基于成体干细胞‑再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法

摘要

本发明涉及一种基于成体干细胞‑再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，主要分为两步，第一步采用静电纺丝法制备混有HGF、FGF4因子、牛血清蛋白和再生丝素蛋白材料的用于生物人工肝的成体干细胞‑再生丝素蛋白组织工程支架，第二步基于成体干细胞‑再生丝素蛋白组织工程支架培养人工肝修复材料，脂肪间充质干细胞(ADSCs)或骨髓间充质干细胞(BMSCs)在再生丝素蛋白材料上粘附、增殖，在支架缓释的HGF、FGF4因子作用下诱导成肝脏样细胞。本发明制备的基于成体干细胞‑再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料生物相容性好、生物降解性优异、力学性能优异，是一种良好的生物人工肝备选支架材料。

说明书

技术领域

本发明属人工肝技术领域，涉及基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法。

背景技术

我国是一个乙型肝炎大国，肝炎病毒的携带率高达近10％；随着经济发展和生活方式的改变，大量饮酒所致的酒精性肝病也呈逐年上升趋势；随着抗生素、减肥药及保健品的滥用，药物性肝病也逐年上升。这些数目巨大的肝病病人，经过一定的病程部分病人会进展至终末期肝病或出现急性肝功能衰竭。原位肝移植是该类疾病的唯一有效的治疗手段，但由于供肝缺乏、免疫排斥、手术风险、费用昂贵等诸多因素，严重限制了其在临床的广泛应用。部分患者甚至在等待肝源中去世。人工肝和生物人工肝支持系统为严重肝脏疾病患者的肝脏修复以及肝移植搭建了“桥梁”。但是，人工肝支持系统对于严重肝脏疾病患者而言不仅费用昂贵，而且难以较长时间维持治疗。近年来，组织工程在肝脏方面的应用研究备受关注，特别是种子细胞的选择，使用何种细胞外基质，以及构建什么样的环境来创建组织工程肝脏成为了研究的热点。

种子细胞和载体材料是生物人工肝支持系统的两大基础，而二者的相容性则是构建肝组织工程的关键环节。目前，国内外文献报道可获得具有肝脏功能的细胞的途径主要有：(1)肝细胞的原代培养；(2)胚胎、脐血干细胞体外诱导获得；(3)IPS(Induced Pluripotent Stem Cell)细胞体外诱导获得(4)成体干细胞经体外诱导获得。然而，只有通过成体干细胞体外诱导途径获得既能避免伦理限制、又能通过体外大量扩增，且安全性高的肝脏样细胞。近年来，大量文献报道了不同组织来源的成体干细胞体外均能被诱导成肝脏样细胞，包括骨髓间充质干细胞(BMSCs)、外周血单核细胞(PBMCs)、脂肪干细胞(ADSCs)、肝脏原位干细胞(HSL)等。但是，对于众多成体组织来源的干细胞，尚未有人对其体外成肝脏样细胞的能力做过横向比较和系统研究。我们的前期研究发现BMSCs和ADSCs体外可大量增殖，并被诱导成肝脏样细胞，是理想的种子细胞来源。我们将这两种成体干细胞种植在再生丝素蛋白纤维支架材料上发现其具有良好的粘附性及相容性，并在HGF、FGF4等因子诱导下，可被诱导成肝脏样细胞。因此构建添加HGF、FGF4等因子的再生丝素蛋白纤维支架，模拟肝脏微环境，探讨添加细胞因子的再生丝素蛋白纤维支架对BMSCs和ADSCs的粘附、增殖及诱导成肝的能力，为构建一种优化的生物人工肝支持系统具有十分重要的临床意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，是将含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液通过静电纺丝技术的方法制备。通过该方法制得的纤维毡为混合有HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白纤维构成的具有三维交错网络结构特征的纤维毡，HGF、FGF4因子在再生丝素蛋白纤维中分散均匀，保证了其可以逐渐释放细胞因子促干细胞向肝脏样细胞诱导分化，再生丝素蛋白纤维则赋予支架优异的力学性能。同时，该制备过程简单，易于操作，对环境无污染。本发明的目的在于提供一种生物相容性好、生物降解性优异、力学性能优异，与干细胞相容性好的组织工程支架及其制备方法。本发明的组织工程支架可通过缓释HGF、FGF4等细胞因子，使脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)较好地在再生丝素蛋白材料上粘附、增殖，并分化为肝脏样细胞，ADSCs和BMSCs两种成体干细胞-再生丝素蛋白材料是一种良好的生物人工肝备选支架材料。

基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，包括以下步骤：

(a)成体干细胞的原代培养与传代；

将成体干细胞原代接种培养，待接种后细胞密度达90％以上，则传代；

(b)细胞培养；

进行传代后在用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架上接种，并恒温培养；培养基为α-MEM+10～20v/v％FBS或DMEM+10～20v/v％FBS；

