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法律状态
2020-02-07
授权
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2016-11-23
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20160630
实质审查的生效
2016-10-26
公开
公开
技术领域
本发明涉及环保技术领域，具体涉及一种检测结核杆菌实验室终末消毒效果的方法。
背景技术
结核病是WHO唯一宣布进入全球紧急状态的疾病，据2000年流行病学调查结果，中国已有5.5亿感染者，其中免疫功能正常者的10%～20%会在一生中的某个时段发病，而结核与艾滋双重感染者则每年的发病风险即高达10%以上，故我国的结核病防控形式不容乐观。结核分枝杆菌为结核病的病原体，主要经呼吸道传播且感染剂量极低，不到10个结核分枝杆菌即可使人患病，最低感染剂量可仅为1个活菌，传染性极强。在国务院办公厅印发的全国结核病防治规划（2011—2015）中明确规定80%以上的县级结核病实验室开展痰培养、100%的地市级结核病实验室开展药敏试验、100%的省级结核病实验室开展快速菌种鉴定，因此今后从事结核分枝杆菌活菌操作的实验室数量将大大增加，相应的生物安全问题不容忽视，尤其是结核实验室终末消毒效果的检测，但我国对于结核实验室终末消毒尚未制定相应的国家或行业标准，因此，用于检测结核杆菌实验室终末消毒效果的方法的相关研究至关重要。
发明内容
针对现有检测结核杆菌实验室终末消毒效果方法的空白，本发明提供一种检测结核杆菌实验室终末消毒效果的方法。本发明的技术方案为：
一种检测结核杆菌实验室终末消毒效果的方法，按照以下工艺步骤进行：
（1）采集终末消毒后的实验室中的擦拭拭子样本和空气样本；
（2）将采集的擦拭拭子样本和空气样本分别与无菌生理盐水混合，充分挤压后涡旋混匀，得到擦拭拭子样本液和空气样本液；
（3）采用DNA基因组提取试剂盒提取擦拭拭子样本液和空气样本液的完整细菌全基因组核酸样本，过程为：
1.取擦拭拭子样本液1mL，加入500μl AHL，室温孵育30min，期间颠倒混匀；
2.10000g离心10min，移除上清，保留固体；
3.在固体中加入混有2.5μl Benzonase的190μl RDD，于37℃、600rpm的震荡条件下孵育30min；
4.加入20μl蛋白酶K，先于3~10℃孵育12~24h，再于56℃、600rpm震荡条件下孵育30min；
5.先3000~6000g瞬时离心，再加入200μl 含Reagent DX的ATL，然后转移至病原裂解管；
6.采用TissusLyser LT 在50Hz下或TissusLyser II 在30Hz下裂解10min；
7.10000g离心1min，充分混合后转移上清至新的离心管中；
8.加入40μl蛋白酶K，漩涡混匀，于56℃、600rpm震荡条件下孵育30min；
9.加入200μl APL2，漩涡混匀30s；
10.70℃孵育10min，期间颠倒混匀；
11.加入200μl 无水乙醇，充分混匀15~30s后得到混合物；
12.取上述混合物700μl加入到离心柱中，6000g离心1min，弃洗脱液；将剩余混合物再次加入同一离心柱中，6000g离心1min，弃洗脱液；
13.将离心柱移入新的离心套管中，加入500μl 缓冲液AW1，6000g离心1min后再次移入新离心套管；
14.加入500μl缓冲液AW2，15000~20000g离心3~5min，转移离心柱至新离心套管中，15000~20000g 离心1~3min；
15.将离心柱移入新的微量离心管，直接向离心柱的膜中心加入20~100μl AVE或无菌双蒸馏水，加盖室温孵育3~10min；
16.6000~8000g离心1~3min，保留洗脱液，得到擦拭拭子样本的完整细菌全基因组核酸样本；
