在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。

在一个方面，本发明提供了修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该多核苷酸上，这样使得所述结合导致所述多核苷酸的表达增加或降低；其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。类似的考虑因素和条件适用如上文针对修饰靶多核苷酸的方法。事实上，这些取样、培养和重新引入选择跨本发明的多个方面而适用。

确实，在本发明的任何方面，该CRISPR复合物可以包括与杂交到靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列可以连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而可以杂交到tracr序列上。类似的考虑因素和条件适用如上文针对修饰靶多核苷酸的方法。

试剂盒

在一个方面，本发明提供了以下试剂盒，这些试剂盒包含披露于以上方法和组合物中的元件中的任何一个或多个。元件可以单独地或组合地提供，并且可以被提供于任何适合的容器中，如小瓶、瓶子或管。在一些实施例中，该试剂盒包括一种或多种语言，例如多于一种语言的说明书。

在一些实施例中，试剂盒包括一种或多种用于在利用在此描述的元件中的一种或多种的方法中使用的试剂。试剂可以被提供于任何适合的容器中。例如，试剂盒可以提供一种或多种反应或存储缓冲液。可以按在具体测定中可用的形式或按在使用之前需要添加一种或多种其他组分的形式(例如按浓缩或冻干形式)提供试剂。缓冲液可以是任何缓冲液，包括但不限于碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液及其组合。在一些实施例中，该缓冲液是碱性的。在一些实施例中，该缓冲液具有从约7至约10的pH。在一些实施例中，该试剂盒包括一个或多个寡核苷酸，该一个或多个寡核苷酸对应于用于插入进载体中的指导序列，以便可操作地连接该指导序列和调节元件。在一些实施例中，该试剂盒包括同源重组模板多核苷酸。在一些实施例中，该试剂盒包括在此描述的载体中的一个或多个和/或在此描述的多核苷酸中的一个或多个。该试剂盒可以有利地允许提供本发明的系统的所有元件。

疾病相关基因和多核苷酸

可以在本发明的实践中被靶向的疾病相关基因和多核苷酸的实例列于表A和B中。在万维网上可获得的疾病具体信息可获得自约翰斯·霍普金斯大学的麦考斯克-纳森遗传医学研究所(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine,Johns HopkinsUniversity)(巴尔的摩，马里兰州)和国立医学图书馆的国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information,National Library of Medicine)(贝塞斯达，马里兰州)。信号传导生化途径相关基因和多核苷酸的实例列于表C中。这些基因和途径的突变可以导致产生不当的蛋白质或以不当的量影响功能的蛋白质。通过引用而特此结合来自于2012年12月12日提交的美国临时申请61/736,527的基因、疾病和蛋白质的另外的实例。这样的基因、蛋白质和途径可以是CRISPR复合物的靶多核苷酸。

表A

表B：

表C：

本发明的实施例还涉及与敲除基因、扩增基因以及修复与DNA重复不稳定性和神经障碍相关的具体突变有关的方法和组合物(罗伯特D.·威尔斯(Robert D.Wells)、芦沢哲夫(Tetsuo Ashizawa)，遗传不稳定性与神经疾病(Genetic Instabilities andNeurological Diseases)，第二版，学术出版社(Academic Press)，2011年10月13日-《医学》(Medical))。已经发现串联重复序列的特定方面对超过二十种人类疾病负责(重复不稳定新见：RNA·DNA杂交体的作用(New insights into repeat instability:role ofRNA·DNA hybrids).麦基弗EI(McIvor EI)、波拉克U(Polak U)、纳皮尔拉拉M(NapieralaM).《RNA生物学》(RNA Biol.)2010年9月-10月；7(5):551-8)。可以利用CRISPR-Cas系统校正基因组不稳定性缺陷。

本发明的一个另外的方面涉及利用CRISPR-Cas系统修正EMP2A和EMP2B基因缺陷，这些基因已经被鉴定为与拉福拉病(Lafora disease)相关。拉福拉病是一种由可以作为青年期的癫痫发作而开始的进行性肌阵挛性癫痫表征的常染色体隐性病症。该疾病的少数病可以由尚未鉴定的基因的突变引起。该疾病引起发作、肌肉痉挛、行走困难、痴呆，并且最终引起死亡。当前没有疗法被证明有效对抗疾病进展。与癫痫相关的其他遗传异常还可以靶向CRISPR-Cas系统并且基础遗传学进一步描述于由朱利亚诺阿文济尼(GiulianoAvanzini)、杰弗里L.诺贝尔斯(Jeffrey L.Noebels)编辑的《癫痫与遗传癫痫遗传学》(Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies)，马里亚尼儿科神经学基金会(Mariani Foundation Paediatric Neurology)：20；2009)中。

转让给加莫生物科技公司(Sangamo BioSciences,Inc.)的美国专利公开号20110158957的涉及使T细胞受体(TCR)基因失活的方法也可以被修饰为本发明的CRISPRCas系统。在另一个实例中，转让给加莫生物科技公司的美国专利公开号20100311124和转让给Cellectis公司的美国专利公开号20110225664的方法(两者都涉及使谷氨酰胺合成酶基因表达基因失活)也可以被修饰为本发明的CRISPR Cas系统。

本发明的若干另外的方面涉及校正与范围广泛的遗传性疾病相关的缺陷，这些遗传性疾病在专题小节遗传性障碍(Genetic Disorders)下被进一步描述于国立卫生研究院的网站(网址为health.nih.gov/topic/GeneticDisorders)。遗传性脑病可以包括但不限于，肾上腺脑白质营养不良、胼胝体发育不全、艾卡尔迪综合征(Aicardi Syndrome)、阿尔佩斯病(Alpers'Disease)、阿尔茨海默病、巴特综合征(Barth Syndrome)、巴藤病(BattenDisease)、CADASIL、小脑变性、费波瑞病(Fabry's Disease)、格斯特曼-施特劳斯纳病(Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease)、亨廷顿病以及其他三联体重复障碍、莱氏病(Leigh's Disease)、莱施-奈恩综合征、门克斯病、线粒体肌病以及NINDS空洞脑(Colpocephaly)。这些疾病在小节遗传性脑部障碍(Genetic Brain Disorders)下被进一步描述于国立卫生研究院的网站。

在卡地亚(Cartier)，“小型研讨会：X连锁肾上腺脑白质营养不良，造血干细胞移植和X连锁肾上腺脑白质营养不良中的造血干细胞基因疗法(MINI-SYMPOSIUM:X-LinkedAdrenoleukodystrophypa，Hematopoietic Stem Cell Transplantation andHematopoietic Stem Cell Gene Therapy in X-Linked Adrenoleukodystrophy)”，《脑病理学》(Brain Pathology)20(2010)857-862，通过引用并入本文连同它引用的文献，如同完整地陈述一样中，认识到异体造血干细胞移植(HSCT)用于向患有贺勒氏症(Hurler’sdisease)的患者的脑中递送正常的溶酶体酶并且存在关于用于治疗ALD的HSC基因疗法的讨论。在两个患者中，在粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)动员后收集外周CD34+细胞，并且用骨髓增殖性肉瘤病毒增强子(缺失阴性对照区的dl587rev引物结合位点取代的(MND)-ALD慢病毒载体)进行转导。在低浓度的细胞因子的存在下，在6h期间用MND-ALD载体转导来自患者的CD34+细胞。转导之后将转导的CD34+细胞冷冻，以在5％的细胞上进行各种安全性测试，这些测试具体地包括三种复制感受态慢病毒(RCL)测定。CD34+细胞的转导效力的范围是从35％至50％，其中慢病毒整合拷贝的平均数目在0.65与0.70之间。将转导的CD34+细胞解冻之后，在用白消安和环磷酰胺完全清髓后，以每kg多于4.10⁶个转导的CD34+细胞再输注到患者体内。将患者的HSC消除，以有利于经基因校正的HSC的植入。对于这两个患者而言，在第13天与15天之间发生血液学恢复。对于第一患者而言，在第12个月发生几乎完全的免疫恢复，并且对于第二患者而言发生在第9个月。与使用慢病毒相对照，根据本领域的知识和本披露的教导，就ALD而言，本领域技术人员可以使用靶向并校正突变的CRISPR-Cas9系统来校正HSC(例如，用适合的HDR模板)；确切地说，sgRNA可以靶向ABCD1(位于X染色体上的编码ALD(一种过氧化物酶体膜转运体蛋白)的基因)中的突变，并且HDR可以为该蛋白质的正确表达提供编码。根据本披露，靶向该突变的sgRNA和Cas9蛋白可以与造血干细胞接触并且引入HDR模板，用于校正过氧化物酶体膜转运体蛋白的表达的突变。

在一些实施例中，该病症可以是瘤形成。在一些实施例中，在该病症是瘤形成的情况下，有待被靶向的基因是列于表A中的那些基因中的任一种(在这种情况下是PTEN等)。在一些实施例中，该病症可以是年龄相关性黄斑变性。在一些实施例中，该病症可以是一种精神分裂症障碍。在一些实施例中，该病症可以是一种三核苷酸重复障碍。在一些实施例中，该病症可以是脆性X综合征。在一些实施例中，该病症可以是一种分泌酶相关障碍。在一些实施例中，该病症可以是一种朊病毒相关障碍。在一些实施例中，该病症可以是ALS。在一些实施例中，该病症可以是一种药物成瘾。在一些实施例中，该病症可以是自闭症。在一些实施例中，该病症可以是阿尔茨海默病。在一些实施例中，该病症可以是炎症。在一些实施例中，该病症可以是帕金森病。

例如，美国专利公开号20110023145描述了使用锌指核酸酶基因修饰与自闭症谱系障碍(ASD)相关的细胞、动物以及蛋白质。自闭症谱系障碍(ASD)是一组由社会交往和沟通的质量损伤以及行为、兴趣和活动的限制性重复和刻板性模式表征的障碍。这三种障碍自闭症、阿斯佩格综合征(AS)和未另行规定的广泛性发育障碍(PDD-NOS)是具有不同的严重程度、相关智力功能和医疗条件的同一障碍的连续体。ASD是主要由遗传决定的障碍,具有大约90％遗传力。

美国专利公开号20110023145包括编辑任何编码与ASD相关的蛋白质的染色体序列，这些序列可以被应用于本发明的CRISPR Cas系统。典型地基于与ASD相关的蛋白质与ASD的发生率或适应症的实验相关性选择与ASD相关的蛋白质。例如，相对于缺少ASD的群体，在具有ASD的群体中，与ASD相关的蛋白质的产生率或循环浓度可以升高或降低。可以使用蛋白质组技术评估蛋白质水平差异，包括但不限于蛋白质印迹、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)以及质谱法。可替代地，可以使用基因组技术通过获得编码这些蛋白质的基因的基因表达谱而鉴定与ASD相关的蛋白质，包括但不限于DNA微阵列分析、基因表达序列分析(SAGE)以及定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR)。

可能和与ASD相关的蛋白质相关的疾病状态或障碍的非限制性实例包括自闭症、阿斯佩格综合征(AS)、未另行规定的广泛性发育障碍(PDD-NOS)、雷特综合征、结节性硬化、苯丙酮尿症、史-伦-奥三氏综合征(Smith-Lemli-Opitz syndrome)以及脆性X综合征。通过非限制性实例的方式，与ASD相关的蛋白质包括但不限于以下蛋白质：ATP10C氨基磷脂-METMET受体转运ATP酶酪氨酸激酶(ATP10C)BZRAP1 MGLUR5(GRM5)代谢型谷氨酸受体5(MGLUR5)CDH10钙粘素-10 MGLUR6(GRM6)代谢型谷氨酸受体6(MGLUR6)CDH9钙粘素-9NLGN1神经连接蛋白-1CNTN4接触蛋白-4NLGN2神经连接蛋白-2CNTNAP2接触蛋白相关的SEMA5A神经连接蛋白-3蛋白样2(CNTNAP2)DHCR7 7-脱氢胆固醇NLGN4X神经连接蛋白-4X-还原酶(DHCR7)连接的DOC2A双重C2样-结构域-NLGN4Y神经连接蛋白-4Y-包含蛋白α连接的DPP6二肽基NLGN5神经连接蛋白-5氨肽酶样蛋白6EN2锯齿状2(EN2)NRCAM神经细胞粘附分子(NRCAM)MDGA2脆性X智力迟钝NRXN1轴突蛋白-1 1(MDGA2)FMR2(AFF2)AF4/FMR2家族成员2OR4M2嗅觉受体(AFF2)4M2 FOXP2叉头框蛋白P2 OR4N4嗅觉受体(FOXP2)4N4 FXR1脆性X智力OXTR催产素受体阻滞，常染色体(OXTR)同系物1(FXR1)FXR2脆性X智力PAH苯丙氨酸阻滞，常染色体羟化酶(PAH)同系物2(FXR2)GABRA1γ-氨基丁酸PTEN磷酸酶和受体亚基α-1张力蛋白同源物(GABRA1)(PTEN)GABRA5 GABAA(.γ.-氨基丁酸PTPRZ1受体类型酸)受体α5酪氨酸蛋白亚基(GABRA5)磷酸酶ζ(PTPRZ1)GABRB1γ-氨基丁酸RELN颤蛋白受体亚基β-1(GABRB1)GABRB3 GABAA(.γ.-氨基丁酸RPL10 60S核糖体酸)受体.β.3亚基蛋白L10(GABRB3)GABRG1γ-氨基丁酸SEMA5A脑信号蛋白(Semaphorin)-5A受体亚基γ-1(SEMA5A)(GABRG1)HIRIP3 HIRA-相互作用蛋白3SEZ6L2发作相关6同系物(小鼠)样2HOXA1同源盒蛋白Hox-A1 SHANK3 SH3和多重(HOXA1)锚蛋白重复结构域3(SHANK3)IL6白介素-6SHBZRAP1SH3和多重锚蛋白重复结构域3(SHBZRAP1)LAMB1层粘连蛋白亚基β-1SLC6A4血清素(LAMB1)转运体(SERT)MAPK3丝裂原激活蛋白TAS2R1味觉受体激酶3类型2成员1 TAS2R1MAZ Myc相关的锌指TSC1结节性硬化蛋白的蛋白1 MDGA2 MAM结构域包含TSC2结节性硬化糖基磷脂酰肌醇蛋白2锚定物2(MDGA2)MECP2甲基CpG结合UBE3A泛素蛋白蛋白2(MECP2)连接酶E3A(UBE3A)MECP2甲基CpG结合WNT2无翅型蛋白2(MECP2)MMTV整合位点家族，成员2(WNT2)。

与ASD相关的其染色体序列被编辑的蛋白质的一致性可以并且将会变化。在优选实施例中，与ASD相关的其染色体序列被编辑的蛋白质可以是由BZRAP1基因编码的苯二氮卓受体(外周)相关蛋白1(BZRAP1)、由AFF2基因编码的AF4/FMR2家族成员2蛋白(AFF2)(亦称MFR2)、由FXR1基因编码的脆性X智力迟钝常染色体同系物1蛋白(FXR1)、由FXR2基因编码的脆性X智力迟钝常染色体同系物2蛋白(FXR2)，由MDGA2基因编码的含MAM结构域的糖基磷脂酰肌醇锚定物2蛋白(MDGA2)、由MECP2基因编码的甲基CpG结合蛋白2(MECP2)、由MGLUR5-1基因编码的代谢型谷氨酸受体5(MGLUR5)(亦称GRM5)、由NRXN1基因编码的轴突蛋白1蛋白或由SEMA5A基因编码的脑信号蛋白-5A蛋白(SEMA5A)。在一个示例性实施例中，该基因修饰动物是大鼠，并且编码与ASD相关的蛋白质的编辑的染色体序列如下所列：BZRAP1苯二氮卓受体XM_002727789，(外周)相关XM_213427，蛋白1(BZRAP1)XM_002724533，XM_001081125AFF2(FMR2)AF4/FMR2家族成员2XM_219832，(AFF2)XM_001054673FXR1脆性X智力NM_001012179迟钝，常染色体同系物1(FXR1)FXR2脆性X智力NM_001100647迟钝，常染色体同系物2(FXR2)MDGA2含MAM结构域的NM_199269糖基磷脂酰肌醇锚定物2(MDGA2)MECP2甲基CpG结合NM_022673蛋白2(MECP2)MGLUR5代谢型谷氨酸NM_017012(GRM5)受体5(MGLUR5)NRXN1轴突蛋白-1NM_021767SEMA5A脑信号蛋白-5A(SEMA5A)NM_001107659。