(c)成肝脏样细胞诱导培养；

细胞贴壁后，将培养基更换为加入所述用于生物人工肝的组织工程支架的基础培养基中，每隔3～4天换一次基础培养基；

所述基础培养基为含5～10v/v％FBS的DMEM培养基；

(d)再生丝素蛋白纤维支架上成体干细胞的体外诱导成肝能力；

种植于再生丝素蛋白纤维支架上的成体干细胞经诱导培养7～15天后，成体干细胞即诱导成肝脏样细胞；

所述成体干细胞为ADSCs或BMSCs；

所述用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的制备方法如下：

(1)以蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析和浓缩后，制备质量百分比为30～40％的再生丝素蛋白水溶液；

(2)以水为溶剂，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF与FGF4因子的质量浓度都为15～25μg/mL，牛血清蛋白的质量浓度为0.6～1mg/mL；

(3)将所述再生丝素蛋白水溶液与所述HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以60～130:1的体积比混合，制备含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液；

(4)以所述含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液为纺丝液，采用静电纺丝法制备得到用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架。

作为优选的技术方案：

如上所述的基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，所述再生丝素蛋白水溶液的制备步骤如下：将蚕茧用质量百分比为0.3～0.7％的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0～9.5mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液；将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为30～40％的再生丝素蛋白水溶液。

如上所述的基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，所述蚕茧为桑蚕茧、柞蚕茧或蓖麻蚕茧中的一种。

如上所述的基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，静电纺丝的纺丝环境温度为2～6℃。

如上所述的基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，步骤(2)中，还包含20-40ng/mL OSM、20-50ng/mL aFGF、1-20μmol/L Dex、50-200μmol/L VPP、1-10mmol/L Vc和0.9-1.1X胰岛素转铁蛋白硒。

如上所述的基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，所述原代接种时间为72小时；所述传代按1:2～3传代；步骤(a)中，若细胞密度未达90％，则半量换液，延长培养一天传代。

如上所述的基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，传代后接种是指：取对数生长的第2～4代细胞，以1×10⁴/cm²的浓度进行传代后接种；所述恒温培养是指：于5v/v％CO₂和37℃条件下恒温培养。

如上所述的基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，所述细胞贴壁是指细胞培养24h后见细胞贴壁生长。

如上所述的基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，所述基础培养基中还含有20ng/mL EGF和/或10ng/mL bFGF。

有益效果：

本发明创造性地提出了基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，采用了用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架进行人工肝修复材料的培养。在保证再生丝素蛋白较高浓度的前提下，避免了有机溶剂(如甲酸、六氟异丙醇等)的使用，不仅降低了生产成本，而且避免了对人体的伤害。

按照本发明的方法制得的用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架不仅具有优异的力学性能，而且可将成体干细胞诱导成肝脏样细胞，满足人工肝修复的使用要求。

本发明为生物人工肝筛选理想的种子细胞，为临床进行干细胞移植治疗急慢性肝脏衰竭提供理想的移植供体细胞。

本发明成肝效率高，一周即能取得较好的诱导效果，诱导时间短，细胞成肝比例高。

体外实验结果表明，苏木精-伊红(HE)染色可见细胞均匀分布于材料表面，材料内部也有少许细胞。扫描电镜显示两种成体干细胞在再生丝素蛋白材料上呈旋涡状生长，形态基本不变，粘附性良好。3D共聚焦显微镜结果显示两种不同成体干细胞在材料不同层面上均可以生长。

动物体内实验结果表明：小鼠背部再生丝素蛋白材料移植后HE染色显示材料与组织相容性良好。小动物活体显像和荧光显微镜观察显示CM-Dil荧光标记的两种成体干细胞-再生丝素蛋白纤维复合材料移植后的2天、5天、7天、14天和1个月均能检测到CM-Dil荧光标记的两种成体干细胞。HE染色结果显示在成体干细胞-再生丝素蛋白复合材料移植的2天、5天、7天、14天、1个月、2个月、3个月材料与肝组织间相容性良好，无大量炎症细胞浸润，移植在背部再生丝素蛋白材料在第4个月几乎完全降解，移植在肝脏再生丝素蛋白材料在第3个月几乎完全降解。此外，在第5天和第7天发现材料有新生血管生成，在2个月和3个月观察到新生的肝脏样细胞。

ADSCs和BMSCs可较好地在再生丝素蛋白材料上粘附、增殖，并分化为肝脏样细胞，ADSCs和BMSCs两种成体干细胞-再生丝素蛋白材料是一种良好的生物人工肝备选支架材料.

