一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针及其试剂盒

摘要

本发明公开了一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针及其试剂盒。包括三组引物和探针，分别为引物组qYF2/qYR2和探针qYP，引物组qNF/qNR和探针qNP，引物组qBF2/qBR1和探针qBP；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～9所示；所述三种短体线虫为玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫。利用上述引物组和探针及其试剂盒不仅能够非常特异性地鉴定区分出玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫，还能够进行定量检测，有效克服了这三种短体线虫在形态学上难以区分、检测工作量大、成本高的缺点，检测灵敏度可达到0.01条线虫，对实际检测工作有重要的推进意义。

说明书

技术领域

本发明属于植物病原检测技术领域。更具体地，涉及一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针及其试剂盒。

背景技术

短体线虫，也称为根腐线虫，是一种重要的迁移性内寄生线虫，该类线虫由70多个有效种组成。短体线虫在植物根内移动、穿刺和取食引起根组织形成坏死斑、空腔进而使根组织坏死。由于植株根部坏死，被短体线虫危害的植物会表现出缺水和营养不足的症状，短体线虫是造成经济损失最大的三种植物线虫之一。

玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫是三种较常见的短体线虫，这三种短体线虫均可危害甘蔗，而且会复合侵染。另外这三种短体线虫不单分布广泛，而且寄主也较广，除侵染甘蔗外，还可以侵染其它重要的农作物，如玉米。只有正确鉴定和预测这三种线虫在田间的虫口数量，才能在实际工作中制定合理的防治措施以此避免更大的经济损失，因此，正确、精确地鉴定、统计出三种短体线虫的侵染情况和侵染量，对于实际工作具有重要的意义。

然而，目前对短体线虫的鉴定主要是依据传统形态学的方法，而根据形态将短体线虫鉴定到种是一个复杂而费时的工作。特别是对于玉米短体线虫和拟玉米短体线虫，它们形态上极为相似，可用于区分的特征很少，而且在甘蔗地里会混合出现，这就需要鉴定人员有非常丰富的形态鉴定经验。此外，形态学的鉴定方法只能准确地鉴定短体线虫的成熟雌虫，但是在田间调查的时候，常常是大量的线虫处于幼虫阶段，要通过形态学方法准确地鉴定这些短体线虫幼虫，几乎是不可能的，因此，在实际的工作中，精确准确地区分玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫这三种线虫，以评价三种线虫的侵染情况，是很困难的。

目前，国内外还未见有通过实时荧光定量PCR方法定性检测（鉴定）和定量甘蔗上这三种短体线虫的报道。由于玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫侵染甘蔗的根部，严重的影响甘蔗的产量与品质。因此，为避免更大的经济损失，亟需一种能够高效、准确鉴定这三种短体线虫的分子生物学方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫鉴定检测技术的不足，尤其是难以区分三者的缺陷，提供更加精准、高效、特异性好、灵敏性高的定量检测玉米短体线虫（Pratylenchus>）、拟玉米短体线虫（P.>）和最短尾短体线虫（P.>）的实时荧光定量PCR方法和检测体系。

本发明的目的是提供一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针。

本发明另一目的是提供一种鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针，包括三组引物和探针，分别为引物组qYF2/qYR2和探针qYP，引物组qNF/qNR和探针qNP，引物组qBF2/qBR1和探针qBP；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～9所示。

优选地，所述探针qYP、探针qNP和探针qBP的5’ 端均标记有FAM荧光基团，3’ 端均标记有ECL荧光基团。

所述三种短体线虫为玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫。

上述鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在鉴定、检测和/或定量检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫方面的应用，也在本发明的保护范围之内。

在应用时，当需要检测、鉴定某一样品中含有玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫中的哪一种及其含量时，同时使用所述的三套引物和探针分别以待测样品DNA为模板进行PCR鉴定，当引物组qYF2/qYR2和探针qYP的检测结果为特异性阳性时，则表明该样品含有玉米短体线虫；当引物组qNF/qNR和探针qNP的检测结果为特异性阳性时，则表明该样品含有拟玉米短体线虫；当引物组qBF2/qBR1和探针qBP的检测结果为特异性阳性时，则表明该样品含有最短尾短体线虫。