示例性动物或细胞可以包括一、二、三、四、五、六、七、八或九个或更多个失活的编码与ASD相关的蛋白质的染色体序列，以及零、一、二、三、四、五、六、七、八、九个或更多个编码与ASD相关的蛋白质的染色体整合的序列。编辑的或整合的染色体序列可以被修饰为编码一种改变的与ASD相关的蛋白质。与ASD相关的蛋白质的突变的非限制性实例包括轴突蛋白1中的L18Q突变，其中位置18处的亮氨酸被谷氨酰胺替换；神经连接蛋白3中的R451C突变，其中位置451处的精氨酸被半胱氨酸替换；神经连接蛋白4中的R87W突变，其中位置87处的精氨酸被色氨酸替换；以及血清素转运体中的I425V突变，其中位置425处的异亮氨酸被缬氨酸替换。ASD相关染色体序列中的许多其他突变和染色体重排已经与ASD相关并且在本领域是已知的。参见例如，弗赖塔格(Freitag)等人(2010)《欧洲儿童与青少年精神病学》(Eur.Child.Adolesc.Psychiatry)19:169-178，以及布坎(Bucan)等人(2009)《PLoS遗传学》(PLoS Genetics)5:e1000536，将其披露通过引用以其全文结合在此。与帕金森病相关的蛋白质的实例包括但不限于α-突触核蛋白、DJ-1、LRRK2、PINK1、帕金蛋白、UCHL1、Synphilin-1以及NURR1。成瘾相关的蛋白质的实例可以包括例如ABAT。炎症相关蛋白的实例可以包括例如由Ccr2基因编码的单核细胞趋化蛋白-1(MCP1)、由Ccr5基因编码的C-C趋化因子受体类型5(CCR5)、由Fcgr2b基因编码的IgG受体IIB(FCGR2b，亦称CD32)或由Fcer1g基因编码的FcεR1g(FCER1g)蛋白。心血管疾病相关蛋白的实例可以包括例如IL1B(白介素1，β)、XDH(黄嘌呤脱氢酶)、TP53(肿瘤蛋白p53)、PTGIS(前列腺素I2(前列腺环素)合酶)、MB(肌红蛋白)、IL4(白介素4)、ANGPT1(血管生成素1)、ABCG8(ATP-结合盒，亚家族G(WHITE)，成员8)或CTSK(组织蛋白酶K)。例如，美国专利公开号20110023153描述了使用锌指核酸酶基因修饰与阿尔茨海默病相关的细胞、动物以及蛋白质。曾经修饰的细胞和动物可以进一步使用已知的用于研究靶向突变对AD的发展和/或进展的影响的方法，使用AD研究中常用的措施进行测试-如但不限于，学习和记忆、焦虑、抑郁、成瘾、感觉运动功能以及测量行为、功能、病理、代谢和生化功能的测定。

本发明包括编码与AD相关的蛋白质的任何染色体序列的编辑。典型地基于AD相关蛋白与AD障碍的实验相关性选择AD相关蛋白。例如，相对于缺少AD障碍的群体，在具有AD障碍的群体中，AD相关蛋白的产生率或循环浓度可以升高或降低。可以使用蛋白质组技术评估蛋白质水平差异，包括但不限于蛋白质印迹、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)以及质谱法。可替代地，可以使用基因组技术通过获得编码这些蛋白质的基因的基因表达谱而鉴定AD相关蛋白，包括但不限于DNA微阵列分析、基因表达序列分析(SAGE)以及定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR)。阿尔茨海默病相关蛋白的实例可以包括例如由VLDLR基因编码的极低密度脂蛋白受体蛋白(VLDLR)、由UBA1基因编码的泛素样改性剂激活酶1(UBA1)或由UBA3基因编码的NEDD8-激活酶E1催化亚基蛋白(UBE1C)。通过非限制性实例的方式，与AD相关的蛋白质包括但不限于如下所列的蛋白质：染色体序列编码蛋白ALAS2δ-氨基酮戊酸合酶2(ALAS2)ABCA1ATP-结合盒转运体(ABCA1)ACE血管紧张素I-转化酶(ACE)APOE载脂蛋白E前体(APOE)APP淀粉样蛋白前体蛋白(APP)AQP1水通道蛋白1(AQP1)BIN1Myc盒依赖性相互作用蛋白1或桥接整合蛋白1(BIN1)BDNF脑源性神经营养因子(BDNF)BTNL8嗜乳脂蛋白样蛋白8(BTNL8)C1ORF49 1号染色体开放阅读框49CDH4钙粘素-4CHRNB2神经元乙酰胆碱受体亚基β-2CKLFSF2CKLF样MARVEL跨膜结构域-包含蛋白2(CKLFSF2)CLEC4E C型凝集素结构域家族4，成员e(CLEC4E)CLU簇集蛋白(也称为载脂蛋白J)CR1红细胞补体受体1(CR1，也称为CD35、C3b/C4b受体和免疫粘附受体)CR1L红细胞补体受体1(CR1L)CSF3R粒细胞集落刺激因子3受体(CSF3R)CST3胱抑素C或胱抑素3CYP2C细胞色素P450 2C DAPK1死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)ESR1雌激素受体1FCAR IgA受体的Fc片段(FCAR，也称为CD89)FCGR3B IgG的Fc片段，低亲和性IIIb，受体(FCGR3B或CD16b)FFA2游离脂肪酸受体2(FFA2)FGA纤维蛋白原(因子I)GAB2GRB2-相关结合蛋白2(GAB2)GAB2GRB2-相关结合蛋白2(GAB2)GALP甘丙肽样肽GAPDHS甘油醛-3-磷酸脱氢酶，精子发生的(GAPDHS)GMPB GMBP HP结合珠蛋白(HP)HTR7 5-羟色胺(血清素)受体7(腺苷酸环化酶偶联的)IDE胰岛素降解酶IF127IF127IFI6干扰素，α-可诱导蛋白6(IFI6)IFIT2具有三角形四肽重复的干扰素诱导的蛋白2(IFIT2)IL1RN白介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)IL8RA白介素8受体,α(IL8RA或CD181)IL8RB白介素8受体，β(IL8RB)JAG1锯齿状1(JAG1)KCNJ15钾内向整流通道，亚家族J，成员15(KCNJ15)LRP6低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)MAPT微管相关蛋白tau(MAPT)MARK4MAP/微管亲和性调节激酶4(MARK4)MPHOSPH1M期磷蛋白1MTHFR 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶MX2干扰素诱导的GTP-结合蛋白Mx2NBN Nibrin，也称为NBN NCSTN呆蛋白NIACR2烟酸受体2(NIACR2，也称为GPR109B)NMNAT3烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶3NTM Neurotrimin(或HNT)ORM1血清类粘蛋白(Orosmucoid)1(ORM1)或α-1-酸性糖蛋白1P2RY13P2Y嘌呤受体13(P2RY13)PBEF1烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAmPRTase或Nampt)也称为前B细胞集落增强因子1(PBEF1)或内脂素PCK1磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PICALM磷脂酰肌醇结合网格蛋白装配蛋白(PICALM)PLAU尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂(PLAU)PLXNC1丛状蛋白(Plexin)C1(PLXNC1)PRNP朊病毒蛋白PSEN1早老素1蛋白(PSEN1)PSEN2早老素2蛋白(PSEN2)PTPRA蛋白质酪氨酸磷酸酶受体A型蛋白(PTPRA)RALGPS2具有PH结构域和SH3结合基序的Ral GEF 2(RALGPS2)RGSL2G-蛋白信号传导样调节剂2(RGSL2)SELENBP1含硒结合蛋白1(SELNBP1)SLC25A37线粒体铁转运蛋白(Mitoferrin)-1SORL1含分拣蛋白相关受体L(DLR类别)A重复的蛋白质(SORL1)TF转铁蛋白TFAM线粒体转录因子A TNF肿瘤坏死因子TNFRSF10C肿瘤坏死因子受体超家族成员10C(TNFRSF10C)TNFSF10肿瘤坏死因子受体超家族，(TRAIL)成员10a(TNFSF10)UBA1泛素样改性剂激活酶1(UBA1)UBA3NEDD8-激活酶E1催化亚基蛋白(UBE1C)UBB泛素B蛋白(UBB)UBQLN1泛醌蛋白(Ubiquilin)-1UCHL1泛素羧基末端酯酶L1蛋白(UCHL1)UCHL3泛素羧基末端水解酶同工酶L3蛋白(UCHL3)VLDLR极低密度脂蛋白受体蛋白(VLDLR)。在示例性实施例中，与AD相关的其染色体序列被编辑的蛋白质可以是由VLDLR基因编码的极低密度脂蛋白受体蛋白(VLDLR)、由UBA1基因编码的泛素样改性剂激活酶1(UBA1)、由UBA3基因编码的NEDD8-激活酶E1催化亚基蛋白(UBE1C)、由AQP1基因编码的水通道蛋白1(AQP1)、由UCHL1基因编码的泛素羧基末端酯酶L1蛋白(UCHL1)、由UCHL3基因编码的泛素羧基末端水解酶同工酶L3蛋白(UCHL3)、由UBB基因编码的泛素B蛋白(UBB)、由MAPT基因编码的微管相关蛋白tau(MAPT)、由PTPRA基因编码的蛋白质酪氨酸磷酸酶受体A型蛋白(PTPRA)、由PICALM基因编码的磷脂酰肌醇结合网格蛋白装配蛋白(PICALM)、由CLU基因编码的簇集蛋白(也称为载脂蛋白J)、由PSEN1基因编码的早老素1蛋白、由PSEN2基因编码的早老素2蛋白、由SORL1基因编码的含分拣蛋白相关受体L(DLR类别)A重复的蛋白质(SORL1)蛋白质、由APP基因编码的淀粉样蛋白前体蛋白(APP)、由APOE基因编码的载脂蛋白E前体(APOE)或由BDNF基因编码的脑源性神经营养因子(BDNF)。在一个示例性实施例中，该基因修饰动物是大鼠，并且编码与AD相关的蛋白质的编辑的染色体序列如下：APP淀粉样蛋白前体蛋白(APP)NM_019288AQP1水通道蛋白1(AQP1)NM_012778BDNF脑源性神经营养因子NM_012513CLU簇集蛋白(也称为NM_053021载脂蛋白J)MAPT微管相关蛋白NM_017212tau(MAPT)PICALM磷脂酰肌醇结合NM_053554网格蛋白装配蛋白(PICALM)PSEN1早老素1蛋白(PSEN1)NM_019163PSEN2早老素2蛋白(PSEN2)NM_031087PTPRA酪氨酸磷酸酶NM_012763受体A型蛋白(PTPRA)SORL1含分拣蛋白相关受体L(DLR NM_053519，类别)A重复的XM_001065506，蛋白质(SORL1)XM_217115UBA1泛素样改性剂激活NM_001014080酶1(UBA1)UBA3NEDD8-激活酶E1NM_057205催化亚基蛋白(UBE1C)UBB泛素B蛋白(UBB)NM_138895UCHL1泛素羧基末端NM_017237酯酶L1蛋白(UCHL1)UCHL3泛素羧基末端NM_001110165水解酶同工酶L3蛋白(UCHL3)VLDLR极低密度脂蛋白NM_013155受体蛋白(VLDLR)。该动物或细胞可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个破坏的、编码与AD相关的蛋白质的染色体序列以及零、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码与AD相关的蛋白质的染色体整合序列。编辑的或整合的染色体序列可以被修饰为编码一种改变的与AD相关的蛋白质。AD相关染色体序列中的许多突变已经与AD相关。例如，APP中的V7171(即位置717处的缬氨酸变为异亮氨酸)错义突变引起家族性AD。早老素-1蛋白中的多重突变，如H163R(即位置163处的组氨酸变为精氨酸)、A246E(即位置246处的丙氨酸变为谷氨酸)、L286V(即位置286处的亮氨酸变为缬氨酸)以及C410Y(即位置410处的半胱氨酸变为酪氨酸)引起家族性3型阿尔茨海默病。早老素-2蛋白中的突变，如N141I(即位置141处的天冬酰胺变为异亮氨酸)、M239V(即位置239处的甲硫氨酸变为缬氨酸)以及D439A(即位置439处的天冬氨酸变为丙氨酸)引起家族性4型阿尔茨海默病。AD相关基因和疾病的遗传变体的其他相关性在本领域是已知的。参见例如，韦林(Waring)等人(2008)《神经病学年鉴》(Arch.Neurol.)65:329-334，将其披露通过引用以其全文结合在此。

自闭症谱系障碍相关蛋白的实例可以包括例如由BZRAP1基因编码的苯二氮卓受体(外周)相关蛋白1(BZRAP1)、由AFF2基因编码的AF4/FMR2家族成员2蛋白(AFF2)(亦称MFR2)、由FXR1基因编码的脆性X智力迟钝常染色体同系物1蛋白(FXR1)或由FXR2基因编码的脆性X智力迟钝常染色体同系物2蛋白(FXR2)。

黄斑变性相关蛋白的实例可以包括例如由ABCR基因编码的ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)成员4蛋白(ABCA4)、由APOE基因编码的载脂蛋白E蛋白(APOE)或由CCL2基因编码的趋化因子(C-C基序)配体2蛋白(CCL2)。

精神分裂症相关蛋白的实例可以包括NRG1、ErbB4、CPLX1、TPH1、TPH2、NRXN1、GSK3A、BDNF、DISC1、GSK3B及其组合。

涉及肿瘤抑制的蛋白质的实例可以包括例如ATM(共济失调性毛细血管扩张突变的)、ATR(共济失调性毛细血管扩张和Rad3相关的)、EGFR(表皮生长因子受体)、ERBB2(v-erb-b2红白血病病毒癌基因同系物2)、ERBB3(v-erb-b2红白血病病毒癌基因同系物3)、ERBB4(v-erb-b2红白血病病毒癌基因同系物4)、Notch 1、Notch 2、Notch 3或Notch 4。

与分泌酶障碍相关的蛋白质的实例可以包括例如PSENEN(早老素增强子2同系物(秀丽隐杆线虫))、CTSB(组织蛋白酶B)、PSEN1(早老素1)、APP(淀粉样蛋白β(A4)前体蛋白)、APH1B(前咽缺陷1同系物B(秀丽隐杆线虫))、PSEN2(早老素2(阿尔茨海默病4))或BACE1(β-位点APP-切割酶1)。例如，美国专利公开号20110023146描述了使用锌指核酸酶基因修饰与分泌酶相关障碍相关的细胞、动物以及蛋白质。分泌酶对于将前蛋白加工成其生物活性形式是必需的。分泌酶途径的各种组分的缺陷促成许多障碍，特别是具有标志性淀粉样蛋白生成或淀粉样蛋白斑块的那些，如阿尔茨海默病(AD)。