17.将空气样本液按照步骤1~16的过程进行处理，获得空气样本的完整细菌全基因组核酸样本；
（4）以结核分支杆菌复合群特异性插入序列IS6110为靶标，采用Primer5软件设计特异性核酸扩增引物IS6110P，具体为：
上游引物序列为IS6110P-F：5'-TACGGTGCCCGCAAAGTG-3'，
下游引物序列为IS6110P-R：5'-CGCCAGCCCAGGATCCTGCGAGCGT-3'；
（5）分别将擦拭拭子样本和空气样本的完整细菌全基因组核酸样本、上游引物、下游引物、DNA聚合酶及其相应缓冲液、4种dNTP和无菌双蒸水混合进行PCR扩增反应；
（6）采用琼脂糖电泳法检测鉴定擦拭拭子样本和空气样本的扩增产物，并在凝胶成像仪下观察扩增产物并记录检测结果。
上述方法中，所述步骤（1）的擦拭拭子样本的采集方法为：采用聚酯纤维等非棉性拭子经无菌生理盐水湿润后涂抹待检物品，其中对于实验室墙面、生物安全柜台面、生物安全柜外表面、实验台面、冰箱表面、实验室门等具有较大表面积的待检物品的四角及中央进行涂抹采样；对于实验台面把手、冰箱表面把手、实验室门把手以及离心机、恒温金属浴、超声波破碎仪、漩涡震荡混合器和加样器等仪器则只对操作者经常接触的关键部位进行涂抹采样。
上述方法中，所述步骤（1）的空气样本的采集方法包括滤料阻流法或富集采样法，在实验室的四角及中央1.5~1.8m的高度分别采样。
上述方法中，所述步骤（5）的DNA聚合酶包括GoTaq®>® MDx>®>
上述方法中，所述步骤（5）的DNA聚合酶及其相应缓冲液、4种dNTP可直接替换成PCR扩增的预混液，包括GoTaq®>®>®>
上述方法中，所述步骤（5）的PCR扩增反应条件为：先94~96℃预变性5~15min；再依次94~96℃变性28~60s、60℃退火28~90s、72℃延伸28~90s，并将这三个处理阶段循环33~50次，最后在72℃的条件下将产物末端延伸5~25min。
上述方法中，所述步骤（6）的检测结果为：若有274bp的特异性扩增条带检出，表示检测结果为阳性，说明结核杆菌实验室终末消毒未彻底；若无274bp的特异性扩增条带检出，表示检测结果为阴性，说明结核杆菌实验室终末消毒彻底有效。
本发明的有益效果：本发明首次将应用于去除人体基因组的完整细菌基因组提取试剂盒方法应用于结核杆菌实验室终末消毒效果的检测，和结核分枝杆菌分离培养这一金标准的检测结果完全一致（检测时间数周到数月不等），并且本发明的检测时间缩短为24h之内，可以快速、有效且精准地对结核杆菌实验室的消毒效果进行评价。
附图说明
图1为采用常规方法检测结核杆菌实验室终末消毒后擦拭拭子样本的电泳分析效果图，其中：N表示阴性对照；P表示阳性对照；M表示100bpladder分子量标准；1和2为加样器样本；5～8为生物安全柜台面样本；9为实验室门把手样本；10为冰箱把手样本；11～15为实验室台面样本；
图2为采用常规方法检测结核杆菌实验室终末消毒后空气样本的电泳分析效果图，其中：N表示阴性对照；P表示阳性对照；M表示100bpladder分子量标准；1为实验室东北角5min抽滤样本；2为实验室东北角1min抽滤样本；3为实验室东南角5min抽滤样本；4为实验室东南角1min抽滤样本；5为实验室西北角5min抽滤样本；6为实验室西北角1min抽滤样本；7为实验室西南角5min抽滤样本；8为实验室西南角1min抽滤样本；9为实验室中央5min抽滤样本；10为实验室中央1min抽滤样本；注：采样高度为1.5~1.8米；
图1和图2中所述常规方法参照文献：李研，陈省平，赖小敏，等．生物安全三级实验室甲醛熏蒸消毒灭菌效果评价[J]．中国医药生物技术，2012，7（6）：463-465。
图3为采用本发明实施例1的方法检测结核杆菌实验室甲醛终末消毒后擦拭拭子样本的电泳分析效果图，其中：N表示阴性对照；P表示阳性对照；M表示100bpladder分子量标准；1和2为加样器样本；5～8为生物安全柜台面样本；9为实验室门把手样本；10为冰箱把手样本；11～15为实验室台面样本。