所述引物组qYF2/qYR2和引物组qNF/qNR的退火温度为60℃，所述引物组qBF2/qBR1的退火温度为55℃。

本发明还以上述引物组和探针建立了鉴定、定量检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的实时荧光定量PCR方法：以待测样品DNA为模板，分别利用引物组qYF2/qYR2和探针qYP、引物组qNF/qNR和探针qNP、引物组qBF2/qBR1和探针qBP进行实时荧光定量PCR，根据PCR结果判断样品中含有短体线虫的种类并统计含量。

所述实时荧光定量PCR的反应体系为：2 μL DNA，上、下游引物各0.4 μL （10 μM），探针0.4 μL （10 μM），10 μL 实时荧光定量PCR预混试剂和余量ddH₂O，共20>

其中，所述实时荧光定量PCR预混试剂包括实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合酶，缓冲液和dNTP。

利用引物组qYF2/qYR2和引物组qNF/qNR进行PCR时的反应程序为：预变性95℃ 30s；95℃ 5 s，退火温度60℃ 35 s，共40循环；

利用所述引物组qBF2/qBR1进行PCR时的反应程序为：预变性95℃ 30 s；95℃ 5 s，退火温度55℃ 35 s和72℃ 30 s，共40循环。

另外，上述鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在制备鉴定、检测和/或定量检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的试剂盒方面的应用，也在本发明的保护范围之内。

一种鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包含上述的引物组qYF2/qYR2和探针qYP，引物组qNF/qNR和探针qNP，以及引物组qBF2/qBR1和探针qBP；所述三种短体线虫为玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫。

优选地，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合酶、缓冲液和dNTP。

优选地，使用该试剂盒时，PCR反应体系按照如下比例进行：每20 μL体系中，分别加入2 μL DNA，上下游引物各0.4 μL（10 μM）、探针0.4 μL（10 μM）、10 μL 实时荧光定量PCR预混试剂和余量ddH₂O；其中，所述实时荧光定量PCR预混试剂包括实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合酶，缓冲液和dNTP。

优选地，使用该试剂盒时，利用引物组qYF2/qYR2和引物组qNF/qNR进行PCR时的反应程序为：预变性95℃ 30 s；95℃ 5 s，退火温度60℃ 35 s，共40循环；利用所述引物组qBF2/qBR1进行PCR时的反应程序为：预变性95℃ 30 s；95℃ 5 s，退火温度55℃ 35 s和72℃ 30 s，共40循环。

另外，作为一种优选的可实施方式，该试剂盒的使用方法为：以待测样品DNA为模板，分别利用引物组qYF2/qYR2和探针qYP、引物组qNF/qNR和探针qNP、引物组qBF2/qBR1和探针qBP进行实时荧光定量PCR，根据PCR结果判断样品中含有短体线虫的种类并统计含量。

其中，对于待测样品DNA没有特殊的要求，按照本领域常规方法提取得到的样品DNA均可用于检测。

所述根据PCR结果判断样品中含有短体线虫的种类的标准是：

当引物组qYF2/qYR2和探针qYP的检测结果为特异性阳性时，则表明该样品含有玉米短体线虫；

当引物组qNF/qNR和探针qNP的检测结果为特异性阳性时，则表明该样品含有拟玉米短体线虫；

当引物组qBF2/qBR1和探针qBP的检测结果为特异性阳性时，则表明该样品含有最短尾短体线虫。

上述试剂盒在鉴定、检测和/或定量检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫方面的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一套鉴定甘蔗上玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的实时荧光定量PCR体系的引物和探针，并构建了试剂盒，分别对玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫有非常好的特异性，可准确、高效、精准地鉴定出这三种短体线虫。本发明的这套引物和探针，不仅能够鉴定以及定性检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫，克服了现有技术中三种线虫难以区分的难题，而且，同时还能够进行三种短体线虫含量的定量分析。

此外，本发明的三组特异性引物和探针对玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的检测灵敏性可达到0.01条线虫的DNA（指分别用1条玉米短体线虫、1条拟玉米短体线虫和1条最短尾短体线虫提取的DNA稀释100倍后的DNA模板），灵敏性非常高，有着非常好的应用前景。