分泌酶障碍以及与这些障碍相关的蛋白质是一套影响众多障碍的易感性、障碍的存在、障碍的严重性或其任何组合的相异蛋白质。本披露包括编码与分泌酶障碍相关的蛋白质的任何染色体序列的编辑。典型地基于分泌酶相关蛋白质与分泌酶障碍的发展的实验相关性选择与分泌酶障碍相关的蛋白质。例如，相对于没有分泌酶障碍的群体，在具有分泌酶障碍的群体中，与分泌酶障碍相关的蛋白质的产生率或循环浓度可以升高或降低。可以使用蛋白质组技术评估蛋白质水平差异，包括但不限于蛋白质印迹、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)以及质谱法。可替代地，可以使用基因组技术通过获得编码这些蛋白质的基因的基因表达谱而鉴定与分泌酶障碍相关的蛋白质，包括但不限于DNA微阵列分析、基因表达序列分析(SAGE)以及定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR)。通过非限制性实例的方式，与分泌酶障碍相关的蛋白质包括PSENEN(早老素增强子2同系物(秀丽隐杆线虫))、CTSB(组织蛋白酶B)、PSEN1(早老素1)、APP(淀粉样蛋白β(A4)前体蛋白)、APH1B(前咽缺陷1同系物B(秀丽隐杆线虫))、PSEN2(早老素2(阿尔茨海默病4))、BACE1(β-位点APP-切割酶1)、ITM2B(膜内在蛋白2B)、CTSD(组织蛋白酶D)、NOTCH1(Notch同系物1、易位相关(果蝇))、TNF(肿瘤坏死因子(TNF超家族，成员2))、INS(胰岛素)、DYT10(肌张力障碍10)、ADAM17(ADAM金属肽酶结构域17)、APOE(载脂蛋白E)、ACE(血管紧张素I转化酶(肽基二肽酶A)1)、STN(他汀)、TP53(肿瘤蛋白p53)、IL6(白介素6(干扰素，β2))、NGFR(神经生长因子受体(TNFR超家族，成员16))、IL1B(白介素1，β)、ACHE(乙酰胆碱酯酶(Yt血型))、CTNNB1(连环蛋白(钙粘素相关蛋白)，β1，88kDa)、IGF1(胰岛素样生长因子1(生长调节素C))、IFNG(干扰素，γ)、NRG1(神经调节蛋白1)、CASP3(半胱天冬酶3，凋亡相关半胱氨酸肽酶)、MAPK1(丝裂原激活蛋白激酶1)、CDH1(钙粘素1，1型，E-钙粘素(上皮))、APBB1(淀粉样蛋白β(A4)前体蛋白结合，家族B，成员1(Fe65))、HMGCR(3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶)、CREB1(cAMP反应元件结合蛋白1)、PTGS2(前列腺素内过氧化物合酶2(前列腺素G/H合酶和环氧合酶))、HES1(长毛和裂口增强蛋白(hairy and enhancer of split)1，(果蝇))、CAT(过氧化氢酶)、TGFB1(转化生长因子，β1)、ENO2(烯醇酶2(γ，神经元的))、ERBB4(v-erb-a红白血病病毒癌基因同系物4(禽的))、TRAPPC10(运输蛋白粒子复合物10)、MAOB(单胺氧化酶B)、NGF(神经生长因子(β多肽))、MMP12(基质金属肽酶12(巨噬细胞弹性蛋白酶))、JAG1(锯齿状1(艾欧吉勒综合征(Alagille syndrome)))、CD40LG(CD40配体)、PPARG(过氧化物酶体增殖剂激活的受体γ)、FGF2(成纤维细胞生长因子2(碱性的))、IL3(白介素3(集落刺激因子，多重的))、LRP1(低密度脂蛋白受体相关蛋白1)、NOTCH4(Notch同系物4(果蝇))、MAPK8(丝裂原激活蛋白激酶8)、PREP(脯氨酰内肽酶)、NOTCH3(Notch同系物3(果蝇))、PRNP(朊病毒蛋白)、CTSG(组织蛋白酶G)、EGF(表皮生长因子(β-尿抑胃素))、REN(肾素)、CD44(CD44分子(印度血型))、SELP(选择素P(颗粒膜蛋白140kDa，抗原CD62))、GHR(生长激素体)、ADCYAP1(腺苷酸环化酶激活多肽1(脑垂体的))、INSR(胰岛素受体)、GFAP(胶质酸性蛋白)、MMP3(基质金属肽酶3(溶基质素1，前明胶酶(progelatinase)))、MAPK10(丝裂原激活蛋白激酶10)、SP1(Sp1转录因子)、MYC(v-myc骨髓细胞瘤病病毒癌基因同系物(禽的))、CTSE(组织蛋白酶E)、PPARA(过氧化物酶体增殖剂激活受体α)、JUN(jun癌基因)、TIMP1(TIMP金属肽酶抑制剂1)、IL5(白介素5(集落刺激因子，嗜酸性粒细胞))、IL1A(白介素1，α)、MMP9(基质金属肽酶9(明胶酶B，92kDa明胶酶，92kDa IV型胶原酶))、HTR4(5-羟色胺(血清素)受体4)、HSPG2(硫酸乙酰肝素蛋白多糖2)、KRAS(v-Ki-ras2柯尔斯顿(Kirsten)大鼠肉瘤病毒癌基因同系物)、CYCS(细胞色素c，躯体的)、SMG1(SMG1同系物，磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(秀丽隐杆线虫))、IL1R1(白介素1受体，I型)、PROK1(前动力蛋白1)、MAPK3(丝裂原激活蛋白激酶3)、NTRK1(神经营养酪氨酸激酶受体，1型)、IL13(白介素13)、MME(膜金属内肽酶)、TKT(转酮醇酶)、CXCR2(趋化因子(C-X-C基序)受体2)、IGF1R(胰岛素样生长因子1受体)、RARA(视黄酸受体，α)、CREBBP(CREB结合蛋白)、PTGS1(前列腺素内过氧化物合酶1(前列腺素G/H合酶和环氧合酶))、GALT(半乳糖-1-磷酸尿甙基转移酶(uridylyltransferase))、CHRM1(胆碱能受体，毒蕈碱1)、ATXN1(共济失调蛋白1)、PAWR(PRKC，凋亡，WT1，调节剂)、NOTCH2(Notch同系物2(果蝇))、M6PR(甘露糖-6-磷酸受体(阳离子依赖性的))、CYP46A1(细胞色素P450，家族46、亚家族A，多肽1)、CSNK1D(酪蛋白激酶1，δ)、MAPK14(丝裂原激活蛋白激酶14)、PRG2(蛋白多糖2，骨髓(自然杀伤细胞激活剂，嗜酸性粒细胞颗粒主要碱性蛋白))、PRKCA(蛋白激酶C，α)、L1CAM(L1细胞粘附分子)、CD40(CD40分子，TNF受体超家族成员5)、NR1I2(核受体亚家族1，I组，成员2)、JAG2(锯齿状2)、CTNND1(连环蛋白(钙粘素相关蛋白)、δ1)、CDH2(钙粘素2，1型、N-钙粘素(神经元的))、CMA1(糜酶1、肥大细胞)、SORT1(分拣蛋白1)、DLK1(δ样1同系物(果蝇))、THEM4(硫酯酶超家族成员4)、JUP(连接斑珠蛋白(junctionplakoglobin))、CD46(CD46分子，补体调节蛋白)、CCL11(趋化因子(C-C基序)配体11)、CAV3(小窝蛋白3)、RNASE3(核糖核酸酶，RNA酶A家族、3(嗜酸性粒细胞阳离子蛋白))、HSPA8(热休克70kDa蛋白8)、CASP9(半胱天冬酶9，凋亡相关半胱氨酸肽酶)、CYP3A4(细胞色素P450，家族3，亚家族A，多肽4)、CCR3(趋化因子(C-C基序)受体3)、TFAP2A(转录因子AP-2α(激活增强子结合蛋白2α))、SCP2(固醇载体蛋白2)、CDK4(细胞周期蛋白依赖性激酶4)、HIF1A(缺氧可诱导的因子1，α亚基(基本螺旋-环-螺旋转录因子))、TCF7L2(转录因子7样2(T细胞特异的，HMG盒))、IL1R2(白介素1受体，II型)、B3GALTL(β1,3-半乳糖转移酶样)、MDM2(Mdm2p53结合蛋白同系物(小鼠))、RELA(v-rel网状内皮组织增殖病毒癌基因同系物A(禽的))、CASP7(半胱天冬酶7，凋亡相关半胱氨酸肽酶)、IDE(胰岛素降解酶)、FABP4(脂肪酸结合蛋白4，脂肪细胞)、CASK(钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(MAGUK家族))、ADCYAP1R1(腺苷酸环化酶激活多肽1(脑垂体的)受体类型I)、ATF4(激活转录因子4(tax-反应增强子元件B67))、PDGFA(血小板衍生的生长因子α多肽)、C21或f33(21号染色体开放阅读框33)、SCG5(分泌粒蛋白V(7B2蛋白))、RNF123(环指蛋白123)、NFKB1(B细胞中的κ轻多肽基因增强子的核因子1)、ERBB2(v-erb-b2红白血病病毒癌基因同系物2、神经/胶质母细胞瘤衍生的癌基因同系物(禽的))、CAV1(小窝蛋白1，胞膜窖蛋白，22kDa)、MMP7(基质金属肽酶7(基质溶解素，子宫的))、TGFA(转化生长因子，α)、RXRA(类视黄醇X受体，α)、STX1A(突触融合蛋白1A(脑的))、PSMC4(蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)26S亚基，ATP酶，4)、P2RY2(嘌呤能受体P2Y，G蛋白偶联的，2)、TNFRSF21(肿瘤坏死因子受体超家族，成员21)、DLG1(discs，大的同系物1(果蝇))、NUMBL(numb同系物(果蝇)样)、SPN(涎福林(sialophorin))、PLSCR1(磷脂混杂酶1)、UBQLN2(泛醌蛋白2)、UBQLN1(泛醌蛋白1)、PCSK7(前蛋白转化酶枯草杆菌/科信(kexin)类型7)、SPON1(脊椎蛋白1，细胞外基质蛋白)、SILV(西尔弗(silver)同系物(小鼠))、QPCT(谷氨酰胺-肽环转移酶)、HESS(长毛和裂口增强蛋白5(果蝇))、GCC1(GRIP和含卷曲螺旋结构域的1)及其任何组合。该基因修饰动物或细胞可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个破坏的、编码与分泌酶障碍相关的蛋白质的染色体序列以及零、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个编码破坏的与分泌酶障碍相关的蛋白质的染色体整合序列。

与肌萎缩性侧索硬化相关的蛋白质的实例可以包括SOD1(超氧化物歧化酶1)、ALS2(肌萎缩性侧索硬化2)、FUS(融合在肉瘤中)、TARDBP(TAR DNA结合蛋白)、VAGFA(血管内皮生长因子A)、VAGFB(血管内皮生长因子B)以及VAGFC(血管内皮生长因子C)及其任何组合。例如，美国专利公开号20110023144描述了使用锌指核酸酶基因修饰与肌萎缩性侧索硬化(ALS)疾病相关的细胞、动物以及蛋白质。ALS由涉及随意运动的脑皮层、脑干和脊髓中的某些神经细胞的逐步稳定退化表征。