本发明创造性地将ADSCs和BMSCs复合再生丝素蛋白纤维移植到急性肝损伤小鼠的肝脏，在移植后24h，48h，72h检测小鼠肝功能指标(ALT，AST)，发现相比于单纯的ADSCs和BMSCs移植组和单纯的材料移植组，两种成体干细胞-再生丝素蛋白纤维复合材料能够明显修复小鼠肝功能损伤，肝功能指标有统计学差异，单纯的材料移植组也显示出了修复小鼠急性肝损伤的作用，肝功能指标子在48h和72h相比于四氯化碳(CCl₄)组有统计学差异。按照本发明的方法制得的成体干细胞-再生丝素蛋白纤维支架不仅与生物体有良好的生物相容性，而且能够显著修复急性肝损伤小鼠的肝功能，满足了生物人工肝材料修复肝损伤的使用要求。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

一种基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，首先，制备用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架，步骤如下：

1)将桑蚕茧用质量百分比为0.3％的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液，将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为30％的再生丝素蛋白水溶液；

2)以水为溶剂，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF与FGF4因子的质量浓度都为15μg/mL，牛血清蛋白的质量浓度为0.6mg/mL；

3)将再生丝素蛋白水溶液与HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以60:1的体积比混合，制备含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液；

4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液为纺丝液，在纺丝环境温度为2℃条件下，采用静电纺丝法制备得到用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架。

然后，基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架培养人工肝修复材料，步骤如下：

1)分别将脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行原代培养与传代，将ADSCs和BMSCs分别原代接种72小时培养，待接种后细胞密度达到90％，按1:2传代；

2)细胞培养，进行传代后取对数生长的第2代细胞在用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架上以1×10⁴/cm²的浓度进行接种，并于5v/v％CO₂和37℃条件下恒温培养，培养基为α-MEM+10v/v％FBS；

3)成肝脏样细胞诱导培养，细胞培养24h后见细胞贴壁生长后，将培养基更换为加入用于生物人工肝的组织工程支架的含5v/v％FBS的DMEM培养基中，每隔3天换一次培养基；

4)再生丝素蛋白纤维支架上ADSCs和BMSCs的体外诱导成肝能力，种植于再生丝素蛋白纤维支架上的ADSCs和BMSCs分别经诱导培养7天后，ADSCs和BMSCs分别诱导成肝脏样细胞。

最后，进行小鼠实验，步骤如下：

1)再生丝素蛋白纤维支架上成体干细胞的体内诱导成肝能力，将再生丝素蛋白纤维材料移植到小鼠背上，在移植后的第3和第4个月取材，采用HE染色观察材料的降解情况；将CM-Dil荧光标记的ADSCs和BMSCs分别移植到再生丝素蛋白材料上，并移植到急性肝损伤小鼠模型肝脏表面，在不同时间点(2天、5天、7天、14天、1个月)用小动物活体显像技术及荧光显微镜下观察移植细胞的在材料上的定植情况，同时采用HE染色的方法观察不同时间点(2天、5天、7天、14天、1个月、2个月、3个月)移植细胞材料在肝脏表面的定植情况、分化情况以及再生丝素蛋白材料与肝脏组织的相容性；

2)成体干细胞-再生丝素蛋白纤维复合材料(以下简称细胞-RSF材料)的制备，将制备好的再生丝素蛋白纤维剪成1.1cm×1.1cm大小的正方形材料；钴60照射后置于超净台内保存；使用前将材料置于24孔板中，75％酒精浸泡2个小时，PBS洗涤后，加入培养基置于37℃恒温培养箱孵育24h；胰酶消化ADSCs和BMSCs，终止消化，细胞离心后，调整细胞浓度，以0.5×10⁶/cm²材料接种细胞，培养3天后，准备移植到急性肝损伤模型的体内；

3)急性肝损伤小鼠模型制备，购买实验动物，预先在动物房实验性饲养一周；在细胞及细胞-RSF材料移植的前一天，配置10v/v％的四氯化碳(CCl₄)-橄榄油，以每100μL/20g(0.5mL/kg)小鼠腹腔注射，设置实验组及对照组，每个时间点设5只小鼠；观察小鼠一般生长状况及体重变化；

4)细胞-RSF材料移植到急性肝损伤小鼠模型的肝脏表面，小鼠手术前两个小时禁食、禁水；乙醚诱导，200μL/只，4mg/mL的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠；固定小鼠四肢，剔除小鼠腹部毛发，碘伏棉球消毒小鼠腹部；腹正中线打开小鼠腹腔，暴露小鼠肝脏，造模后小鼠肝脏成土黄色，肝脏明显变大；将空白再生丝素蛋白材料、两种细胞(ADSCs和BMSCs)及两种细胞-RSF材料移植在小鼠肝脏左外叶上，8号带线美容缝合针固定；移植结束，4号线缝合小鼠皮肤，注意小鼠术后复温，观察小鼠一般状态；

5)小鼠肝功能检测，预先将准备的EP管(微量离心管)固定在泡沫板上；采用眼球取血法收集小鼠血液，使血液滴入EP管中，勿在管壁摩擦，以防溶血；血样室温静置2h后，3000rpm离心15min；将上清转移至检测容器中，送生化科检测谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶水平(AST)，检测结果如下：

移植后各组小鼠肝功能指标ALT的改变见表1，表中D1、D2、D3和D7分别为第一天、第二天、第三天和第四天，*p<0.05，**p<0.01；vs CCl₄组；#p>0.05，##p<0.05vs正常组(和CCl₄组的数值相比，有*的代表p<0.05，表示两组数据在0.05水平上具备显著性差异；有**的代表p<0.01，表示两组数据在0.01水平上具备极显著性差异；和正常组数值相比，有#的代表p>0.05，即两组数据在0.05水平上不具备显著性差异；有##的代表p<0.05，即两组数据在0.05水平上具备显著性差异。显著性差异是一种有量度的或然性评价，A、B两数据在0.05水平上具备显著性差异，说明两组数据具备显著性差异的可能性为95％，两个数据所代表的样本还有5％的可能性是没有差异的，这5％的差异是由于随机误差造成的。)。