图4为采用本发明实施例1的方法检测结核杆菌实验室甲醛终末消毒后空气样本的电泳分析效果图，其中：N表示阴性对照；P表示阳性对照；M表示100bpladder分子量标准；1为实验室东北角5min抽滤样本；2为实验室东北角1min抽滤样本；3为实验室东南角5min抽滤样本；4为实验室东南角1min抽滤样本；5为实验室西北角5min抽滤样本；6为实验室西北角1min抽滤样本；7为实验室西南角5min抽滤样本；8为实验室西南角1min抽滤样本；9为实验室中央5min抽滤样本；10为实验室中央1min抽滤样本。
具体实施方式
本发明实施例中选择辽宁省三家不同结核杆菌实验室在通过甲醛法进行终末消毒以杀灭所有病原微生物后，采用本发明方法对它们的终末消毒效果进行检测。
本发明实施所采用的结核分支杆菌标准菌株（H37Rv，ATCC27294）由中国疾病预防控制中心结核病控制中心参比实验室提供。
实施例1
一种检测结核杆菌实验室终末消毒效果的方法，按照以下工艺步骤进行：
（1）采用聚酯纤维拭子经无菌生理盐水湿润后涂抹待检物品：结核杆菌实验室生物安全柜台面、实验室台面的四角及中央，涂抹面积为平面5×5cm2；以及操作者经常接触的实验室门把手、冰箱把手和加样器，获得一系列的擦拭拭子样本；
采用0.3 μm的滤膜、以5 L/min的流速在1.5~1.8m的高度于结核杆菌实验室的四角及中央采集1 min和5 min的样本各1次，获得一系列的空气样本；
（2）将采集的一系列擦拭拭子样本和空气样本分别与2mL无菌生理盐水混合，充分挤压后涡旋混匀5min，得到擦拭拭子样本液和空气样本液；
（3）采用DNA基因组提取试剂盒提取擦拭拭子样本液和空气样本液的完整细菌全基因组核酸样本，过程为：
1.取擦拭拭子样本液1mL，加入500μl AHL，室温孵育30min，期间颠倒混匀；
2.10000g离心10min，移除上清，保留固体；
3.在固体中加入混有2.5μl Benzonase的190μl RDD，于37℃、600rpm的震荡条件下孵育30min；
4.加入20μl蛋白酶K，先于3℃孵育12h，再于56℃、600rpm震荡条件下孵育30min；
5.先3000g瞬时离心，再加入200μl 含Reagent DX的ATL，然后转移至病原裂解管；
6.采用TissusLyser LT 在50Hz下裂解10min；
7.10000g离心1min，充分混合后转移上清至新的离心管中；
8.加入40μl蛋白酶K，漩涡混匀，于56℃、600rpm震荡条件下孵育30min；
9.加入200μl APL2，漩涡混匀30s；
10.70℃孵育10min，期间颠倒混匀；
11.加入200μl 无水乙醇，充分混匀15s后得混合物；
12.取上述混合物700μl加入到离心柱中，6000g离心1min，弃洗脱液；将剩余物再次加入同一离心柱中，6000g离心1min，弃洗脱液；
13.将离心柱移入新的离心套管中，加入500μl 缓冲液AW1，6000g离心1min后再次移入新离心套管；
14.加入500μl缓冲液AW2，15000g离心3min，转移离心柱至新2ml离心管中，15000g 离心1min；
15.将离心柱移入新的微量离心管，直接向离心柱的膜中心加入20μl AVE或无菌双蒸馏水，加盖室温孵育3min；
16.6000g离心1min，保留洗脱液，得到擦拭拭子样本的完整细菌全基因组核酸样本；
17.将空气样本液按照步骤1~16的过程进行处理，获得空气样本的完整细菌全基因组核酸样本；
（4）以结核分支杆菌复合群特异性插入序列IS6110为靶标，采用Primer5软件设计特异性核酸扩增引物IS6110P，具体为：
上游引物序列为IS6110P-F：5'-TACGGTGCCCGCAAAGTG-3'，
下游引物序列为IS6110P-R：5'-CGCCAGCCCAGGATCCTGCGAGCGT-3'；
（5）分别将擦拭拭子样本和空气样本的完整细菌全基因组核酸样本、上游引物、下游引物、Go Taq®>