运动神经元障碍以及与这些障碍相关的蛋白质是一套影响患上运动神经元障碍的易感性、运动神经元障碍的存在、运动神经元障碍的严重性或其任何组合的相异蛋白质。本披露包括编码与一种特定的运动神经元障碍ALS疾病相关的蛋白质的任何染色体序列的编辑。典型地基于ALS相关蛋白与ALS的实验相关性选择与ALS相关的蛋白质。例如，相对于没有ALS的群体，在具有ALS的群体中，与ALS相关的蛋白质的产生率或循环浓度可以升高或降低。可以使用蛋白质组技术评估蛋白质水平差异，包括但不限于蛋白质印迹、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)以及质谱法。可替代地，可以使用基因组技术通过获得编码这些蛋白质的基因的基因表达谱而鉴定与ALS相关的蛋白质，包括但不限于DNA微阵列分析、基因表达序列分析(SAGE)以及定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR)。通过非限制性实例的方式，与ALS相关的蛋白质包括但不限以下蛋白质：SOD1超氧化物歧化酶1，ALS3肌萎缩性侧索可溶性硬化3SETX senataxin ALS5肌萎缩性侧索硬化5FUS融合在肉瘤中ALS7肌萎缩性侧索硬化7ALS2肌萎缩性侧索DPP6二肽基肽酶6硬化2NEFH神经微丝，重PTGS1前列腺素-多肽内过氧化物合酶1SLC1A2溶质载体家族1TNFRSF10B肿瘤坏死因子(胶质高亲和性受体超家族，谷氨酸转运体)，成员10b成员2PRPH外周蛋白HSP90AA1热休克蛋白90kDaα(胞质的)，类别A成员1GRIA2谷氨酸受体，IFNG干扰素，γ离子型的，AMPA 2S100B S100钙结合FGF2成纤维细胞生长因子2蛋白质B AOX1醛氧化酶1CS柠檬酸合酶TARDBP TAR DNA结合蛋白TXN硫氧还原蛋白RAPH1Ras缔合MAP3K5丝裂原激活蛋白质(RaIGDS/AF-6)和激酶5普列克底物蛋白(pleckstrin)同源性结构域1NBEAL1蛋白激酶锚定蛋白(neurobeachin)样1GPX1谷胱甘肽过氧化物酶1ICA1L胰岛细胞自身抗原RAC1ras-相关C3肉毒菌1.69kDa样毒素底物1MAPT微管相关ITPR2肌醇1,4,5-蛋白tau三磷酸受体，2型ALS2CR4肌萎缩性侧索GLS谷氨酰胺酶硬化2(青少年)染色体区域，候选物4ALS2CR8肌萎缩性侧索CNTFR睫状神经营养因子硬化2(青少年)受体染色体区域，候选物8ALS2CR11肌萎缩性侧索FOLH1叶酸水解酶1硬化2(青少年)染色体区域，候选物11FAM117B具有序列P4HB的家族脯氨酰基4-羟化酶，相似性117，成员Bβ多肽CNTF睫状神经营养因子SQSTM1死骨片(sequestosome)1STRADB STE20相关激酶NAIP NLR家族，凋亡适配器β抑制蛋白YWHAQ酪氨酸3-SLC33A1溶质载体家族33单加氧酶/色氨酸(乙酰-CoA转运体)，一种5-单加氧酶成员1激活蛋白，θ多肽TRAK2运输蛋白，图4图4同系物，SAC1驱动蛋白结合2脂质磷酸酶结构域包含NIF3L1NIF3NGG1相互作用INA互联蛋白(internexin)神经因子3样1中间丝蛋白，αPARD3B par-3分区COX8A细胞色素c氧化酶缺陷3同系物B亚基VIIIACDK15细胞周期蛋白依赖性激酶HECW1HECT，C2和WW 15结构域包含E3泛素蛋白连接酶1NOS1一氧化氮合酶1MET met原癌基因SOD2超氧化物歧化酶2，HSPB1热休克27kDa线粒体蛋白1NEFL神经微丝，轻CTSB组织蛋白酶B多肽ANG血管生成素，HSPA8热休克70kDa核糖核酸酶，RNA酶A蛋白8家族，5VAPB VAMP(囊泡-ESR1雌激素受体1相关膜蛋白)-相关蛋白B和C SNCA突触核蛋白，αHGF肝细胞生长因子CAT过氧化氢酶ACTB肌动蛋白，βNEFM神经微丝，介质TH酪氨酸羟化酶多肽BCL2B-细胞CLL/淋巴瘤2FAS Fas(TNF受体超家族，成员6)CASP3半胱天冬酶3，凋亡-CLU簇集蛋白相关半胱氨酸肽酶SMN1运动神经元的存活G6PD葡萄糖-6-磷酸1，端粒脱氢酶BAX BCL2-相关X HSF1热休克转录蛋白因子1RNF19A环指蛋白19A JUN jun癌基因ALS2CR12肌萎缩性侧索HSPA5热休克70kDa硬化2(青少年)蛋白5染色体区域，候选物12MAPK14丝裂原激活蛋白IL10白介素10激酶14APEX1APEX核酸酶TXNRD1硫氧还原蛋白还原酶1(多功能DNA修复酶)1NOS2一氧化氮合酶2，TIMP1TIMP金属肽酶可诱导的抑制剂1CASP9半胱天冬酶9，相关半胱氨酸凋亡肽酶的凋亡-XIAP X-连接的抑制剂GLG1高尔基体糖蛋白1EPO促红细胞生成素VEGFA血管内皮ELN弹性蛋白生长因子A GDNF胶质细胞衍生的NFE2L2核因子(红系(erythroid)-神经营养因子衍生的2)样2SLC6A3溶质载体家族6HSPA4热休克70kDa(神经递质蛋白4转运体，多巴胺)，成员3APOE载脂蛋白E PSMB8蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β类型，8DCTN1动力蛋白激活蛋白(dynactin)1TIMP3TIMP金属肽酶抑制剂3KIFAP3驱动蛋白相关SLC1A1溶质载体家族1蛋白3(神经元/上皮高亲和性谷氨酸转运体，系统Xag)，成员1SMN2运动神经元的存活CCNC细胞周期蛋白C 2，着丝粒MPP4膜蛋白，STUB1STIP1同源性和U-棕榈酰化的4盒包含蛋白1ALS2淀粉样蛋白β(A4)PRDX6过氧化物酶6前体蛋白SYP突触素CABIN1钙调磷酸酶结合蛋白1CASP1半胱天冬酶1，凋亡-GART磷酸核糖甘氨酰胺相关半胱氨酸甲酰转移酶，肽酶磷酸核糖甘氨酰胺合成酶，磷酸核糖氨基咪唑合成酶CDK5细胞周期蛋白依赖性激酶5ATXN3共济失调蛋白3RTN4浆膜蛋白(reticulon)4C1QB补体成分1，q亚成分，B链VEGFC神经生长因子HTT亨廷顿蛋白(huntingtin)受体PARK7帕金森病7XDH黄嘌呤脱氢酶GFAP胶质纤维酸性MAP2微管相关蛋白2CYCS细胞色素c，躯体的FCGR3B IgG的Fc片段，低亲和性IIIb，CCS UBL5(泛素样5超氧化物歧化酶)的铜分子伴侣MMP9基质金属肽酶SLC18A3溶质载体家族18 9((囊状乙酰胆碱)，成员3TRPM7瞬时受体HSPB2热休克27kDa潜在的阳离子通道，蛋白2亚家族M，成员7AKT1v-akt鼠胸腺瘤DERL1Der1样结构域家族，病毒癌基因同系物1成员1CCL2趋化因子(C--C基序)NGRN突触生长相关蛋白(neugrin)，轴突配体2赘生物(outgrowth)相关GSR谷胱甘肽还原酶TPPP3促微管蛋白聚合蛋白家族成员3APAF1凋亡肽酶BTBD10BTB(POZ)结构域激活因子1包含10GLUD1谷氨酸CXCR4趋化因子(C--X--C基序)脱氢酶1受体4SLC1A3溶质载体家族1FLT1fms相关酪氨酸(胶质高亲和性谷氨酸转运体)，成员3激酶1PON1对氧磷酶1AR雄激素受体LIF白血病抑制因子ERBB3v-erb-b2红白血病病毒癌基因同系物3LGALS1凝集素，半乳糖苷-CD44CD44分子结合，可溶的，1TP53肿瘤蛋白p53TLR3toll样受体3GRIA1谷氨酸受体，GAPDH甘油-3-离子型的，AMPA1磷酸脱氢酶GRIK1谷氨酸受体，DES结蛋白离子型的，红藻氨酸(kainate)1CHAT胆碱乙酰转移酶FLT4fms相关酪氨酸激酶4CHMP2B染色质修饰的BAG1BCL2相关蛋白2B永生基因(athanogene)MT3金属硫蛋白3CHRNA4胆碱能受体，烟碱的，α4GSS谷胱甘肽合成酶BAK1BCL2-拮抗剂(antagonist/killer)1KDR激酶插入结构域GSTP1谷胱甘肽S-转移酶受体(III型pi 1受体酪氨酸激酶)OGG1 8-氧桥鸟嘌呤(oxoguanine)DNA IL6白介素6(干扰素，糖基化酶β2)。该动物或细胞可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个破坏的、编码与ALS相关的蛋白质的染色体序列以及零、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个编码破坏的与ALS相关的蛋白质的染色体整合序列。与ALS相关的优选蛋白包括SOD1(超氧化物歧化酶1)、ALS2(肌萎缩性侧索硬化2)、FUS(融合在肉瘤中)、TARDBP(TAR DNA结合蛋白)、VAGFA(血管内皮生长因子A)、VAGFB(血管内皮生长因子B)以及VAGFC(血管内皮生长因子C)及其任何组合。

与朊病毒病相关的蛋白质的实例可以包括SOD1(超氧化物歧化酶1)、ALS2(肌萎缩性侧索硬化2)、FUS(融合在肉瘤中)、TARDBP(TAR DNA结合蛋白)、VAGFA(血管内皮生长因子A)、VAGFB(血管内皮生长因子B)以及VAGFC(血管内皮生长因子C)及其任何组合。

与朊病毒病症中的神经退行性疾病相关的蛋白质的实例可以包括例如A2M(α-2-巨球蛋白)、AATF(凋亡拮抗转录因子)、ACPP(前列腺的酸性磷酸酶)、ACTA2(肌动蛋白α2平滑肌主动脉)、ADAM22(ADAM金属肽酶结构域)、ADORA3(腺苷A3受体)或ADRA1D(α-1D肾上腺素能受体(Alpha-1D adrenergic receptor或Alpha-1D adrenoreceptor))。

与免疫缺陷相关的蛋白质的实例可以包括例如A2M[α-2-巨球蛋白]；AANAT[芳烷基胺N-乙酰转移酶]；ABCA1[ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员1]；ABCA2[ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员2]；或ABCA3[ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员3]。

与三核苷酸重复障碍相关的蛋白质的实例包括例如AR(雄激素受体)、FMR1(脆性X智力迟钝1)、HTT(亨廷顿蛋白)或DMPK(强直性肌营养不良蛋白激酶)、FXN(弗氏共济失调蛋白(frataxin))、ATXN2(共济失调蛋白2)。与神经传递障碍相关的蛋白质的实例包括例如SST(生长抑素)、NOS1(一氧化氮合酶1(神经元的))、ADRA2A(肾上腺素能的，α-2A-，受体)、ADRA2C(肾上腺素能的，α-2C-，受体)、TACR1(速激肽受体1)或HTR2c(5-羟色胺(血清素)受体2C)。神经发育相关序列的实例包括例如A2BP1[共济失调蛋白2-结合蛋白1]、AADAT[氨基己二酸氨基转移酶]，AANAT[芳烷基胺N-乙酰转移酶]、ABAT[4-氨基丁酸氨基转移酶]、ABCA1[ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员1]或ABCA13[ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员13]。可用本发明系统治疗的优选病症的另外的实例可以选自：艾卡迪-古铁雷斯综合征(Aicardi-Goutières Syndrome)；亚历山大病；阿伦-赫恩登-达德利综合征(Allan-Herndon-Dudley Syndrome)；POLG相关障碍；α-甘露糖苷贮积症(II和III型)；阿尔斯特伦综合征(Syndrome)；安格曼；综合征；共济失调-毛细血管扩张；神经元蜡样-脂褐质沉积；β-地中海贫血；双侧视神经萎缩和1型(婴儿)视神经萎缩；视网膜母细胞瘤(双侧的)；卡纳万病(Canavan Disease)；脑-眼-面-骨骼综合征(CerebrooculofacioskeletalSyndrome)1[COFS1]；脑腱黄瘤病；科尼利亚迪兰吉综合征(Cornelia de LangeSyndrome)；MAPT相关障碍；遗传性朊病毒病；德拉韦综合征(Dravet Syndrome)；早期发病家族性阿尔茨海默病；弗里德赖希共济失调[FRDA]；多发性畸形；岩藻糖苷贮积症；福山(Fukuyama)先天性肌营养不良；半乳糖唾液酸贮积症；戈谢病(Gaucher Disease)；有机酸血症；噬血细胞淋巴组织细胞增生症；早衰症；粘脂贮积症II；婴儿游离唾液酸贮积病；PLA2G6相关神经变性；耶韦尔和朗格-尼尔森综合征(Jervell and Lange-NielsenSyndrome)；结合性大疱性表皮松解；亨廷顿病；克拉伯病(Krabbe Disease)(婴儿的)；线粒体DNA相关雷吉综合征(Mitochondrial DNA-Associated Leigh Syndrome)和NARP；莱施-奈恩综合征；LIS1相关无脑回；洛氏综合征(Lowe Syndrome)；槭糖尿病；MECP2复制综合征；ATP7A相关铜转运障碍；LAMA2相关肌营养不良；芳基硫酸酯酶A缺乏；I、II或III型粘多糖贮积症；过氧化物酶体生物发生障碍，齐薇格谱系综合征(Zellweger Syndrome Spectrum)；伴随脑铁累积障碍的神经变性；酸性鞘磷脂酶缺乏；C型尼曼-皮克病；甘氨酸脑病；ARX相关障碍；尿素循环障碍；COL1A1/2相关成骨不全；线粒体DNA缺失综合征；PLP1相关障碍；佩里综合征(Perry Syndrome)；费伦-麦克德米德综合征(Phelan-McDermid Syndrome)；II型糖原贮积症(蓬佩病(Pompe Disease))(婴儿的)；MAPT相关障碍；MECP2相关障碍；1型肢近端型点状软骨发育不全(Rhizomelic Chondrodysplasia Punctata Type 1)；罗伯茨综合征(Roberts Syndrome)；桑德霍夫病(Sandhoff Disease)；辛德勒病(Schindler Disease)-1型；腺苷脱氨酶缺乏；史-伦-奥三氏综合征；脊髓性肌萎缩；婴儿发病脊髓小脑性共济失调；己糖胺酶A缺乏；1型致死性发育不良；胶原VI型相关障碍；I型乌谢尔综合征(UsherSyndrome)；先天性肌营养不良；沃尔夫-赫奇霍恩综合征(Wolf-Hirschhorn Syndrome)；溶酶体酸脂酶缺乏；以及着色性干皮病。

如将是显而易见的，设想的是可以使用本发明系统靶向任何感兴趣的多核苷酸序列。使用本发明系统进行治疗可能是有用的病症或疾病的一些实例被包括在本文的表中并且当前与那些病症相关的基因的实例也被提供于此。然而，示例的基因并不是穷尽性的。

实例

以下实例出于说明本发明的不同实施例的目的而给出并且并不意在以任何方式限制本发明。本发明实例连同在此描述的方法目前代表优选的实施例，是示例性的，并且并不旨在限制本发明的范围。涵盖在如由权利要求书的范围所定义的本发明的精神内的在此的变化以及其他用途是本领域普通技术人员可以想到的。

实例1：使用CRISPR-Cas9在哺乳动物脑中的基因功能的体内探询

斯维奇(Swiech)，L.等人的标题为“使用CRISPR-Cas9在哺乳动物脑中对基因功能进行体内探询(In vivo interrogation of gene function in the mammalian brainusing CRISPR-Cas9).”《自然生物技术》(Nat Biotechnol.)2014年10月19日.doi:10.1038/nbt.3055.[电子出版先于印刷]的公开通过引用并入本文。此工作呈现以下主要点：

·第一次证实了在有丝分裂后神经元中体内成功的AAV-介导的Cas9递送连同高效的基因组修饰；

·开发了使得能够容易从表达Cas9和sgRNA的细胞分离神经元核的核标记技术；

·证实了针对神经元转录组的RNAseq分析的应用；

·将电生理学研究与Cas9-介导的基因组干扰整合；以及

·并且证实了多元靶向以及使用Cas9-介导的基因组编辑研究关于啮齿动物行为的基因功能的能力。

携带疾病相关突变的转基因动物模型对于研究神经障碍是极其有用的，有助于阐明疾病的遗传机制和病理生理学机制。然而，产生携带单一或多个基因修饰的动物模型是特别劳动密集的并且需要经过多个世代的耗时的育种。因此，为了协助在正常和疾病相关脑过程中基因功能的快速剖析，申请人需要准确且高效地在体内操纵神经元的基因组的能力。已经显示来自化脓链球菌的CRISPR-相关内切核酸酶Cas9(SpCas9)介导正复制的真核细胞中单基因和多基因的准确且高效的基因组切割，导致移码插入/缺失(indel)突变。在此，申请人将Cas9-介导的基因组干扰与生物化学、测序、电生理学、以及行为读出进行整合，以研究体内单独基因以及基因群在神经过程中的功能以及它们在脑障碍中的作用。

讨论

腺相关病毒(AAV)载体常用于将重组基因递送进小鼠脑中。AAV系统的主要限制是其小的包装尺寸，以大约4.5kb加帽，不含ITR，这限制了可以包装进单一载体内的基因材料的量。由于SpCas9的大小已经是4.2kb，在单一AAV载体内剩下少于0.3kb用于其他基因元件，申请人设计了将SpCas9(AAV-SpCas9)和sgRNA表达盒(AAV-SpGuide)包装在两种单独的病毒载体上的双载体系统(图1)。在设计AAV-SpCas9载体时，申请人比较了不同的短神经元特异性启动子连同多聚腺苷酸化信号来优化SpCas9表达。对于申请人的最终设计，申请人选择了小鼠Mecp2启动子(235bp，pMecp2)和最小多聚腺苷酸化信号(48bp，spA)，所基于的是它们在培养的初级小鼠皮层神经元中实现足够水平的SpCas9表达的能力(图5c)。为了促进对表达SpCas9的神经元进行免疫荧光鉴定，申请人用HA-表位标签标记SpCas9。对于AAV-SpGuide载体，申请人包装U6-sgRNA表达盒连同与KASH核跨膜结构域9融合的由人类突触蛋白I启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)(图1a)。该GFP-KASH融合蛋白将GFP指导到外部核膜(图5c,d)，并且使得能够进行基于荧光的鉴定和经AAV-SpGuide转导的完整神经元核的纯化。

为了测试申请人的双载体递送系统的递送功效，申请人首次将培养的初级小鼠皮层神经元在体外经AAV-SpCas9和AAV-SpGuide转导，并且观察到稳固的表达(图5c)，其中具有大于80％的共转导效率(图5e)。重要的是，与未转导的神经元相比，SpCas9的表达不会不利地影响转导的神经元的形态学和存活率(图5c,f)。

已经建立一种高效的递送系统后，申请人接下来寻求测试在小鼠初级神经元中SpCas9-介导的基因组编辑。然而SpCas9已经用来实现在多种分裂细胞类型中高效的基因组修饰，尚未清楚的是SpCas9是否能用于在有丝分裂后神经元中高效地实现基因组编辑。对于申请人的初始测试，申请人靶向Mecp2基因，该基因在雷特综合征(一种自闭症谱系障碍)中发挥主要作用。MeCP2蛋白普遍表达于遍及脑的神经元中，但几乎不存在于神经胶质细胞中，并且它的缺陷已经显示与神经元中严重的形态学和电生理学表型相关，并且认为两者可促成患有雷特综合征的患者中观察到的神经症状。为了靶向Mecp2，申请人首先设计了几种靶向小鼠Mecp2基因的外显子3的sgRNA(图6a)，并且使用Neuro-2a细胞评价了它们的功效。使用SURVEYOR核酸酶测定来鉴定出最高效的sgRNA(图6b)。申请人选择最有效的sgRNA(Mecp2靶标5)用于随后的体外和体内Mecp2靶向实验。