由表中的数据可以看出，移植后第1天，BMSCs、ADSCs和两种细胞-RSF复合材料能够明显促进肝脏再生；移植后第2天和第3天，BMSCs、ADSCs、两种细胞-RSF复合材料组和单纯的再生丝素蛋白材料组(RSF组)均有改善急性肝损伤小鼠肝功能的作用；移植后第7天，除CCl₄组，各组肝功能均恢复正常。不同救治组肝功能的改善结果表明，再生丝素蛋白材料复合细胞后改善肝功能的水平明显优于单纯的细胞治疗组以及单纯的再生丝素蛋白材料组。

表1移植后各组ALT比较

移植后各组小鼠肝功能指标AST的改变见表2，表中D1、D2、D3和D7分别为第一天、第二天、第三天和第四天，*p<0.05，**p<0.01；vs CCl₄组；#p>0.05，##p<0.05vs正常组(和CCl₄组的数值相比，有*的代表p<0.05，表示两组数据在0.05水平上具备显著性差异；有**的代表p<0.01，表示两组数据在0.01水平上具备极显著性差异；和正常组数值相比，有#的代表p>0.05，即两组数据在0.05水平上不具备显著性差异；有##的代表p<0.05，即两组数据在0.05水平上具备显著性差异。由表中的数据可以看出，移植后第1天，BMSCs、ADSCs和两种细胞-RSF复合材料能够明显促进肝脏再生；移植后第2天，两种细胞-RSF复合材料组和单纯RSF材料组均有改善急性肝损伤小鼠肝功能的作用；移植后第3天，BMSCs、ADSCs、两种细胞-RSF复合材料组和单纯的再生丝素蛋白材料组(RSF组)均有改善急性肝损伤小鼠肝功能的作用；移植后第7天，各组肝功能均恢复正常。不同救治组肝功能的改善结果表明，再生丝素蛋白材料复合细胞后改善肝功能的水平明显优于单纯的细胞治疗组以及单纯的再生丝素蛋白材料组。

表2移植后各组AST比较

实施例2

一种基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，首先，制备用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架，步骤如下：

1)将柞蚕茧用质量百分比为0.4％的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.1mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液，将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为32％的再生丝素蛋白水溶液；

2)以水为溶剂，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF与FGF4因子的质量浓度都为16μg/mL，牛血清蛋白的质量浓度为0.7mg/mL；

3)将再生丝素蛋白水溶液与HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以80:1的体积比混合，制备含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液；

4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液为纺丝液，在纺丝环境温度为3℃条件下，采用静电纺丝法制备得到用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架。

然后，基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架培养人工肝修复材料，步骤如下：

1)分别将脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行原代培养与传代，将ADSCs和BMSCs分别原代接种72小时培养，待接种后细胞密度达到91％，按1:3传代；

2)细胞培养，进行传代后取对数生长的第3代细胞在用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架上以1×10⁴/cm²的浓度进行接种，并于5v/v％CO₂和37℃条件下恒温培养，培养基为α-MEM+12v/v％FBS；

3)成肝脏样细胞诱导培养，细胞培养24h后见细胞贴壁生长后，将培养基更换为加入用于生物人工肝的组织工程支架的含6v/v％FBS的DMEM培养基中，每隔4天换一次培养基；

4)再生丝素蛋白纤维支架上ADSCs和BMSCs的体外诱导成肝能力，种植于再生丝素蛋白纤维支架上的ADSCs和BMSCs分别经诱导培养8天后，ADSCs和BMSCs分别诱导成肝脏样细胞。

经与实施例1中相同的小鼠实验，结果基本一致，不同救治组肝功能的改善结果表明，再生丝素蛋白材料复合细胞后改善肝功能的水平明显优于单纯的细胞治疗组以及单纯的再生丝素蛋白材料组。

实施例3

一种基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，首先，制备用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架，步骤如下：

1)将蓖麻蚕茧用质量百分比为0.5％的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.2mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液，将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为34％的再生丝素蛋白水溶液；

2)以水为溶剂，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF与FGF4因子的质量浓度都为18μg/mL，牛血清蛋白的质量浓度为0.8mg/mL；

3)将再生丝素蛋白水溶液与HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以90:1的体积比混合，制备含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液；

4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液为纺丝液，在纺丝环境温度为4℃条件下，采用静电纺丝法制备得到用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架。

然后，基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架培养人工肝修复材料，步骤如下：

1)分别将脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行原代培养与传代，将ADSCs和BMSCs分别原代接种72小时培养，待接种后细胞密度达到92％，按1:2传代；

2)细胞培养，进行传代后取对数生长的第4代细胞在用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架上以1×10⁴/cm²的浓度进行接种，并于5v/v％CO₂和37℃条件下恒温培养，培养基为α-MEM+15v/v％FBS；