（6）采用琼脂糖电泳法检测鉴定擦拭拭子样本和空气样本的扩增产物，并在凝胶成像仪下观察扩增产物并记录检测结果，擦拭拭子样本和空气样本扩增产物的电泳分析结果分别如图3和4所示，无274bp的特异性扩增条带检出，表示检测结果为阴性。
而常规检测方法的样本电泳分析结果如图1和2所示，图1中有274bp的特异性扩增条带检出，表示检测结果为阳性，图2中无274bp的特异性扩增条带检出，表示检测结果为阴性；
采用结核分枝杆菌分离培养这一金标准方法进行检测，结果与本实施例的一致，显示无结核分枝杆菌生长，说明采用本实施例的方法检测结核杆菌实验室终末消毒结果可信，该结核杆菌实验室甲醛终末消毒彻底有效。
实施例2
一种检测结核杆菌实验室终末消毒效果的方法，按照以下工艺步骤进行：
（1）采用聚酯纤维拭子经无菌生理盐水湿润后涂抹待检物品：结核杆菌实验室生物安全柜台面、实验室台面、墙面、冰箱表面的四角及中央，涂抹面积为平面5×5cm2；以及操作者经常接触的实验室门把手、冰箱把手、离心机和加样器，获得一系列的擦拭拭子样本；
采用0.3 μm的滤膜、以5 L/min的流速在1.5~1.8m的高度于结核杆菌实验室的四角及中央采集1 min和5 min的样本各1次，获得一系列的空气样本；
（2）将采集的一系列擦拭拭子样本和空气样本分别与2mL无菌生理盐水混合，充分挤压后涡旋混匀5min，得到擦拭拭子样本液和空气样本液；
（3）采用DNA基因组提取试剂盒提取擦拭拭子样本液和空气样本液的完整细菌全基因组核酸样本，过程为：
1.取擦拭拭子样本液1mL，加入500μl AHL，室温孵育30min，期间颠倒混匀；
2.10000g离心10min，移除上清，保留固体；
3.在固体中加入混有2.5μl Benzonase的190μl RDD，于37℃、600rpm的震荡条件下孵育30min；
4.加入20μl蛋白酶K，先于5℃孵育20h，再于56℃、600rpm震荡条件下孵育30min；
5.先6000g瞬时离心，再加入200μl 含Reagent DX的ATL，然后转移至病原裂解管；
6.采用TissusLyser LT 在50Hz下裂解10min；
7.10000g离心1min，充分混合后转移上清至新的离心管中；
8.加入40μl蛋白酶K，漩涡混匀，于56℃、600rpm震荡条件下孵育30min；
9.加入200μl APL2，漩涡混匀30s；
10.70℃孵育10min，期间颠倒混匀；
11.加入200μl 无水乙醇，充分混匀20s后得混合物；
12.取上述混合物700μl加入到离心柱中，6000g离心1min，弃洗脱液；将剩余物再次加入同一离心柱中，6000g离心1min，弃洗脱液；
13.将离心柱移入新的离心套管中，加入500μl 缓冲液AW1，6000g离心1min后再次移入新离心套管；
14.加入500μl缓冲液AW2，15000g离心3min，转移离心柱至新2ml离心管中，15000g 离心2min；
15.将离心柱移入新的微量离心管，直接向离心柱的膜中心加入50μl AVE或无菌双蒸馏水，加盖室温孵育5min；
16.6000g离心1min，保留洗脱液，得到擦拭拭子样本的完整细菌全基因组核酸样本；
17.将空气样本液按照步骤1~16的过程进行处理，获得空气样本的完整细菌全基因组核酸样本；
（4）以结核分支杆菌复合群特异性插入序列IS6110为靶标，采用Primer5软件设计特异性核酸扩增引物IS6110P，具体为：
上游引物序列为IS6110P-F：5'-TACGGTGCCCGCAAAGTG-3'，
下游引物序列为IS6110P-R：5'-CGCCAGCCCAGGATCCTGCGAGCGT-3'；
（5）分别将擦拭拭子样本和空气样本的完整细菌全基因组核酸样本、上游引物、下游引物、Go Taq®>
（6）采用琼脂糖电泳法检测鉴定擦拭拭子样本和空气样本的扩增产物，并在凝胶成像仪下观察扩增产物并记录检测结果，擦拭拭子样本和空气样本扩增产物的电泳分析结果显示无274bp的特异性扩增条带检出，表示检测结果为阴性。