附图说明

图1为电泳检测不同退火温度分别对三种短体线虫特异引物扩增效率的影响。A图为玉米短体线虫；B图为拟玉米短体线虫；C图为最短尾短体线虫；A图和B图中M代表MarkerII，1-2为56℃，3-4为58℃，5-6为60℃，7-8为62℃，9-10为清水对照；C图中M代表MarkerII，1-2为51℃，3-4为53℃，5-6为55℃，为7-8为57℃，9-10为清水对照。

图2为实时荧光定量PCR体系分别检测三种短体线虫的引物组和探针的特异性；A图为玉米短体线虫；B图为拟玉米短体线虫；C图为最短尾短体线虫；Y轴表示的是荧光值，X轴表示的是循环数。

图3为实时荧光定量PCR体系分别检测三种短体线虫的引物组和探针的灵敏性；A图为玉米短体线虫；B图为拟玉米短体线虫；C图为最短尾短体线虫；Y轴表示的是荧光值，X轴表示的是循环数。

图4为实时荧光定量PCR体系分别检测三种短体线虫数量的标准曲线；A图为玉米短体线虫；B图为拟玉米短体线虫；C图为最短尾短体线虫；R2表示相关系数；E表示引物的扩增效率。Y轴表示的是Ct值，X轴表示的是线虫的数量。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1 引物探针设计和反应条件优化

1、引物设计

（1）根据NCBI中玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和其他植物寄生线虫的DNA ITS序列设计了玉米短体线虫引物组qYF2/qYR2，特异探针qYP和拟玉米短体线虫引物组qNF/qNP，特异探针qNP。如表1所示。

（2）根据NCBI中最短尾短体线虫和其他植物寄生线虫的线粒体DNA COI序列设计了引物组qBF2和qBR1，以及特异探针qBP。如表1所示。

表1 引物和探针

2、引物反应条件优化

（1）分别使用玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的单条线虫DNA作为模板，分别以不同的退火温度进行PCR扩增，优化上述引物组的退火温度。

所述单条线虫DNA的提取可以按照本领域常规方法进行。本实施例是采用Subbotin et al. (2008)所述方法进行，具体如下：

所述DNA的提取按照本领域常规方法进行。本实施例是采用Subbotin et al. (2008)所述方法进行，具体如下：通过离心法收集线虫或在体视镜下挑取1条线虫，然后加入16 μL灭菌双蒸水，2 μL 10×PCR buffer (无Mg²⁺)>

PCR反应体系为：2 μL DNA，上、下游引物各0.5 μL（10 μM），12.5 μL Taq Mix和余量ddH₂O，共25>

PCR反应条件为：预变性95℃ 3 min；95℃ 30 s，不同退火温度梯度 30 s（玉米短体线虫和拟玉米短体线虫的退火温度56℃~62℃，最短尾退火温度为51~57℃），72℃ 1min，共35循环；

（2）将10 μL PCR产物用1 % 琼脂糖电泳分离，结果如附图1所示，表明三组特异引物都能分别扩增出玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫ITS DNA和COI>

（3）选择条带较亮对应的退火温度，进一步做实时荧光PCR（SYBR法）实验，确定最佳的退火温度。玉米短体线虫和拟玉米短体线虫选择58℃和60℃，最短尾短体线虫选择53℃和55℃。

由于SYBR法实时荧光定量PCR实验中，60 ℃时扩增效率较高，因此选择60℃作为玉米短体线虫和拟玉米短体线虫特异引物组的退火温度。同理，选择55℃作为最短尾短体线虫特异引物组的退火温度。

实施例2 特异性检测

1、根据实施例1所设计的引物和探针，建立了分别检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的实时荧光定量PCR方法：

实时荧光定量PCR反应体系为：2 μL DNA，上、下游引物各0.4 μL（10 μM），探针0.4 μL（10 μM），10 μL 实时荧光定量PCR预混试剂和余量ddH₂O，共20>

玉米短体线虫和拟玉米短体线虫的实时荧光定量PCR反应条件为：预变性95℃ 30s；95℃ 5 s，退火温度60℃ 35 s，共40循环；

最短尾短体线虫的的实时荧光定量PCR反应条件为：预变性95℃ 30 s；95℃ 5 s，退火温度55℃ 35 s和72℃ 30 s，共40循环；

其中，所述实时荧光定量PCR预混试剂包括实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合酶，缓冲液和dNTP。