3)成肝脏样细胞诱导培养，细胞培养24h后见细胞贴壁生长后，将培养基更换为加入用于生物人工肝的组织工程支架的含7v/v％FBS的DMEM培养基中，每隔3天换一次培养基；

4)再生丝素蛋白纤维支架上ADSCs和BMSCs的体外诱导成肝能力，种植于再生丝素蛋白纤维支架上的ADSCs和BMSCs分别经诱导培养10天后，ADSCs和BMSCs分别诱导成肝脏样细胞。

经与实施例1中相同的小鼠实验，结果基本一致，不同救治组肝功能的改善结果表明，再生丝素蛋白材料复合细胞后改善肝功能的水平明显优于单纯的细胞治疗组以及单纯的再生丝素蛋白材料组。

实施例4

一种基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，首先，制备用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架，步骤如下：

1)将桑蚕茧用质量百分比为0.3％的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液，将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为30％的再生丝素蛋白水溶液；

2)以水为溶剂，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF与FGF4因子的质量浓度都为15μg/mL，牛血清蛋白的质量浓度为0.6mg/mL，溶液中还包含20ng/mL OSM、20ng/mL aFGF、1μmol/LDex、50μmol/L VPP、1mmol/L Vc和0.9X胰岛素转铁蛋白硒；

3)将再生丝素蛋白水溶液与HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以60:1的体积比混合，制备含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液；

4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液为纺丝液，在纺丝环境温度为2℃条件下，采用静电纺丝法制备得到用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架。

然后，基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架培养人工肝修复材料，步骤如下：

1)分别将脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行原代培养与传代，将ADSCs和BMSCs分别原代接种72小时培养，待接种后细胞密度达到90％，按1:2传代；

2)细胞培养，进行传代后取对数生长的第2代细胞在用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架上以1×10⁴/cm²的浓度进行接种，并于5v/v％CO₂和37℃条件下恒温培养，培养基为α-MEM+10v/v％FBS；

3)成肝脏样细胞诱导培养，细胞培养24h后见细胞贴壁生长后，将培养基更换为加入用于生物人工肝的组织工程支架的含5v/v％FBS的DMEM培养基中，每隔3天换一次培养基；

4)再生丝素蛋白纤维支架上ADSCs和BMSCs的体外诱导成肝能力，种植于再生丝素蛋白纤维支架上的ADSCs和BMSCs分别经诱导培养7天后，ADSCs和BMSCs分别诱导成肝脏样细胞。

经与实施例1中相同的小鼠实验，结果基本一致，不同救治组肝功能的改善结果表明，再生丝素蛋白材料复合细胞后改善肝功能的水平明显优于单纯的细胞治疗组以及单纯的再生丝素蛋白材料组。

实施例5

一种基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，首先，制备用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架，步骤如下：

1)将柞蚕茧用质量百分比为0.6％的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.3mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液，将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为36％的再生丝素蛋白水溶液；

2)以水为溶剂，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF与FGF4因子的质量浓度都为20μg/mL，牛血清蛋白的质量浓度为0.9mg/mL，溶液中还包含25ng/mL OSM、26ng/mL aFGF、5μmol/L Dex、80μmol/L VPP、3mmol/L Vc和1X胰岛素转铁蛋白硒；

3)将再生丝素蛋白水溶液与HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以100:1的体积比混合，制备含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液；

4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液为纺丝液，在纺丝环境温度为5℃条件下，采用静电纺丝法制备得到用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架。

然后，基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架培养人工肝修复材料，步骤如下：

1)分别将脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行原代培养与传代，将ADSCs和BMSCs分别原代接种72小时培养，待接种后细胞密度达到93％，按1:3传代；

2)细胞培养，进行传代后取对数生长的第2代细胞在用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架上以1×10⁴/cm²的浓度进行接种，并于5v/v％CO₂和37℃条件下恒温培养，培养基为α-MEM+18v/v％FBS；

3)成肝脏样细胞诱导培养，细胞培养24h后见细胞贴壁生长后，将培养基更换为加入用于生物人工肝的组织工程支架的含8v/v％FBS的DMEM培养基中，每隔4天换一次培养基；

4)再生丝素蛋白纤维支架上ADSCs和BMSCs的体外诱导成肝能力，种植于再生丝素蛋白纤维支架上的ADSCs和BMSCs分别经诱导培养12天后，ADSCs和BMSCs分别诱导成肝脏样细胞。

经与实施例1中相同的小鼠实验，结果基本一致，不同救治组肝功能的改善结果表明，再生丝素蛋白材料复合细胞后改善肝功能的水平明显优于单纯的细胞治疗组以及单纯的再生丝素蛋白材料组。

实施例6

一种基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，首先，制备用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架，步骤如下：

1)将蓖麻蚕茧用质量百分比为0.7％的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.4mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液，将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为38％的再生丝素蛋白水溶液；

2)以水为溶剂，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF与FGF4因子的质量浓度都为22μg/mL，牛血清蛋白的质量浓度为1mg/mL，溶液中还包含30ng/mL OSM、32ng/mL aFGF、8μmol/L Dex、100μmol/L VPP、5mmol/L Vc和1.1X胰岛素转铁蛋白硒；