为了评估在神经元中申请人的双载体系统的编辑效率，申请人在体外7天转导初级小鼠皮层神经元(7DIV，图7a)，并且在转导后7天使用SURVEYOR核酸酶测定测量indel比率(图7b)。注意到，用靶向Mecp2的AAV-SpCas9和AAV-SpGuide共转导的神经元培养物示出与对照神经元相比MeCP2蛋白水平高达80％的降低(图7c,d)。对于观察到的在相对低indel频率(约14％)与稳固的蛋白耗尽(约80％)之间的矛盾，一种可能的解释可以是在靶位点处仅由SpCas9的结合可以干扰转录，这已经在大肠杆菌中示出。申请人使用具有失活的RuvC和HNH催化结构域两者的SpCas9的突变体研究了这个可能性(D10A和H840A，dSpCas9)。dSpCas9和靶向Mecp2的sgRNA的共表达没有降低MeCP2蛋白水平(图7a,d)，表明在活性SpCas9的存在下观察到的MeCP2水平的降低是由于Mecp2座位中的修饰的发生。对于在检测到的低水平indel与高水平蛋白耗尽之间的矛盾，另一种可能的解释可以是由于通过SURVEYOR核酸酶测定低估了实际indel比率-已经在先前显示SURVEYOR的检测准确性对于indel序列组成是敏感的

已经在先前显示MeCP2功能缺失与神经元中的树突树异常和树突棘形态发生缺陷相关联。MeCP2损失的这些表型也已经重现在从MeCP-KO iPS细胞分化的神经元中。因此，申请人研究在神经元中SpCas9-介导的MeCP2-耗尽是否可以类似地重演雷特综合征的形态学表型。的确，当与对照神经元相比时，共表达了SpCas9和靶向Mecp2的sgRNA的神经元展现出改变的树突树形态学和树突棘密度(图8)。这些结果证实在细胞测定中可以使用SpCas9以通过使得在有丝分裂后神经元中能够进行靶向敲除而协助基因功能的研究。

考虑到由异质细胞类型的错综复杂网络组成的神经系统的复杂性，能够高效地编辑体内神经元的基因组将使得能够指导对嵌入在天然背景中的相关细胞类型中的基因功能的测试。因此，申请人立体定向地将高滴度AAV-SpCas9和AAV-SpGuide的混合物(1:1比率)注射入成年小鼠的海马体齿状脑回中。申请人观察到，在病毒注射后4周，在海马体颗粒细胞中两种载体的高的共转导效率(超过80％)(图1b,c)，导致Mecp2座位的基因组修饰。(图1d)。使用SURVEYOR核酸酶测定，申请人在获得自经注射的脑区域的脑打孔样品(brainpunch)中检测到约13％的indel频率(图1e)。类似于申请人在培养的初级神经元中发现的，SpCas9-介导的对Mecp2座位的切割高效地以超过60％降低了MeCP2蛋白水平(图1f)。此外，与单独的AAV-SpCas9相比，当用AAV-SpCas9和AAV-SpGuide注射时，在齿状脑回中MeCP2-阳性核的数目降低超过75％(图1g-h)。这些结果表明SpCas9可用于直接扰动完整生物背景内的特定基因。

靶向的基因组干扰可以与定量读出偶联，以提供关于特定基因组元件的生物学功能的见解。为了协助对于经AAV-SpCas9和AAV-SpGuide转导的细胞的分析，申请人开发了一种使用荧光激活细胞分选术(FACS)纯化GFP-KASH标记的核的方法(图2a)。可以将分选的核直接用于纯化核DNA和RNA，以用于下游生物化学或测序分析。使用桑格测序，申请人发现14个单一GFP阳性细胞核中有13个包含sgRNA靶位点处的indel突变。

除了基因组DNA测序外，还可以使用纯化的GFP-阳性核以用于RNAseq分析以研究MeCP2耗尽的转录结果(图2b和图9)。为了测试Mecp2敲除对来自齿状脑回的神经元的转录的影响，申请人使用来自接收了AAV-SpCas9连同对照sgRNA(该对照sgRNA已经被设计为靶向细菌lacZ基因并且不是小鼠基因组)或靶向Mecp2的sgRNA的动物的、经FACS纯化的GFP⁺核制备了RNAseq文库。所有的sgRNA已经被优化为最小化它们的脱靶得分(CRISPR设计工具：http://tools.genome-engineering.org)。申请人能够发现在对照与Mecp2sgRNA表达核之间差异性表达(p<0.01)的基因(图2b)。申请人在基因中鉴定出一些感兴趣的在表达Mecp2sgRNA的核中下调的候选物：Hpca、Olfm1、和Ncdn，已经在先前报道它们在学习行为中发挥着重要作用；以及Cplx2，已经示出它涉及突触泡释放并且与神经元放电率相关。这些结果证实，SpCas9-介导的基因组干扰和群体水平RNAseq分析的组合提供了一种用以表征神经元中的转录调节并且表明对于特定神经元功能或疾病过程可以是重要的基因的方式。

在脑中SpCas9-介导的体内基因组编辑还可以与电生理学记录来偶联，以研究基因组干扰对特定细胞类型或回路组分的影响。为了研究MeCP2耗尽对神经元生理学的功能性作用，申请人立体定向地将靶向Mecp2的AAV-SpCas9和AAV-SpGuide共递送到雄性小鼠的初级视觉皮层(V1)的浅层。选择V1，是因为该浅层皮质兴奋性神经元对于双光子成像和双光子指导的靶向记录是更加可及的。在SpCas9递送后两周，使小鼠经受双光子指导的近细胞记录(图3)，以比较在小鼠V1的2/3层中KASH-GFP⁺神经元和GFP^-邻近神经元的电生理学响应(图3a-c)。申请人以20度增量测量了对18个漂移光栅的神经元响应，并且通过平均化响应计算了细胞的由载体诱发的放电率(FR)和取向选择性指数(OSI)。与邻近的GFP^-兴奋性神经元相比，对于兴奋性GFP⁺的MeCP2敲除神经元的FR和OSI两者均显著降低(图3d-e)。相比之下，当与邻近的未感染的神经元相比时，对照sgRNA表达连同SpCas9不具有对FR和OSI的任何作用(图3d-e)。这些结果显示在两周内，在成年V1皮层神经元中SpCas9介导的对MeCP2的耗尽改变体内兴奋性神经元的视觉响应特性，并且进一步证实了SpCas9在协助体内哺乳动物脑中的靶基因敲除中以用于研究神经元回路的基因功能和剖析的多功能性。

SpCas9系统的一个关键优点是它能够促进多元基因组编辑。在活体动物的脑中引入多基因的稳定敲除将具有潜在深远的应用，例如在生理和神经病理病症中多基因机制的因果探询。为了测试脑中多元基因组编辑的可能性，申请人设计了多元sgRNA表达载体，该载体由三种串联的sgRNA连同用于核标记的GFP-KASH一起组成(图4a)。申请人选择了靶向DNA甲基转移酶基因家族(DNMT)的sgRNA，该家族由Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b组成。Dnmt1和Dnmt3a高度表达于成年脑中，并且先前显示DNMT活性改变DNA甲基化，并且Dnmt3a和Dnmt1两者对于突触可塑性以及学习和记忆形成是必要的。申请人设计了具有高修饰效率的针对Dnmt3a和Dnmt1的单独sgRNA。为了避免由Dnmt3b带来的任何潜在补偿效应，申请人决定还额外地靶向该基因，即使它主要在神经发育期间表达。申请人最终选择单独sgRNA用于对所有三种靶向基因进行同时的DNA切割(图4b和图10)。

为了测试体内多元基因组编辑的功效，申请人立体定向地将高滴度AAV-SpCas9和AAV-SpGuide的混合物递送到雄性成年小鼠的背侧和腹侧齿状脑回中。4周后，将海马体解剖并且经FACS分选靶细胞核。申请人通过使用SURVEYOR核酸酶测定(图4c)并且测序(图11)检测到在分选的核群体中约19％(Dnmt3a)、18％(Dnmt1)和4％(Dnmt3b)的indel频率。靶向多个座位提出了关于在单独细胞中多重敲除的有效率的问题。通过使用单一核分选与靶向测序的组合，申请人量化了对单独神经元核中的多个DNMT座位的同时靶向(图4d)。在至少一个Dnmt座位中携带修饰的神经元核中，多于70％的核包括Dnmt3a和Dnmt1两者中的indel(约40％在所有3个座位处包含indel，并且约30％在Dnmt3a和Dnmt1两个座位处包括indel)。这些结果符合齿状脑回中的Dnmt3a和Dnmt1蛋白耗尽水平(图4e)。由于在成年脑中Dnmt3b的低表达，申请人不能检测Dnmt3b蛋白。

近来对SpCas9的研究已经示出，虽然在20-nt sgRNA序列内的每个碱基均贡献于总体的特异性，部分地匹配sgRNA的基因组座位可以导致脱靶双链断裂和indel形成。为了评估脱靶修饰的比率，申请人用计算机鉴定了一系列高度相似的基因组靶位点²，并且使用靶向深度测序定量修饰比率。最常见被预测的脱靶座位的Indel分析揭示0-1.6％的indel形成比率，证实SpCas9修饰是特异性的(附表1)。为了增加在体内SpCas9-介导的基因组编辑的特异性，未来研究可以使用脱靶最小化策略例如形成双切口以及截短的sgRNA。

Dnmt3a和Dnmt1的敲低已经在先前示出影响海马体依赖的记忆形成²⁷。因此，申请人进行了情境性恐惧条件反射行为测试，以研究SpCas9-介导的三重敲除(Dnmt3a、Dnmt1和Dnmt3b)对记忆获得和巩固的影响。虽然申请人未观察到在对照与三重敲除小鼠之间在记忆获得阶段中的任何区别，当在训练情境条件下测试时敲除小鼠示出受损的记忆巩固(图4f)。当小鼠在改变的情境下测试时这一效应消除。申请人的结果证实在齿状脑回神经元中CRIPSR-Cas9-介导的DNMT家族成员的敲除足以探测行为任务中的基因的功能。

申请人的结果证实AAV-介导的体内递送SpCas9和sgRNA提供了用于实现在完整神经回路内的精确基因组干扰的快速且有力的技术。而SpCas9已经广泛用于工程化分裂细胞，申请人证实了SpCas9还可以用来经由NHEJ-介导的indel产生高效地工程化有丝分裂后神经元的基因组。Cas9-介导的基因组干扰可以与生化、测序、电生理学、和行为分析相组合以研究靶向的基因组元件的功能。申请人证实了SpCas9-介导的靶向单个或多个基因可以重演使用经典的更耗时的遗传小鼠模型观察到的形态学、电生理学、和行为表型。当前研究采用了化脓链球菌Cas9可以用于实现细胞类型特异性靶向，该化脓链球菌Cas9不仅使得对两种AAV载体的使用成为必需，而且限制了启动子元件的大小。在给定Cas9直系同源物的多样性的情况下，其中一些直系同源物大幅短于SpCas9，应该可能的是对表达Cas9和sgRNA两者的单一AAV载体工程化，如在此所述。

方法

DNA构建体

对于SpCas9靶标选择和单一指导RNA(sgRNA)的产生，将20-nt靶序列选择为在5′-NGG PAM序列之前。为了最小化脱靶效应，使用CRIPSR设计工具(http://tools.genome-engineering.org)。使用U6启动子作为模板，经PCR扩增sgRNA，使用的正向引物为：5’-cgcacgcgtaattcgaacgctgacgtcatc-3’，并且包含具有20-nt DNA靶位点(加粗)的sgRNA的反向引物为：5’-cacacgcgtAAAAAAgcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctaTTTCtagctctaaaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3’.(SEQID NO:)对照sgRNA序列被设计为靶向来自大肠杆菌的lacZ基因：

靶序列：TGCGAATACGCCCACGCGATGGG(SEQ ID NO:)

EGFP-KASH构建体是来自沃尔曼教授(Prof.Worman)(哥伦比亚大学(ColumbiaUniversity)，纽约州(NYC))的慷慨礼物，并且用作用于将编码盒在人类突触蛋白启动子(hSyn)下克隆进AAV骨架的PCR模板。接着，使用MluI位点引入U6-Mecp2sgRNA编码序列。对于多基因靶向策略，如上所述PCR扩增单独的sgRNA。通过使用金门克隆策略将所有三种sgRNA与PCR扩增的hSyn-GFP-KASH-bGHpA盒(参见图1A)连接。在PCR扩增后，将包含3种sgRNA和hSyn-GFP-KASH-bGH pA的金门连接产物克隆进AAV骨架中。对所有获得的构建体进行测序验证。为了寻找用以在神经元中驱动SpCas9表达的最佳启动子序列，申请人测试了：hSyn1、小鼠截短的Mecp2(pMecp2)以及截短的大鼠Map1b(pMap1b)启动子序列²(参见图5a)。使用以下引物来扩增启动子区域：

hSyn_F：5’-GTGTCTAGACTGCAGAGGGCCCTG-3’；(SEQ ID NO:)

hSyn_R：5’-GTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGTCGAGAA-3’；(SEQ ID NO:)

Mecp2_F 5’-gagaagcttAGCTGAATGGGGTCCGCCTC-3’；(SEQ ID NO:)

Mecp2_R 5’-ctcaccggtGCGCGCAACCGATGCCGGGACC-3’；(SEQ ID NO:)

Map1b-283/-58_F 5’-gagaagcttGGCGAAATGATTTGCTGCAGATG-3’；(SEQ ID NO:)

Map1b-283/-58_R 5’-ctcaccggtGCGCGCGTCGCCTCCCCCTCCGC-3’.(SEQ ID NO:)

大鼠map1b启动子的另一种截短物是与以下寡聚物组装在一起：

5’-agcttCGCGCCGGGAGGAGGGGGGACGCAGTGGGCGGAGCGGAGACAGCACCTTCGGAGATAATCCTTTCTCCTGCCGCAGAGCAGAGGAGCGGCGGGAGAGGAACACTTCTCCCAGGCTTTAGCAGAGCCGGa-3’以及

5’-ccggtCCGGCTCTGCTAAAGCCTGGGAGAAGTGTTCCTCTCCCGCCGCTCCTCTGCTCTGCGGCAGGAGAAAGGATTATCTCCGAAGGTGCTGTCTCCGCTCCGCCCACTGCGTCCCCCCTCCTCCCGGCGCGa-3’。(SEQ IDNO:)

将短的合成多聚腺苷酸化信号(spA)³使用以下寡聚物进行组装：5’-aattcAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTgc-3’(SEQ>

5’-ggccgcACACAAAAAACCAACACACAGATCTAATGAAAATAAAGATCTTTTATTg-3’。(SEQ IDNO:)

先前描述了SpCas9和其D10A突变体形式(dSpCas9)^4,5。将编码红色荧光蛋白(mCherry)的在EF1α启动子控制下的质粒用于采用2000(生命技术公司)的神经元转染。

细胞系培养物和转染

Neuro-2a(N2a)细胞生长在含有5％胎牛血清(BSA)的DMEM中。对于HEK293FT细胞，使用了含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM。将细胞保持在37℃、5％CO₂气氛中。根据制造商的方案使用2000或聚乙烯亚胺(Polyethylenimine)(PEI)“MAX”试剂(波利塞斯公司)转染细胞。