2、特异性检测

为验证本发明引物组、探针以及实时荧光PCR方法的特异性和有效性，本实施例分别以多个不同种群的玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫和其他非靶标线虫的DNA作为模板，进行检测，实验所用线虫的具体种类如表2所示。

表2 实验中使用的线虫种群及对应的Ct值

注：a. 实时荧光定量PCR体系中使用玉米短体线虫特异性引物组(qYF2/qYR2) 和探针(qYP) 得到的Ct值。

b. 实时荧光定量PCR体系中使用拟玉米短体线虫特异性引物组(qNF/qNR)和探针(qNP) 得到的Ct值。

c. 实时荧光定量PCR体系中使用最短尾短体线虫特异性引物组(qBF2/qBR1)和探针(qBP) 得到的Ct值。

Und：没有信号、未检测到Ct值。

3、结果如表2所示，本发明所述的实时荧光定量PCR方法能有效地鉴定、检测不同种群的靶标线虫（玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫）。并且对非靶标线虫不会有非特异性的扩增，即对非靶标线虫均呈现阴性。

同时，本发明所述的体系能有效地检测到单条的靶标线虫，满足实际的检测和定量需要。

实施例3 检测灵敏性及标准曲线

1、在体视镜下分别挑取1条的玉米短体线虫、1条的拟玉米短体线虫和1条的最短尾短体线虫，按照上述方法提取DNA，然后对DNA样品进行梯度稀释（如表3所示）。

表3 制作标准曲线使用的DNA样品浓度和对应的Ct值

2、以上述各稀释浓度的DNA样品为模板，分别进行实时荧光定量PCR扩增，PCR反应体系和条件与实施例2相同。

3、结果如附图3所示，扩增0.01～1条靶标线虫时都呈现良好的线性关系，说明该体系能准确地定量样品中线虫的数量。

另外，上述结果也说明了本发明所述的实时荧光定量PCR体系分别检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的灵敏性能够达到0.01条线虫的DNA模板。

实施例4 试剂盒组装

1、一种鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述三种短体线虫为玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫；该试剂盒包含以下组分：

（1）引物组qYF2/qYR2和探针qYP，引物组qNF/qNR和探针qNP，以及引物组qBF2/qBR1和探针qBP。

（2）实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合酶、缓冲液和dNTP。

2、上述试剂盒的使用方法为：以待测样品DNA为模板，分别利用引物组qYF2/qYR2和探针qYP、引物组qNF/qNR和探针qNP、引物组qBF2/qBR1和探针qBP进行实时荧光定量PCR，根据PCR结果判断样品中含有短体线虫的种类并统计含量。

具体地，所述根据PCR结果判断样品中含有短体线虫的种类的标准是：

当引物组qYF2/qYR2和探针qYP的检测结果为特异性阳性时，则表明该样品含有玉米短体线虫；

当引物组qNF/qNR和探针qNP的检测结果为特异性阳性时，则表明该样品含有拟玉米短体线虫；

当引物组qBF2/qBR1和探针qBP的检测结果为特异性阳性时，则表明该样品含有最短尾短体线虫。

其中，所述PCR的反应体系按照如下比例进行：每20 μL体系中，分别加入2 μLDNA，上下游引物各0.4 μL、探针0.4 μL、10 μL 实时荧光定量PCR预混试剂和余量ddH₂O；其中，所述实时荧光定量PCR预混试剂包括实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合酶，缓冲液和dNTP。反应程序如下：

利用引物组qYF2/qYR2和引物组qNF/qNR进行PCR时的反应程序为：预变性95℃ 30 s；95℃ 5 s，退火温度60℃ 35 s，共40循环；

利用所述引物组qBF2/qBR1进行PCR时的反应程序为：预变性95℃ 30 s；95℃ 5 s，退火温度55℃ 35 s和72℃ 30 s，共40循环。

SEQUENCE LISTING

<110>华南农业大学

<120>一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量PCR引物和探针及其试剂盒

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<170>PatentIn version 3.3

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<212>DNA

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