3)将再生丝素蛋白水溶液与HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以120:1的体积比混合，制备含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液；

4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液为纺丝液，在纺丝环境温度为6℃条件下，采用静电纺丝法制备得到用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架。

然后，基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架培养人工肝修复材料，步骤如下：

1)分别将脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行原代培养与传代，将ADSCs和BMSCs分别原代接种72小时培养，待接种后细胞密度达到94％，按1:2传代；

2)细胞培养，进行传代后取对数生长的第3代细胞在用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架上以1×10⁴/cm²的浓度进行接种，并于5v/v％CO₂和37℃条件下恒温培养，培养基为α-MEM+20v/v％FBS；

3)成肝脏样细胞诱导培养，细胞培养24h后见细胞贴壁生长后，将培养基更换为加入用于生物人工肝的组织工程支架的含9v/v％FBS的DMEM培养基中，每隔3天换一次培养基；

4)再生丝素蛋白纤维支架上ADSCs和BMSCs的体外诱导成肝能力，种植于再生丝素蛋白纤维支架上的ADSCs和BMSCs分别经诱导培养13天后，ADSCs和BMSCs分别诱导成肝脏样细胞。

经与实施例1中相同的小鼠实验，结果基本一致，不同救治组肝功能的改善结果表明，再生丝素蛋白材料复合细胞后改善肝功能的水平明显优于单纯的细胞治疗组以及单纯的再生丝素蛋白材料组。

实施例7

一种基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，首先，制备用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架，步骤如下：

1)将柞蚕茧用质量百分比为0.4％的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.1mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液，将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为32％的再生丝素蛋白水溶液；

2)以水为溶剂，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF与FGF4因子的质量浓度都为16μg/mL，牛血清蛋白的质量浓度为0.7mg/mL；

3)将再生丝素蛋白水溶液与HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以80:1的体积比混合，制备含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液；

4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液为纺丝液，在纺丝环境温度为3℃条件下，采用静电纺丝法制备得到用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架。

然后，基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架培养人工肝修复材料，步骤如下：

1)分别将脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行原代培养与传代，将ADSCs和BMSCs分别原代接种72小时培养，待接种后细胞密度达到91％，按1:3传代；

2)细胞培养，进行传代后取对数生长的第3代细胞在用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架上以1×10⁴/cm²的浓度进行接种，并于5v/v％CO₂和37℃条件下恒温培养，培养基为α-MEM+12v/v％FBS；

3)成肝脏样细胞诱导培养，细胞培养24h后见细胞贴壁生长后，将培养基更换为加入用于生物人工肝的组织工程支架的含6v/v％FBS的DMEM培养基中，培养基中还含有20ng/mL EGF，每隔4天换一次培养基；

4)再生丝素蛋白纤维支架上ADSCs和BMSCs的体外诱导成肝能力，种植于再生丝素蛋白纤维支架上的ADSCs和BMSCs分别经诱导培养8天后，ADSCs和BMSCs分别诱导成肝脏样细胞。

经与实施例1中相同的小鼠实验，结果基本一致，不同救治组肝功能的改善结果表明，再生丝素蛋白材料复合细胞后改善肝功能的水平明显优于单纯的细胞治疗组以及单纯的再生丝素蛋白材料组。

实施例8

一种基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，首先，制备用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架，步骤如下：

1)将桑蚕茧用质量百分比为0.3％的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.5mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液，将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为40％的再生丝素蛋白水溶液；

2)以水为溶剂，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF与FGF4因子的质量浓度都为25μg/mL，牛血清蛋白的质量浓度为0.6mg/mL；

3)将再生丝素蛋白水溶液与HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以130:1的体积比混合，制备含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液；

4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液为纺丝液，在纺丝环境温度为2℃条件下，采用静电纺丝法制备得到用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架。

然后，基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架培养人工肝修复材料，步骤如下：

1)分别将脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行原代培养与传代，将ADSCs和BMSCs分别原代接种72小时培养，待接种后细胞密度达到91％，按1:3传代；

2)细胞培养，进行传代后取对数生长的第4代细胞在用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架上以1×10⁴/cm²的浓度进行接种，并于5v/v％CO₂和37℃条件下恒温培养，培养基为DMEM+10v/v％FBS；

3)成肝脏样细胞诱导培养，细胞培养24h后见细胞贴壁生长后，将培养基更换为加入用于生物人工肝的组织工程支架的含10v/v％FBS的DMEM培养基中，培养基中还含有10ng/mL bFGF，每隔4天换一次培养基；

4)再生丝素蛋白纤维支架上ADSCs和BMSCs的体外诱导成肝能力，种植于再生丝素蛋白纤维支架上的ADSCs和BMSCs分别经诱导培养14天后，ADSCs和BMSCs分别诱导成肝脏样细胞。

经与实施例1中相同的小鼠实验，结果基本一致，不同救治组肝功能的改善结果表明，再生丝素蛋白材料复合细胞后改善肝功能的水平明显优于单纯的细胞治疗组以及单纯的再生丝素蛋白材料组。