浓缩的AAV载体的生产

使用等比例的AAV1和AAV2血清型质粒以及pDF6辅助质粒产生高滴度AAV1/2粒子，并且在肝素亲和柱上进行纯化⁶。通过qPCR确定病毒粒子的滴度。高滴度AAV1粒子是由UNC载体核心服务部(UNC>7。简言之，使用PEI“MAX”将HEK293FT细胞用转基因质粒、pAAV1血清型质粒和pDF6辅助质粒转染。将培养物在48h后收集，并且通过0.45μmPVDF过滤器(密理博)进行过滤。

初级皮层神经元培养

根据由MIT动物保护委员会(MIT CAC)批准的方案将用于获得神经元以用于组织培养的动物处死。从胚胎龄16天的小鼠脑制备原代培养物⁸。使用任一性别的胚胎。将细胞铺板在聚-D-赖氨酸(PDL)包被的24孔板(BD生物科学)或层粘连蛋白/PDL包被的盖玻片(VWR)上。使培养物在补充有B27、Glutamax(生命技术公司)和青霉素/链霉素混合物的Neurobasal培养基中在37℃和5％CO₂生长。对于AAV转导，将500μl>7的条件培养基孵育。转导一周后已经将神经元收获用于下游处理或固定在4％多聚甲醛中以用于免疫荧光染色或形态学分析。

对于神经元形态学的可视化，使用2000(生命技术公司)将在DIV7的细胞用EF1α-mCherry表达载体进行转染持续一周，如先前所述⁹。对于总树突长度的测量，使用ImageJ软件追踪单独神经元的所有树突。对用荧光显微镜在40x物镜下(蔡司(Zeiss)AxioCam>10。对于树突数目，对所有长于10μm的非-轴突突出物的末端进行计数。对于肖尔分析，将在直径上具有5μm梯级的同心圆自动地绘制在细胞体周围，并且使用具有肖尔插件的ImageJ软件对跨每个圆的树突的数目进行计数。

将AAV1/2立体定向地注射进小鼠脑中

MIT CAC批准了此处描述的所有动物程序。将成年(12-16周龄)雄性C57BL/6N小鼠通过腹膜内(i.p.)注射100mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪进行麻醉。给予先发止痛(Buprenex，1mg/kg，i.p.)。根据批准的程序进行开颅术，并且将1μl的1:1AAV混合物(1x1013Vg/ml的sMecp2-SpCas9；6x1012Vg/ml的DNMT 3xsgRNA；3-5x1012Vg/ml的hSyn-GFP-KASH)注射进：背侧齿状脑回(前/后：-1.7；中间外侧：0.6；背侧/腹侧：-2.15)和/或腹侧齿状脑回(前/后：-3.52；中间外侧：2.65；背侧/腹侧：-3)中。对于体内电生理学记录实验(图3)，病毒注射坐标是(前囱)侧面3mm和后部缝合线前面1mm。使用德雷梅尔钻子将头骨变薄，伴随偶尔用盐水冷却，并且将剩余的硬脑膜使用填充有悬浮于矿物油中的病毒的玻璃微量移液器穿刺。在相邻位点处在200-250μm的深度处进行若干次(3-4)注射。将体积为150-200nl的病毒混合物以75nl/min速率注射在每个位点。在每次注射后，该移液管保持在适当位置持续3-5分钟，之后再撤回以防止泄漏。对切口进行缝合，并且在手术后给予适当的术后镇痛剂(美洛昔康，1-2mg/kg)持续三天。

体内双光子指导的靶向松散膜片记录(loose patch recording)

病毒注射两周后，将小鼠用于电生理学实验。将小鼠用2％异氟烷麻醉，并且使用0.8％异氟烷维持。将皮肤切离，用sugi清洗，并且使用胶水和牙科用丙烯酸类将金属顶板附接到头骨上，并且将2mm x 2mm开颅术在初级视皮层(V1)上进行。然后将暴露的区域用在人工脑脊液(aCSF；140mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、0.01mM EDTA、10mMHEPES、10mM葡萄糖；pH 7.4)中的1.5％琼脂糖薄层覆盖。将抗体温度在实验期间用加热毯保持在37.5℃。使用萨特P-2000激光拉制仪(萨特仪器(Sutter Instruments))拉制硼硅酸盐移液管(WPI)。顶圆直径是1μm左右，而电阻是在3-5MΩ之间。使用Matlab(迈斯沃克公司(MathWorks))编写的控制MultiClamp 700B放大器(阿克森(Axon))的定制软件(网络棱镜(Network Prism)，苏尔实验室(Sur lab)进行记录。将玻璃移液管电极以20°-35°角度插入脑中，并且将Ag/AgCl接地电极片(华纳仪器(Warner Instruments))定位在与脑和目标相同的溶液中。对于荧光可视化，将移液管用亚历克萨荧光染料594(分子探针公司(Molecular Probes))填充。使用10x透镜将移液管首先靶向于注射部位，并且然后使用25x透镜经由在770nm处的同时双光子成像而靶向于单独的GFP+细胞。通过在快速的时变5mV指令电压脉冲期间在电压钳中观察到的阻力偏转来检测细胞接近度。一旦电阻已经增加5-10MΩ，则放大器切换至电流钳，并且尖峰在零注射电流的情况下在4KHz的贝塞尔过滤器和300Hz的AC过滤器下被记录。事后将病毒注射的脑进行灌注，并且进行免疫组织化学法。

视觉刺激和来自体内双光子指导的靶向松散膜片记录的数据分析

为了评估取向选择性和基因组被编辑的神经元的调谐，申请人使用MatlabPsychToolbox-3编写的定制软件呈现取向光栅。将光栅优化以用于细胞响应性，并且通过以20度梯级从0-360度分级取向来呈现，其中对于144秒的总呈现时长，每个光栅呈现的前面为持续4秒“关”，随后为4秒“开”。

将数据直接采集入Matlab中并保存为.mat文件。尖峰检测是经由使用人工定义的阈值的分析例程、随后使用尖峰形状模板匹配以用于进一步验证来进行的。将每个尖峰标记并且以图形用户界面显示在屏幕上，在该界面上它被实验者手动评论假阳性和阴性。然后将响应于每个刺激的尖峰时间基于它们相对于病毒刺激的时间设置而分组为“开”或“关”期，并且对于各个刺激的“开”尖峰递减在相等时期期间观察到的“关”尖峰数目。对于取向实验，#尖峰/刺激＝(#尖峰“开”)-(#尖峰“关”)，因为“开”和“关”时期是相同的持续时间。对于每一种感兴趣的细胞，使用这些方法来收集对于每个定向刺激(0至360度，以20度为梯级)的响应。然后对于每个试验将这些响应转变为取向对响应的“调谐曲线”。通过针对优选取向来取矢量平均值根据下式计算取向选择性指数(OSI)：

$>OSI=\frac{\sqrt{{\left({\Sigma }_{i}R\left({\theta }_i\right)\sin \left(2{\theta }_i\right)\right)}^2+{\left({\Sigma }_{i}R\left({\theta }_i\right)\cos \left(2{\theta }_i\right)\right)}^2}}{{\Sigma }_{i}R\left({\theta }_i\right)}$>

组织制备和细胞核的纯化

将整个海马体或齿状脑回在冰冷的DPBS(生命科学公司)中快速解剖，并且冲击冷冻在干冰上。对于细胞核纯化，使用2ml Dounce均质机(西格玛公司)将组织在2ml冰冷的匀化缓冲液(HB)(320mM蔗糖、5mM>2、10mM>TM密度梯度介质(西格玛公司)，该介质包含5mM>2、10mMTris>TM溶液的顶部。在10,100xg(7,500rpm)下将样品在4℃离心30min。去除上清液，并且将核沉淀轻柔地重悬于65mMβ-甘油磷酸盐(pH>2、25mM>

细胞核分选

将纯化的GFP-阳性(GFP⁺)和阴性(GFP^-)的完整核用DyeCycle^TM宝石红染色剂(1:500，生命技术公司)共标记，并且使用BD>+和GFP^-核收集在用1％BSA包被且包含400μl重悬缓冲液(65mMβ-甘油磷酸盐pH>2、25mM>

基因组DNA提取和SURVEYOR^TM测定

对于sgRNA的功能测试，将50％-70％汇合的N2a细胞用单一PCR扩增的sgRNA和SpCas9载体共转染。将仅用SpCas9转染的细胞充当阴性对照。转染后48h收获细胞，并且根据制造商的方案使用DNeasy血液&组织试剂盒(凯杰公司(Qiagen))提取DNA。为了从AAV1转导的初级神经元分离基因组DNA，在AAV转导后7天根据制造商的说明使用DNeasy血液&组织试剂盒。将分选的核或解剖的组织在裂解缓冲液(10mM Tris pH 8.0、10mM NaCl、10mMEDTA、0.5mM SDS、蛋白酶K(PK，1mg/ml)和RNA酶A)中在55℃裂解持续30min。接着，根据标准程序进行氯仿-苯酚提取，随后用乙醇沉淀DNA。最后将DNA重悬于TE缓冲液(10mM Tris pH8.0、0.1mM EDTA)中并且用于下游分析。通过SURVEYOR^TM核酸酶测定(转基因组学公司(Transgenomics)使用列于附表2中的PCR引物进行单独sgRNA的功能测试。如本文所述的，进行谱带强度定量。

RNA文库制备和测序

在SpCas9连同靶向Mecp2的指导物(4个动物)或SpCas9连同靶向lacZ的gRNA(4个动物)的双侧病毒递送后两周，将齿状脑回在冰冷的DPBS(生命科学公司)中快速解剖，并且立即转移至RNA-later溶液(安比昂(Ambion))中。24小时后将在4℃的组织移到-80℃。将100个靶向的神经元核的群体经FACS分选到10μl TCL缓冲液中，该缓冲液补充有1％2-巯基乙醇(凯杰公司)。在离心后，将样品被立即冷冻在-80℃。将RNA通过AMPure RNAcleanXPSPRI珠粒(贝克曼库尔特基因组公司(Beckman Coulter Genomics))按照制造商的说明进行纯化，并且用80％乙醇洗涤三次，省略最终洗脱。将带有捕获的RNA的珠粒进行空气干燥并且立即处理用于cDNA合成。将不具有核的样品用作阴性对照。在根据SMART-seq2方案的cDNA文库制备中，对于每个动物使用三个群体样品，总计24个群体样品，该方案仅将逆转录酶用0.1ul的Maxima H Minus酶(200U/ul，赛默飞世尔科技公司)替代，并且将PCR反应按比例缩小到25ul体积。使用内斯特里(Nextera)XT DNA样品制备试剂盒(亿明达(Illumina))采用以下修饰进行标记反应和最终的PCR扩增。所有反应体积以4倍按比例缩小，并且在PCR扩增步骤后通过取2.5ul的各个样品将文库聚池化。将池化的文库使用两轮0.7体积的AMPure XP SPRI珠粒清除物(bead cleanup)(贝克曼库尔特基因组公司)进行清洁并且进行尺寸选择。将样品加载在高灵敏度DNA芯片(安捷伦)上以检查该该文库的质量，而定量是用Qubit高灵敏度DNA试剂盒(英杰公司(Invitrogen))进行的。将池化的文库稀释到4nM和12pmol的最终浓度，并且使用亿明达Miseq以75bp配对末端读数(paired end reads)进行测序。

RNA文库数据分析

基于小鼠mm9UCSC基因组和已知的基因转录组¹³确立Bowtie2指数，并且使用Bowtie2采用以下命令行选项将配对末端读数直接地与这个指数进行比对：-q--phred33-quals-n>

免疫荧光染色

细胞培养：对于初级神经元的免疫荧光染色，在病毒递送后7天，在室温下将细胞用4％多聚甲醛(PFA)进行固定持续20分钟。在用PBS洗涤3次后，将细胞在室温下用在PBS中5％的正常山羊血清(NGS)(生命技术公司)、5％驴血清(DS)(西格玛公司)和0.1％Triton-X100(西格玛公司)进行封闭持续30分钟。将细胞与在2.5％NGS、2.5％DS和0.1％Triton-X100中的一级抗体在室温下孵育1小时，或在4℃孵育过夜。在用PBST洗涤3次后，将细胞与二级抗体在室温下孵育1小时。最后，将盖玻片使用具有DAPI的VECTASHIELD HardSet封固剂(Mounting Medium)(载体实验室(Vector Laboratories))进行封固，并且使用蔡司(Zeiss)AxioCam Ax10显微镜和Axiocam MRm摄像机进行成像。使用Zen 2012软件(蔡司)处理图像。通过使用ImageJ软件1.48h和神经元检测器插件(Neuron detector plugin)进行定量。在病毒递送后4周将小鼠通过致死剂量的氯胺酮/甲苯噻嗪处死，并且依次心脏灌注PBS、PFA。将固定的组织使用振动切片机(莱卡(Leica)，VT1000S)进行切片。接着，将30μm切片在柠檬酸钠缓冲液(10mM脱水柠檬酸三钠，0.05％吐温20，pH 6.0)中煮沸2min，并且在室温下冷却20min。将切片用在TBST(137mM NaCl，20mM Tris pH 7.6，0.2％吐温-20)中的4％正常山羊血清(NGS)封闭1小时。使用薄片切片机(莱卡RM2125RTS)将石蜡切片切到8μm，并且如先前所述进行染色。将切片与稀释于具有4％NGS的TBST中的一级抗体在4℃孵育过夜。在TBST中洗涤3次后，将样品与二级抗体孵育。在用TBST洗涤3次后，将切片使用具有DAPI的VECTASHIELD HardSet封固剂进行封固，并且用共聚焦显微镜(蔡司LSM 710，Ax10ImagerZ2，Zen 2012软件)可视化。使用以下一级抗体：兔抗-Dnmt3a(圣克鲁兹(SantaCruz)，1:100)；兔抗-MeCP2(密理博，1:200)；小鼠抗-NeuN(密理博公司，1:50-1:400)；鸡抗-GFAP(艾碧康，1:400)；小鼠抗-Map2(西格玛，1:500)；鸡抗-GFP(阿维斯实验室(Aveslabs)，1:200-1:400)；小鼠抗-HA(细胞信号传导，1:100)。二级抗体：亚历克萨荧光染料488、568或633(生命技术公司，1:500-1:1,000)。

测定的定量

根据制造商的说明使用测定(生命技术公司)对对照和转导的初级神经元进行染色。为了避免来自GFP-KASH表达的GFP信号的干扰，将细胞仅针对DEAD(乙锭均二聚物)和DAPI(所有细胞)进行染色。将染色的细胞使用荧光显微镜进行成像，并且通过使用ImageJ 1.48h软件和神经元检测器插件对DEAD、GFP和DAPI阳性细胞进行计数。

Western印迹分析

将转导的初级皮层神经元(24孔，在病毒递送后7天)和转导的组织样品(在病毒递送后4周)用50μL的冰冷的RIPA缓冲液(细胞信号传导公司(Cell Signaling))进行裂解，该缓冲液包含0.1％SDS和蛋白酶抑制剂(罗氏，西格玛)。在Bioruptor声处理器(戴基诺德(Diagenode))中对细胞裂解物进行声处理持续5min，并且使用BCA蛋白测定试剂盒(皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology,Inc.))确定蛋白浓度。将蛋白裂解物溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中，在还原条件下在4％-15％Tris-HCl凝胶(伯乐公司)上进行分离，并且通过Western印迹进行分析，该Western印迹使用一级抗体：兔抗-Dnmt3a(圣克鲁兹(SantaCruz)，1:500)、小鼠抗-Dnmt1(罗福斯生物制剂(Novus Biologicals)，1:800)、兔抗-Mecp2(密理博，1:400)，兔抗-微管蛋白(细胞信号传导公司，1:10,000)，随后使用二级抗-小鼠和抗-兔HRP抗体(西格玛-奥德里奇公司，1:10,000)。将GAPDH直接地用兔HRP偶联的抗-GAPDH抗体(细胞信号传导公司，1:10,000)可视化。微管蛋白或GAPDH充当上样对照。将印迹用具有ImageLab 4.1软件的ChemiDoc^TMMP系统(BioRad)成像，并且使用ImageJ软件1.48h进行定量。