采用结核分枝杆菌分离培养这一金标准方法进行检测，结果与本实施例的一致，显示无结核分枝杆菌生长，说明采用本实施例的方法检测结核杆菌实验室终末消毒结果可信，该结核杆菌实验室甲醛终末消毒彻底有效。
实施例3
一种检测结核杆菌实验室终末消毒效果的方法，按照以下工艺步骤进行：
（1）采用聚酯纤维拭子经无菌生理盐水湿润后涂抹待检物品：结核杆菌实验室生物安全柜台面、生物安全柜外表面、实验室台面、实验室门的四角及中央，涂抹面积为平面5×5cm2；以及操作者经常接触的实验室门把手、离心机、超声波破碎仪、漩涡震荡混合器、冰箱把手和加样器，获得一系列的擦拭拭子样本；
采用0.3 μm的滤膜、以5 L/min的流速在1.5~1.8m的高度于结核杆菌实验室的四角及中央采集1 min和5 min的样本各1次，获得一系列的空气样本；
（2）将采集的一系列擦拭拭子样本和空气样本分别与2mL无菌生理盐水混合，充分挤压后涡旋混匀5min，得到擦拭拭子样本液和空气样本液；
（3）采用DNA基因组提取试剂盒提取擦拭拭子样本液和空气样本液的完整细菌全基因组核酸样本，过程为：
1.取擦拭拭子样本液1mL，加入500μl AHL，室温孵育30min，期间颠倒混匀；
2.10000g离心10min，移除上清，保留固体；
3.在固体中加入混有2.5μl Benzonase的190μl RDD，于37℃、600rpm的震荡条件下孵育30min；
4.加入20μl蛋白酶K，先于10℃孵育24h，再于56℃、600rpm震荡条件下孵育30min；
5.先4000g瞬时离心，再加入200μl 含Reagent DX的ATL，然后转移至病原裂解管；
6.采用TissusLyser LT 在50Hz下裂解10min；
7.10000g离心1min，充分混合后转移上清至新的离心管中；
8.加入40μl蛋白酶K，漩涡混匀，于56℃、600rpm震荡条件下孵育30min；
9.加入200μl APL2，漩涡混匀30s；
10.70℃孵育10min，期间颠倒混匀；
11.加入200μl 无水乙醇，充分混匀20s后得混合物；
12.取上述混合物700μl加入到离心柱中，6000g离心1min，弃洗脱液；将剩余物再次加入同一离心柱中，6000g离心1min，弃洗脱液；
13.将离心柱移入新的离心套管中，加入500μl 缓冲液AW1，6000g离心1min后再次移入新离心套管；
14.加入500μl缓冲液AW2，15000g离心3min，转移离心柱至新2ml离心管中，15000g 离心1min；
15.将离心柱移入新的微量离心管，直接向离心柱的膜中心加入100μl AVE或无菌双蒸馏水，加盖室温孵育5min；
16.7000g离心1min，保留洗脱液，得到擦拭拭子样本的完整细菌全基因组核酸样本；
17.将空气样本液按照步骤1~16的过程进行处理，获得空气样本的完整细菌全基因组核酸样本；
（4）以结核分支杆菌复合群特异性插入序列IS6110为靶标，采用Primer5软件设计特异性核酸扩增引物IS6110P，具体为：
上游引物序列为IS6110P-F：5'-TACGGTGCCCGCAAAGTG-3'，
下游引物序列为IS6110P-R：5'-CGCCAGCCCAGGATCCTGCGAGCGT-3'；
（5）分别将擦拭拭子样本和空气样本的完整细菌全基因组核酸样本、上游引物、下游引物、Go Taq®>
（6）采用琼脂糖电泳法检测鉴定擦拭拭子样本和空气样本的扩增产物，并在凝胶成像仪下观察扩增产物并记录检测结果，擦拭拭子样本和空气样本扩增产物的电泳分析结果显示无274bp的特异性扩增条带检出，表示检测结果为阴性。
采用结核分枝杆菌分离培养这一金标准方法进行检测，结果与本实施例的一致，显示无结核分枝杆菌生长，说明采用本实施例的方法检测结核杆菌实验室终末消毒结果可信，该结核杆菌实验室甲醛终末消毒彻底有效。
机译： 用于检测结核杆菌的引物以及用其检测人结核杆菌的方法
机译： 用于检测结核杆菌的探针和引物以及用其检测人结核杆菌的方法
机译： 用于检测结核杆菌的探针和底漆，以及由此检测人结核杆菌的方法