实施例9

一种基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，首先，制备用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架，步骤如下：

1)将柞蚕茧用质量百分比为0.4％的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液，将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为31％的再生丝素蛋白水溶液；

2)以水为溶剂，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF与FGF4因子的质量浓度都为17μg/mL，牛血清蛋白的质量浓度为0.6mg/mL；

3)将再生丝素蛋白水溶液与HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以70:1的体积比混合，制备含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液；

4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液为纺丝液，在纺丝环境温度为3℃条件下，采用静电纺丝法制备得到用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架。

然后，基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架培养人工肝修复材料，步骤如下：

1)分别将脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行原代培养与传代，将ADSCs和BMSCs分别原代接种72小时培养，待接种后细胞密度达到89％，半量换液，延长培养一天按1:2传代；

2)细胞培养，进行传代后取对数生长的第2代细胞在用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架上以1×10⁴/cm²的浓度进行接种，并于5v/v％CO₂和37℃条件下恒温培养，培养基为DMEM+13v/v％FBS；

3)成肝脏样细胞诱导培养，细胞培养24h后见细胞贴壁生长后，将培养基更换为加入用于生物人工肝的组织工程支架的含6v/v％FBS的DMEM培养基中，培养基中还含有20ng/mL EGF和10ng/mL bFGF，每隔3天换一次培养基；

4)再生丝素蛋白纤维支架上ADSCs和BMSCs的体外诱导成肝能力，种植于再生丝素蛋白纤维支架上的ADSCs和BMSCs分别经诱导培养15天后，ADSCs和BMSCs分别诱导成肝脏样细胞。

经与实施例1中相同的小鼠实验，结果基本一致，不同救治组肝功能的改善结果表明，再生丝素蛋白材料复合细胞后改善肝功能的水平明显优于单纯的细胞治疗组以及单纯的再生丝素蛋白材料组。

实施例10

一种基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，首先，制备用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架，步骤如下：

1)将柞蚕茧用质量百分比为0.6％的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.3mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液，将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为36％的再生丝素蛋白水溶液；

2)以水为溶剂，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF与FGF4因子的质量浓度都为20μg/mL，牛血清蛋白的质量浓度为0.9mg/mL，溶液中还包含25ng/mL OSM、26ng/mL aFGF、5μmol/L Dex、80μmol/L VPP、3mmol/L Vc和1X胰岛素转铁蛋白硒；

3)将再生丝素蛋白水溶液与HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以100:1的体积比混合，制备含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液；

4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液为纺丝液，在纺丝环境温度为5℃条件下，采用静电纺丝法制备得到用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架。

然后，基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架培养人工肝修复材料，步骤如下：

1)分别将脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行原代培养与传代，将ADSCs和BMSCs分别原代接种72小时培养，待接种后细胞密度达到93％，按1:3传代；

2)细胞培养，进行传代后取对数生长的第2代细胞在用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架上以1×10⁴/cm²的浓度进行接种，并于5v/v％CO₂和37℃条件下恒温培养，培养基为α-MEM+18v/v％FBS；

3)成肝脏样细胞诱导培养，细胞培养24h后见细胞贴壁生长后，将培养基更换为加入用于生物人工肝的组织工程支架的含8v/v％FBS的DMEM培养基中，培养基中还含有20ng/mL EGF，每隔4天换一次培养基；

4)再生丝素蛋白纤维支架上ADSCs和BMSCs的体外诱导成肝能力，种植于再生丝素蛋白纤维支架上的ADSCs和BMSCs分别经诱导培养12天后，ADSCs和BMSCs分别诱导成肝脏样细胞。

经与实施例1中相同的小鼠实验，结果基本一致，不同救治组肝功能的改善结果表明，再生丝素蛋白材料复合细胞后改善肝功能的水平明显优于单纯的细胞治疗组以及单纯的再生丝素蛋白材料组。

实施例11

一种基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，首先，制备用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架，步骤如下：

1)将桑蚕茧用质量百分比为0.3％的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.5mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液，将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为40％的再生丝素蛋白水溶液；

2)以水为溶剂，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF与FGF4因子的质量浓度都为25μg/mL，牛血清蛋白的质量浓度为0.6mg/mL，溶液中还包含35ng/mL OSM、38ng/mL aFGF、12μmol/L Dex、130μmol/L VPP、7mmol/L Vc和0.9X胰岛素转铁蛋白硒；

3)将再生丝素蛋白水溶液与HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以130:1的体积比混合，制备含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液；

4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液为纺丝液，在纺丝环境温度为2℃条件下，采用静电纺丝法制备得到用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架。

然后，基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架培养人工肝修复材料，步骤如下：

1)分别将脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行原代培养与传代，将ADSCs和BMSCs分别原代接种72小时培养，待接种后细胞密度达到91％，按1:3传代；

2)细胞培养，进行传代后取对数生长的第4代细胞在用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架上以1×10⁴/cm²的浓度进行接种，并于5v/v％CO₂和37℃条件下恒温培养，培养基为DMEM+10v/v％FBS；