延迟性情境性恐惧条件反射(DCFC)

在双侧SpCas9/DNMT 3xsgRNA递送到12周龄C57BL/6N雄性小鼠的背侧和腹侧的齿状脑回中后8周，使动物对实验者和行为室适应7天。将注射SpCas9/GFP-KASH的同窝仔充当对照。在DCFC的第1天，测试之前和之后将小鼠笼子放置在隔离的接待室中以使小鼠离开听觉线索。将单独的小鼠放置到FC腔室(医学联合公司(Med Associates Inc.))并且进行12min的适应期。在适应之后，将小鼠放回它们的家笼中。第二天(训练日)，将单独的小鼠放置在该腔室中，并且允许适应4分钟。在另一个20秒(音调前)间隔后，85dB、2.8kHz水平的音调(听觉线索)呈现20秒，随后为18秒延迟间隔，之后呈现电击足底(0.5mA，2秒)。在电击足底之后，40秒间隔(音调后/电击)先于下一个起始于20秒音调前时期的相同试验。将训练试验重复6次，之后将小鼠放回它们的家笼中。在第3天(测试日)，将小鼠首先放置在条件化情境腔室中持续3分钟。接着，小鼠经历4x 100秒测试试验，这些试验起始于20秒间隔，之后为20秒音调和60秒音调后间隔。最后，将小鼠放置在改变的情境条件化腔室中(平地板对网格、四聚体腔室对七聚体腔室，香草醛气味)，并且重复该测试试验。对木僵行为进行记录，并且手动地进行盲离线分析(blind off-line)并用诺达思(Noldus)EthoVision XT软件(诺达思信息技术(Noldus Information Technology))证实。

深度测序分析和indel检测

使用CRISPR设计工具(http://crispr.mit.edu/)以发现针对脑中由CRISPR-SpCas9靶向的DNMT家族基因而言潜在的脱靶。在病毒递送后12周将来自齿状脑回的靶细胞核经FACS分选，并且将基因组DNA如以上所述的进行纯化。对于每个感兴趣基因，将在CRISPR靶位点侧翼的基因组区通过融合PCR方法进行扩增，以将亿明达P5适配子连同唯一样品特异性条形码附接至靶扩增子(对于中靶-和脱靶-引物，参见附表3)。将带条形码并纯化的DNA样品通过Qubit 2.0荧光计(生命技术公司)定量并且以等摩尔比率池化。然后用亿明达MiSeq个人测序仪(生命技术公司)对测序文库进行测序，其中读数(read)长度为300bp。如先前在¹⁵中所述的对MiSeq读数进行分析。简言之，将读数通过Phred质量(Q分)进行过滤，并且使用史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法与靶位点的上游和下游50个核苷酸的基因组区域进行比对。Indel被估计处于从靶位点(总共30bp)的上游5个核苷酸到下游5个核苷酸的比对区域中。使用针对每个样品的阴性对照将indel的包含或排除估计为假定的切割事件。申请人使用来自阴性对照样品的数据的每靶区域每读数误差率(per-target-region-per-read>

统计分析

以最少两个独立生物重复进行所有实验。使用学生双尾t-检验用Prism6(GraphPad)进行统计。

附表1.对于DNMT靶向的脱靶分析

附表2.在SURVEYOR测定中使用的PCR引物

附表3.用于中靶-和脱靶-基因组座位扩增的引物

实例2：体内视网膜疾病模型(小鼠色素性视网膜炎模型)

申请人展示了当被包装进AAV中时使用Cas9的基因组工程方法的体内有效性，并且已经成功地使用它修饰哺乳动物细胞中的内源基因组序列。申请人使用这个系统展示了遗传工程在神经元中的潜力，神经元代表人体内的一组关键的有丝分裂后细胞。申请人的研究强调了这种体细胞组织体内基因组工程通过校正小鼠模型中的与人类疾病色素性视网膜炎相关的突变的治疗潜力，该小鼠模型带有与人类患者中发现的类似遗传缺陷对应的突变。用于申请人的研究的小鼠品系是C57BL/6品系B6.129S6(Cg)-Rhotm1.1Kpal/J。选择这个小鼠品系，是因为这些小鼠在小鼠视紫红质(Rho)基因中的密码子23处携带CCC至CAC的核苷酸取代。这个密码子编码位置23处的组氨酸对苯丙氨酸的氨基酸取代P23H。P23H突变是常染色体显性色素性视网膜炎的最常见原因之一。Rho基因的基因组位置在小鼠染色体6上：115,931,927-115,938,829。申请人观察到对于定向突变而言纯合的小鼠能生存并且能育。通过cDNA测序色谱图检测突变型和野生型两种基因产物(mRNA)。杂合小鼠的表型模拟了在患有由P23H突变引起的常染色体显性色素性视网膜炎的患者中观察到的视网膜病变和进行性视网膜变性。到35日龄时，当与对照相比时，杂合子具有较短的视杆外节。在出生后第63天，杂合子具有较少的视杆细胞核(是在野生型小鼠中观察到的数目的一半)和减少的视杆外节长度。纯合小鼠到出生后第23天时展现出更严重的表型，外核层更薄、严重的光感器退化，并且到出生后第63天时，失去几乎所有光感器细胞。突变P23H蛋白的糖基化严重减少。

在小鼠品系B6.129S6(Cg)-Rhotm1.1Kpal/J中，将Cas9系统AAV递送到视网膜神经元中：

申请人选择靶向对于视网膜神经元的正常功能而言关键的基因Rho，并且在该靶标上诱导同源重组，以便使用腺相关病毒(AAV)递送cas9基因组工程工具和重组模板来校正相关的疾病相关突变P23H。申请人设计了三个靶标，P23H突变位点以橙色标记，并且单核苷酸突变C-A以红色标记。(参见图18A)。这种方法证明这个小鼠模型中的遗传突变的校正可以挽救疾病相关表型，并且进一步证明了在成体动物的神经元中进行基因组修饰的可行性。此外，本研究使用这种品系中的视网膜神经元作为模型系统提供了用于评估可以在神经元细胞类型中诱导的用于遗传工程目的的同源重组的水平的信息。实验设置是如在下表中所示的：

总计25只小鼠用来建立育种对，所以对于每种品系而言，总计＝100只小鼠用于该项研究。

AAV的视网膜注射：

将视网膜下注射用作递送途径。小鼠接受0.5-1微升的盐水溶液(0.9％氯化钠)的视网膜下注射，所述盐水溶液被加温至体温并且含有高达1E12病毒粒子。这些小鼠超过6周龄。使用加热垫和/或灯使保持温暖并且进行监测。每天监测动物的程序相关并发症的临床征兆。每只小鼠给予多达两次注射。

组织收集：

材料注射之后1至4周后，在从小鼠体内进行组织采样之前，将小鼠通过CO₂吸入法处死。针对成功的基因转染、基因组改变或毒性的迹象对组织进行分析。

实例3：用于色素性视网膜炎的体内治疗性基因组工程方法

指导物选择和体外验证

首先，如下所示地设计靶向人类基因组中的基因RHO的SaCas9的指导物。已经基于致病突变P23H的座位进行了选择。通过计算算法生成设计，以最大化引入最接近疾病突变位点的中靶切割的潜力，以便促进最高的治疗性基因校正效率和特异性。还针对其DNA酶I超敏性(HS)测定结果对指导物进行筛选，以便最大化对应于靶指导序列的基因组区域的可及性，由此增加体内递送之后的指导物的预期效率。选择了超过一种指导物并且然后使用Surveyor测定在培养的人类细胞(HEK 293FT)中进行体外筛选，以测量它们用于在靶基因组座位处诱导indel形成的效率。然后选择具有最高体外效率的指导物用于产生病毒和下游体内实验。图18A-B显示了RHO位点的指导物设计以及使用Surveyor测定的体外指导物筛选结果。

同源重组模板设计和验证

其次，为了在靶标处诱导同源重组以便使用同源定向修复校正相关的疾病相关突变P23H，基于未受影响的人类个体的野生型(正常)基因组序列合成HR载体。这个载体带有AAV包装信号，和具有多达5kb的总同源臂的正常形式的基因组序列：两个同源臂(左臂和右臂)在该序列的每一侧上，它们将靶突变位点P23H夹在中间，如下所示的。通过用编码SaCas9系统的相应载体与如在先前部分中测量的最佳指导物以1:1、1:3、1:5比率进行共转染来在体外对这个载体进行验证，然后使用限制性片段长度多态性测定(RFLP)测量靶座位P23H处的同源重组(HR)效率，并且因此验证HDR程序的最佳条件。

图19显示了RHO HR AAV载体。下文列出了负责用作同源重组模板的部分的特异性序列。

>Rho>

ACCAGAAAGTCTCTAGCTGTCCAGAGGACATAGCACAGAGGCCCATGGTCCCTATTTCAAACCCAGGCCACCAGACTGAGCTGGGACCTTGGGACAGACAAGTCATGCAGAAGTTAGGGGACCTTCTCCTCCCTTTTCCTGGATCCTGAGTACCTCTCCTCCCTGACCTCAGGCTTCCTCCTAGTGTCACCTTGGCCCCTCTTAGAAGCCAATTAGGCCCTCAGTTTCTGCAGCGGGGATTAATATGATTATGAACACCCCCAATCTCCCAGATGCTGATTCAGCCAGGAGCTTAGGAGGGGGAGGTCACTTTATAAGGGTCTGGGGGGGTCAGAACCCAGAGTCATCCAGCTGGAGCCCTGAGTGGCTGAGCTCAGGCCTTCGCAGCATTCTTGGGTGGGAGCAGCCACGGGTCAGCCACAAGGGCCACAGCCATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTACATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAGCTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGGCGGTATGAGCCGGGTGTGGGTGGGGTGTGCAGGAGCCCGGGAGCATGGAGGGGTCTGGGAGAGTCCCGGGCTTGGCGGTGGTGGCTGAGAGGCCTTCTCCCTTCTCCTGTCCTGTCAATGTTATCCAAAGCCCTCATATATTCAGTCAACAAACACCATTCATGGTGATAGCCGGGCTGCTGTTTGTGCAGGGCTGGCACTGAACACTGCCTTGATCTTATTTGGAGCAATATGCGCTTGTCTAATTTCACAGCAAGAAAACTGAGCTGAGGCTCAAAGAAGTCAAGCGCCCTGCTGGGGCGTCACACAGGGACGGGTGCAGAGTTGAGTTGGAAGCCCGCATCTATCTCGGGCCATGTTTGCAGCACCAAGCCTCTGTTTCCCTTGGAGCAGCTGTGCTGAGTCAGACCCAGGCTGGGCACTGAGGGAGAGCTGGGCAAGCCAGACCCCTCCTCTCTGGGGGCCCAAGCTCAGGGTGGGAAGTGGATTTTCCATTCTCCAGTCATTGGGTCTTCCCTGTGCTGGGCAATGGGCTCGGTCCCCTCTGGCATCCTCTGCCTCCCCTCTCAGCCCCTGTCCTCAGGTGCCCCTCCAGCCTCCCTGCCGCGTTCCAAGTCTCCTGGTGTTGAGAACCGCAAGCAGCCGCTCTGAAGCAGTTCCTTTTTGCTTTAGAATAATGTCTTGCATTTAACAGGAAAACAGATGGGGTGCTGCAGGGATAACAGATCCCACTTAACAGAGAGGAAAACTGAGGCAGGGAGAGGGGAAGAGACTCATTTAGGGATGTGGCCAGGCAGCAACAAGAGCCTAGGTCTCCTGGCTGTGATCCAGGAATATCTCTGCTGAGATGCAGGAGGAGACGCTAGAAGCAGCCATTGCAAAGCTGGGTGACGGGGAGAGCTTACCGCCAGCCACAAGCGTCTCTCTGCCAGCCTTGCCCTGTCTCCCCCATGTCCAGGCTGCTGCCTCGGTCCCATTCTCAGGGAATCTCTGGCCATTGTTGGGTGTTTGTTGCATTCAATAATCACAGATCACTCAGTTCTGGCCAGAAGGTGGGTGTGCCACTTACGGGTGGTTGTTCTCTGCAGGGTCAGTCCCAGTTTACAAATATTGTCCCTTTCACTGTTAGGAATGTCCCAGTTTGGTTGATTAACTATATGGCCACTCTCCCTATGGAACTTCATGGGGTGGTGAGCAGGACAGATGTCTGAATTCCATCATTTCCTTCTTCTTCCTCTGGGCAAAACATTGCACATTGCTTCATGGCTCCTAGGAGAGGCCCCCACATGTCCGGGTTATTTCATTTCCCGAGAAGGGAGAGGGAGGAAGGACTGCCAATTCTGGGTTTCCACCACCTCTGCATTCCTTCCCAACAAGGAACTCTGCCCCACATTAGGATGCATTCTTCTGCTAAACACACACACACACACACACACACACAACACACACACACACACACACACACACACACACACAAAACTCCCTACCGGGTTCCCAGTTCAATCCTGACCCCCTGATCTGATTCGTGTCCCTTATGGGCCCAGAGCGCTAAGCAAATAACTTCCCCCATTCCCTGGAATTTCTTTGCCCAGCTCTCCTCAGCGTGTGGTCCCTCTGCCCCTTCCCCCTCCTCCCAGCACCAAGCTCTCTCCTTCCCCAAGGCCTCCTCAAATCCCTCTCCCACTCCTGGTTGCCTTCCTAGCTACCCTC

Cas9基因组工程工具和重组模板的AAV递送

最后，针对cas9基因组工程工具和重组模板的体内腺相关病毒(AAV)递送，产生了具有血清型AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8(所有都是有效的)的病毒用于两者，通过梯度超速离心或色谱法进行纯化。然后，通过用于递送到光感器和RPE细胞中的视网膜下途径使用如在先前部分中确定的最佳条件注射病毒粒子。

详细注射方案

AAV的视网膜注射：通过注射高达1毫升的含有不同剂量的被加温至体温的AAV病毒粒子的盐水溶液(0.9％氯化钠)进行视网膜下注射。将这两种不同的AAV载体(一种针对SaCas9和一种针对HR模板)以不同比率(例如SaCas9与HR模板＝1:1、1:3或1:5)混合，以便确定最佳条件。用于注射的剂量可以低至总共1.5x 10E10载体基因组或高达总共1.5x10E11载体基因组。更高的剂量给出了更好的基因治疗有效性，但是由于对病毒载体注射的免疫应答可能导致更高的并发症几率。每天监测患者的程序相关并发症的临床征兆。此程序基本上遵循在以下公开中提供的指导：马奎尔(Maguire)A.M.等人《新英格兰医学杂志》(N Engl.J.Med.)2008年5月22日；358(21):2240-8.doi:10.1056/NEJMoa0802315.电子版2008年4月27日.用于莱伯先天性黑朦的基因转移的安全性和功效(Safety and efficacyof gene transfer for Leber’s congenital amaurosis).；Simonelli(Simonelli)F.等人《分子治疗学》(Mol.Ther.)2010年3月；18(3):643-50.doi:10.1038/mt.2009.277.电子版2009年12月1日.给予载体后1.5年中用于莱伯先天性黑朦的基因治疗是安全且有效的(Gene therapy for Leber’s congenital amaurosis is safe and effective through1.5years after vector administration).；马奎尔A.M.等人《柳叶刀》(Lancet.)2009年11月7日；374(9701):1597-605.doi:10.1016/S0140-6736(09)61836-5.电子版2009年10月23日.用于莱伯先天性黑朦的RPE65基因治疗的年龄依赖性效应：1期剂量递增试验(Age-dependent effects of RPE65gene therapy for Leber’s congenital amaurosis:aphase 1dose-escalation trial)。