3)成肝脏样细胞诱导培养，细胞培养24h后见细胞贴壁生长后，将培养基更换为加入用于生物人工肝的组织工程支架的含10v/v％FBS的DMEM培养基中，培养基中还含有10ng/mL bFGF，每隔4天换一次培养基；

4)再生丝素蛋白纤维支架上ADSCs和BMSCs的体外诱导成肝能力，种植于再生丝素蛋白纤维支架上的ADSCs和BMSCs分别经诱导培养14天后，ADSCs和BMSCs分别诱导成肝脏样细胞。

经与实施例1中相同的小鼠实验，结果基本一致，不同救治组肝功能的改善结果表明，再生丝素蛋白材料复合细胞后改善肝功能的水平明显优于单纯的细胞治疗组以及单纯的再生丝素蛋白材料组。

实施例12

一种基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，首先，制备用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架，步骤如下：

1)将柞蚕茧用质量百分比为0.5％的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.1mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液，将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为33％的再生丝素蛋白水溶液；

2)以水为溶剂，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF与FGF4因子的质量浓度都为19μg/mL，牛血清蛋白的质量浓度为0.7mg/mL，溶液中还包含38ng/mL OSM、45ng/mL aFGF、15μmol/L Dex、170μmol/L VPP、9mmol/L Vc和1X胰岛素转铁蛋白硒；

3)将再生丝素蛋白水溶液与HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以88:1的体积比混合，制备含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液；

4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液为纺丝液，在纺丝环境温度为4℃条件下，采用静电纺丝法制备得到用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架。

然后，基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架培养人工肝修复材料，步骤如下：

1)分别将脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行原代培养与传代，将ADSCs和BMSCs分别原代接种72小时培养，待接种后细胞密度达到88％，半量换液，延长培养一天按1:3传代；

2)细胞培养，进行传代后取对数生长的第3代细胞在用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架上以1×10⁴/cm²的浓度进行接种，并于5v/v％CO₂和37℃条件下恒温培养，培养基为DMEM+16v/v％FBS；

3)成肝脏样细胞诱导培养，细胞培养24h后见细胞贴壁生长后，将培养基更换为加入用于生物人工肝的组织工程支架的含7v/v％FBS的DMEM培养基中，培养基中还含有20ng/mL EGF，每隔4天换一次培养基；

4)再生丝素蛋白纤维支架上ADSCs和BMSCs的体外诱导成肝能力，种植于再生丝素蛋白纤维支架上的ADSCs和BMSCs分别经诱导培养9天后，ADSCs和BMSCs分别诱导成肝脏样细胞。

经与实施例1中相同的小鼠实验，结果基本一致，不同救治组肝功能的改善结果表明，再生丝素蛋白材料复合细胞后改善肝功能的水平明显优于单纯的细胞治疗组以及单纯的再生丝素蛋白材料组。

实施例13

一种基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法，首先，制备用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架，步骤如下：

1)将蓖麻蚕茧用质量百分比为0.6％的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.2mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液，将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为35％的再生丝素蛋白水溶液；

2)以水为溶剂，配制HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液，其中HGF与FGF4因子的质量浓度都为21μg/mL，牛血清蛋白的质量浓度为0.8mg/mL，溶液中还包含40ng/mL OSM、50ng/mL aFGF、20μmol/L Dex、200μmol/L VPP、10mmol/L Vc和1.1X胰岛素转铁蛋白硒；

3)将再生丝素蛋白水溶液与HGF、FGF4因子和牛血清蛋白水溶液以95:1的体积比混合，制备含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液；

4)以含HGF、FGF4因子和牛血清蛋白的再生丝素蛋白溶液为纺丝液，在纺丝环境温度为5℃条件下，采用静电纺丝法制备得到用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架。

然后，基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架培养人工肝修复材料，步骤如下：

1)分别将脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行原代培养与传代，将ADSCs和BMSCs分别原代接种72小时培养，待接种后细胞密度达到93％，按1:2传代；

2)细胞培养，进行传代后取对数生长的第4代细胞在用于生物人工肝的成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架上以1×10⁴/cm²的浓度进行接种，并于5v/v％CO₂和37℃条件下恒温培养，培养基为DMEM+18v/v％FBS；

3)成肝脏样细胞诱导培养，细胞培养24h后见细胞贴壁生长后，将培养基更换为加入用于生物人工肝的组织工程支架的含8v/v％FBS的DMEM培养基中，培养基中还含有20ng/mL EGF和10ng/mL bFGF，每隔3天换一次培养基；

4)再生丝素蛋白纤维支架上ADSCs和BMSCs的体外诱导成肝能力，种植于再生丝素蛋白纤维支架上的ADSCs和BMSCs分别经诱导培养11天后，ADSCs和BMSCs分别诱导成肝脏样细胞。

经与实施例1中相同的小鼠实验，结果基本一致，不同救治组肝功能的改善结果表明，再生丝素蛋白材料复合细胞后改善肝功能的水平明显优于单纯的细胞治疗组以及单纯的再生丝素蛋白材料组。