注射后程序

注射后，针对任何免疫应答或不利影响对患者进行监测。至少4周之后，使用限制性片段长度多态性测定(RFLP)评估可以在眼部细胞类型中诱导的同源重组的水平。并且然后还评估了RP表型的减轻或恢复。

实例4：用于全色盲的体内治疗性基因组工程

指导物选择和体外验证

首先，如下所示地设计靶向人类基因组中的基因CNGA3和CNGB3的SaCas9的指导物。已经基于致病突变的座位进行了选择，即R277C和R283W(针对CNGA3)和1148delC(针对CNGB3)。通过计算算法生成设计，以最大化引入最接近疾病突变位点的中靶切割的潜力，以便促进最高的治疗性基因校正效率和特异性。还针对其DNA酶I超敏性(HS)测定结果对指导物进行筛选，以便最大化对应于靶指导序列的基因组区域的可及性，由此增加体内递送之后的指导物的预期效率。选择了超过一种指导物，这样使得可以在体外经由Surveyor测定对最有效的指导物进行测试。然后选择具有最高体外效率的指导物用于病毒产生和下游体内实验。图20A-B显示了CNGA3和CNGB3的指导物选择。

同源重组模板设计和验证

其次，为了在靶标处诱导同源重组以便使用同源定向修复校正相关的疾病相关突变，需要分别基于来自未受影响的人类个体的CNGA3和CNGB3基因的野生型(正常)基因组序列合成HR载体。

图21和22分别显示了CNGA3HR AAV载体和CNGB3HR AAV载体的图。这些载体带有AAV包装信号，和具有多达5kb的总同源臂的正常形式的基因组序列：两个同源臂(左臂和右臂)在该序列的每一侧上，它们将靶突变位点夹在中间，如下所示的。通过用编码SaCas9系统的相应载体与如在先前部分中测量的最佳指导物以1∶1、1∶3、1∶5比率进行共转染来在体外对这个载体进行验证，然后使用限制性片段长度多态性测定(RFLP)测量靶座位处的同源重组(HR)效率，并且因此验证HDR程序的最佳条件。

下文列出了负责用作同源重组模板的部分的特异性序列。

＞CNGA3HRAAV载体模板区

CTGCTGCCTGCTCTGTCCCCTTTAAGTATTGACATCCTCAAAACCCTCTTTGGAAAAAGCACAGGCCACAGATCTTACTGTGACTTGTGTTTCTTTCTCCTAGGTGTACCTTCAACCTTGATAAAAATAAACCTCTAAATCAATTGAGATCTGCCTCCGTCACTTTTTTTTTTTCAAAGACTCAGAGTCTCACTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGTAGTGGTGCGATCTTGGCTCATTGCACCCTCCACCTCCTGGGTTCAAGTGGTTCTCGTGCCTCAGCTTCCTGAGTAGCTGGGATTACAGGGGTGCACCACCACATCTGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCACCATGTTGCCCAGGCTGGTCTCAAACCCTTGACCTCAGGTGATCCACCCGCCTCGGCCTCTCAAAGTACTGGGATTATAGGCATGAGCCACGGCACCCGGCCCTCTGTCACTTTTTGATTTACAACATGTATCTCTAATTTTAAAGGATCCTTTTTTAAAATATGTATATAATTTCCATTTATCTTTTAAAATTTAATAATCATTCTTTGTTATCATGTAATACCCAATTTATATTTAAATTTACTCAATCAACCTATGTTTTAAAAAAATTCAATAGAATAGATTAGAACCTCATAGAATAGAAAATATCAGAGTGCATTTCCTGTAGTAATGGTAAGTGTTGTTTTTGAAATCATTTCTATTATATATGTATCACTGCATACTGTGTAGCCGTGAGGTAAAATATGTTTCTTTGTACTATGGTCAAAAAAAGTCAGCCTCTGTGATGCCCAATGACCTCCATCTTCTTCTTTAGGTTTTCTCGAGCAAGGCTTAATGGTCAGTGATACCAACAGGCTGTGGCAGCATTACAAGACGACCACGCAGTTCAAGCTGGATGTGTTGTCCCTGGTCCCCACCGACCTGGCTTACTTAAAGGTGGGCACAAACTACCCAGAAGTGAGGTTCAACCGCCTACTGAAGTTTTCCCGGCTCTTTGAATTCTTTGACCGCACAGAGACAAGGACCAACTACCCCAATATGTTCAGGATTGGGAACTTGGTCTTGTACATTCTCATCATCATCCACTGGAATGCCTGCATCTACTTTGCCATTTCCAAGTTCATTGGTTTTGGGACAGACTCCTGGGTCTACCCAAACATCTCAATCCCAGAGCATGGGCGCCTCTCCAGGAAGTACATTTACAGTCTCTACTGGTCCACCTTGACCCTTACCACCATTGGTGAGACCCCACCCCCCGTGAAAGATGAGGAGTATCTCTTTGTGGTCGTAGACTTCTTGGTGGGTGTTCTGATTTTTGCCACCATTGTGGGCAATGTGGGCTCCATGATCTCGAATATGAATGCCTCACGGGCAGAGTTCCAGGCCAAGATTGATTCCATCAAGCAGTACATGCAGTTCCGCAAGGTCACCAAGGACTTGGAGACGCGGGTTATCCGGTGGTTTGACTACCTGTGGGCCAACAAGAAGACGGTGGATGAGAAGGAGGTGCTCAAGAGCCTCCCAGACAAGCTGAAGGCTGAGATCGCCATCAACGTGCACCTGGACACGCTGAAGAAGGTTCGCATCTTCCAGGACTGTGAGGCAGGGCTGCTGGTGGAGCTGGTGCTGAAGCTGCGACCCACTGTGTTCAGCCCTGGGGATTATATCTGCAAGAAGGGAGATATTGGGAAGGAGATGTACATCATCAACGAGGGCAAGCTGGCCGTGGTGGCTGATGATGGGGTCACCCAGTTCGTGGTCCTCAGCGATGGCAGCTACTTCGGGGAGATCAGCATTCTGAACATCAAGGGGAGCAAGTCGGGGAACCGCAGGACGGCCAACATCCGCAGCATTGGCTACTCAGACCTGTTCTGCCTCTCAAAGGACGATCTCATGGAGGCCCTCACCGAGTACCCCGAAGCCAAGAAGGCCCTGGAGGAGAAAGGACGGCAGATCCTGATGAAAGACAACCTGATCGATGAGGAGCTGGCCAGGGCGGGCGCGGACCCCAAGGACCTTGAGGAGAAAGTGGAGCAGCTGGGGTCCTCCCTGGACACCCTGCAGACCAGGTTTGCACGCCTCCTGGCTGAGTACAACGCCACCCAGATGAAGATGAAGCAGCGTCTCAGCCAACTGGAAAGCCAGGTGAAGGGTGGTGGGGACAAGCCCCTGGCTGATGGGGAAGTTCCCGGGGATGCTACAAAAACAGAGGACAAACAACAGTGAAAATGCAGCATCTGTCTCCTGCTTCACAGGGTCGACTGTCAGGGTCACCGTATGTGGCCGCAGCTGTGTGGCATGGAACTTGGTCAGGGTTGAATTCCAGCTCTACTCACCCTTTGAAAGCTGTGTGACTGCCTGAGAGAACCTGTTTCTTCACCTAAAAAATGGGACTTTTTGTCTCAGTCCCAGTGAAGTGCCAGGTTTGATTGTGAAGTCCGCATGAAACACTGCACCAGGCAGGGCTTTGCAAAGTGCAA

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Cas9基因组工程工具和重组模板的AAy递送

最后，针对cas9基因组工程工具和重组模板的体内腺相关病毒(AAV)递送，产生了具有血清型AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8(所有都是有效的)的病毒用于两者，通过梯度超速离心或色谱法进行纯化。然后，通过用于递送到光感器和RPE细胞中的视网膜下途径使用如在先前部分中确定的最佳条件注射病毒粒子。

详细注射方案

AAV的视网膜注射：通过注射高达1毫升的含有不同剂量的被加温至体温的AAV病毒粒子的盐水溶液(0.9％氯化钠)进行视网膜下注射。将这两种不同的AAV载体(一种针对SaCas9和一种针对HR模板)以不同比率(例如SaCas9与HR模板＝1∶1、1∶3或1∶5)混合，以便确定最佳条件。用于注射的剂量可以低至总共1.5x10E10载体基因组或高达总共1.5x10E11载体基因组。更高的剂量可以给出更好的基因治疗有效性，但是由于对病毒载体注射的免疫应答可能导致更高的并发症几率。每天监测患者的程序相关并发症的临床征兆。

注射后程序

注射后，针对任何免疫应答或不利影响对患者进行监测。至少4周之后，使用限制性片段长度多态性测定(RFLP)评估可以在眼部细胞类型中诱导的同源重组的水平。并且然后还评估了全色盲表型的减轻或恢复。

实例5：用于年龄相关性黄斑变性的体内治疗性基因组工程方法。

指导物选择和体外验证

首先，如下所示地设计靶向人类基因组中的基因组座位VEGFA的SaCas9的指导物。已经在该基因的第一外显子内进行了选择，但是还可以靶向该基因的其他部分，这样使得可以对范围广泛的靶区域进行筛选，以便确定最有效的指导物设计。所有这些设计都是通过计算算法生成的，以最大化引入最接近转录起始位点并且位于视网膜中的不同表达转录物的共同区内的中靶切割的潜力。这将有助于治疗性基因校正的最高效率和特异性。还针对其DNA酶I超敏性(HS)测定结果对指导物进行筛选，以便最大化对应于靶指导序列的基因组区域的可及性，由此增加体内递送之后的指导物的预期效率。选择了超过一种指导物，这样使得可以在体外对最有效的指导物进行测试。图23A-B显示了VEGFA的指导物选择。

为了验证设计的指导物可以有效地抑制VEGFA基因在人类细胞中的表达并且找到最佳指导物和条件。将带有设计的指导物的闭合AAV载体体外地递送到人类细胞(例如HEK293)中。递送后72-96小时收获细胞。从细胞中提取RNA和蛋白质。经由qRT-PCR方法或其他RNA测量方法测量VEGF的mRNA水平，而还经由ELISA或其他蛋白方法测量VEGF的蛋白质水平。最关键的标准是VEGF蛋白水平，因为这与该系统的临床有效性直接相关。然后选择具有最高体外效率以降低VEGF的表达水平的指导物用于病毒产生和下游体内实验。

最后，用于cas9基因组工程工具的腺相关病毒(AAV)递送以破坏VEGF体内表达，产生具有血清型AAV2和AAV8(两者都是有效的，可以使用其他AAV血清型如AAV1、AAV5、AAV7、AAV9或AAV-DJ，但是效力较小)的病毒。这些病毒粒子全部通过梯度超速离心或色谱法进行纯化。

然后通过玻璃体内途径使用如在先前部分中确定的最佳条件注射AAV病毒粒子，在玻璃体内途径中AAV被注射在眼睛的玻璃体液中。这种操作是微创的并且可以维持构建体的持续表达，以获得VEGF表达的足够破坏，以便诱导治疗性校正效应。

详细注射方案

AAV的视网膜注射：通过注射典型地100微升(或高达1毫升但是不推荐)的含有不同剂量的被加温至体温的AAV病毒粒子的盐水溶液(0.9％氯化钠)进行玻璃体内注射。用于注射的剂量可以低至总共1x 10E8载体基因组或高达总共1x 10E11载体基因组。使用不同的剂量允许确定最佳剂量。

更高的剂量将给出更好的基因治疗有效性，但是由于对病毒载体注射的免疫应答可能导致更高的并发症几率。将每天监测患者的程序相关并发症的临床征兆。

关于人类注射参数的参考可以在提供关于临床试验的信息的美国政府网站Clinical Trials(dot)Gov获得，网址为：clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01024998。

注射后程序

注射后，针对任何免疫应答或不利影响对患者进行监测。至少4周之后，ELISA或其他蛋白质测量方法可以用于评估视网膜中的VEGF水平。并且然后评估了ARMD表型的减轻或恢复。

有待跟进的患者的关键安全性量度包括单次单眼玻璃体内注射的最大耐受剂量、出现治疗不良事件的数量以及注射后视网膜的厚度。

实例6：用于刺激ATOH1表达以治疗耳聋或听觉损伤的dSaCas9。

指导物选择和体外验证

首先，如下所示地设计靶向人类基因组中的基因ATOH1的SaCas9的指导物。已经基于最佳参数进行了选择，以最大化对靶基因表达的表观遗传调节的效率。确切地说，通过计算算法生成设计，以最大化引入中靶结合的潜力，以便促进最高的治疗性基因疗法效率和特异性。还针对其DNA酶I超敏性(HS)测定结果对指导物进行筛选，以便最大化对应于靶指导序列的基因组区域的可及性，由此增加体内递送之后的指导物的预期效率。此外，在选择指导物的过程中还考虑了潜在地可能干扰结合的转录因子位点。选择了超过一种指导物并且然后在培养的人类细胞(HEK 293FT)中进行体外筛选，以测量它们用于诱导ATOH1基因表达的效率。然后选择具有最高体外效率的指导物用于下游实验和体内治疗性干预。ATOH1的指导物的具体设计示于图25A-C中。

指导物筛选和验证

为了验证设计的指导物可以有效地诱导ATOH1基因在人类细胞中的表达并且找到最佳指导物和条件，用人类细胞系进行体外筛选和验证。将含有dSaCas9、融合效应子和最佳指导RNA的系统体外地递送到人类细胞(例如，HEK293)中(图24)。递送后72-96小时收获细胞。从细胞中提取RNA和蛋白质。经由qRT-PCR方法或其他RNA测量方法测量ATOH1的mRNA水平，而经由ELISA或其他蛋白方法测量ATOH1的蛋白质水平。最关键的标准是ATOH1蛋白水平，因为这与该系统的临床有效性直接相关。然后选择具有最高体外效率以刺激ATOH1的表达的指导物用于体内递送和治疗展示。

然后产生包装整个系统的AAV或Ad病毒粒子或其他递送载体，并且使用如经过实验确定的最佳条件进行注射。优化的最重要参数是用于每次单独注射的递送载体的量(即剂量)。

更高的剂量将给出更好的基因治疗有效性，但是由于对载体注射的免疫应答或该系统的脱靶效应可能导致更高的并发症几率。每天监测患者的程序相关并发症的临床征兆。

注射后程序

注射后，针对任何免疫应答或不利影响对患者进行监测。注射后每周，ELISA或其他蛋白质测量方法可以用来评估ATOH1刺激的水平。可以通过活检和成像方法使耳蜗中的新毛细胞的生长可视化。并且然后通过人类患者的听觉测试评价耳聋和听觉损伤的减轻或恢复。

有待跟进的患者的关键安全性量度包括向人类耳蜗中的单次注射的最大耐受剂量、注射后出现治疗不良事件的数量。

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虽然已经在此示出并描述了本发明的优选实施例，但是对本领域的普通技术人员而言应该显而易见是这样的实施例仅以举例方式提供。在不偏离本发明的情况下众多变化、改变和取代现在将被本领域的普通技术人员想到。应该理解的是，在实践本发明中可以采用在此描述的本发明的实施例的不同替代方案。

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