大熊猫促卵泡素β亚基单克隆抗体的制备及应用

摘要

本发明公开了一种大熊猫促卵泡素β亚基单克隆抗体的制备及应用，抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株09199，保藏编号：CCTCC NO：C2016144。本发明利用细胞融合技术，建立分泌抗FSHβ亚基单克隆抗体的杂交瘤细胞株，收集并纯化细胞株培养上清，获得高特异性FSHβ亚基单克隆抗体，并建立高特异性的FSHβ亚基单克隆抗体应用于Western Blot蛋白检测，为FSH蛋白的定位和组织表达信息，及利用FSHβ亚基高特异性的单克隆抗体对FSH受体的配体、拮抗物、抗拮抗物进行深入研究，为特异性配体、拮抗物、抗拮抗物的发现创造条件。同时为进一步探讨FSH分泌及基因进一步调控，揭示生殖生理规律，提供了新的资料和思路。

说明书

技术领域

本发明涉及一种特异的单克隆抗体的制备，特别是用于大熊猫促卵泡素蛋白的检测。

背景技术

促卵泡素(FSH)是脑垂体前叶嗜碱性细胞分泌的糖蛋白激素。在卵巢中，促卵泡素刺激尚未成熟的卵泡的生长，卵泡在生长过程中会释放抑制素以阻断卵泡刺激素的进一步合成。这一机制保证了排卵的选择性。在黄体化阶段的末尾，卵泡刺激素水平也有小幅度提升，可能与下一个排卵周期的开始有关。睾丸中，卵泡刺激素提高塞尔托利细胞合成男性激素结合蛋白的水平，诱发塞尔托利细胞的紧密结合，同时分泌抑制素，在成精子过程中起到至关重要的作用。促卵泡素(FSH)活性形式是糖基化的异源二聚体，由α和β两个亚基组成，β亚基决定激素的特异抗原性和特异功能，但需与α亚基结合才具有生物学活性。促黄体素，甲状腺激素，等糖蛋白激素采用了与促卵泡素相似的结构。它们共享同样的α亚基，而β亚基则随激素的不同而不同。因此，FSHβ亚基是FSH唯一的特异亚基，由129氨基酸编码的蛋白，约14kd，具有活性的二聚体FSH约28kd。由于种属差异的原因，目前没有特异的抗大熊猫FSH特异抗体。

发明内容

本发明目的是提供一种抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株、抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体及制备方法，解决现有技术中没有特异的抗大熊猫FSH特异抗体的问题。

本发明的技术方案为：抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株09199，保藏编号：CCTCC NO：C2016144，2016年7月20日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏。

抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株09199用于产生抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体。

抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体，由杂交瘤细胞株09199产生，亚型为IgG1。

抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体在western blot技术中的应用。

抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体的制备方法，步骤如下：

(1)设计大熊猫FSHβ特异序列SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如下：

LVYKDPARPNIQKICTFKELAYETVKVPGC，并与KLH偶联，作为生产特异性抗体的免疫原FSHβ-KLH；

(2)以步骤(1)制备的免疫原FSHβ-KLH免疫小鼠；

(3)细胞融和得到抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株09199；

(4)扩大培养得到抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明利用细胞融合技术，建立分泌抗FSHβ亚基单克隆抗体的杂交瘤细胞株，收集并纯化细胞株培养上清，获得高特异性FSHβ亚基单克隆抗体，并建立高特异性的FSHβ亚基单克隆抗体应用于Western Blot蛋白检测，为FSH蛋白的定位和组织表达信息，及利用FSHβ亚基高特异性的单克隆抗体对FSH受体的配体、拮抗物、抗拮抗物进行深入研究，为特异性配体、拮抗物、抗拮抗物的发现创造条件。同时为进一步探讨FSH分泌及基因进一步调控，揭示生殖生理规律，提供了新的资料和思路。

保藏信息：本发明的抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株09199，于2016年7月20日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏，保藏编号：CCTCC NO：C2016144，地址：中国武汉.武汉大学

附图说明

图1为实施例2中细胞蛋白浓度的标准曲线图。

图2为实施例2中Western-blot检测结果。

具体实施方式

特异性抗大熊猫FSHβ单克隆抗体的制备方法，具有以下步骤：

1)特异多肽片段的设计与合成：根据大熊猫FSHβ亚基蛋白序列(NP_001291794)，参考其它物种序列分析，设计了大熊猫FSHβ亚基特异的序列SEQ ID NO:1所示:LVYKDPARPNIQKICTFKELAYETVKVPGC，人工合成这段特异的多肽片段，并与KLH偶联，增强免疫原性作为生产特异性抗体的免疫原(FSHβ-KLH)，此部分委托上海生工生物公司完成。

2)小鼠免疫：用佐剂：抗原＝1:1(偶联多肽FSHβ-KLH)的混合液，乳化完全后，腹腔注射。首次免疫佐剂为服饰完全佐剂，后续免疫佐剂为服饰不完全佐剂，首次免疫小鼠之前,尾部采取小鼠血液,分离血清，作为阴性对照。多次免疫，直至血清效价达标为止。

3)细胞融合：包括常规方法进行细胞融合(包括SP2细胞的准备，饲养层细胞制备，脾细胞的制备)、HAT选择性培养以及ELISA法筛选，得到杂交瘤细胞。

4)对上述得到的杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，通过有限稀释法得到抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株09199，并进行亚型鉴定。

5)得到的特异性抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株大量培养，收集细胞培养上清，纯化并浓缩得到特异性抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体。

抗大熊猫FSHβ单克隆抗体在western blot技术的应用，具有以下步骤：

(1)目的蛋白表达组织总蛋白的提取：成年大熊猫睾丸和卵巢组织总蛋白的提取，蛋白提取试剂盒：C510004-0020，生工生物工程(上海)股份有限公司，所有操作步骤按试剂盒说明书进行。

(2)睾丸和卵巢组织总蛋白浓度的测定：BCA试剂盒，C503021-0500，生工生物工程(上海)股份有限公司，所有操作步骤按试剂盒说明书进行。

(3)Western blot检测应用：按常规Western blot技术方案进行，首先目的蛋白电泳分离，然后转膜，封闭，再进行抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体孵育和二抗Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)孵育，最后进行ECL曝光。

实施例1

1.抗大熊猫FSHβ单克隆抗体的制备

1.1特异多肽片段的设计与合成：根据NCBI数据库大熊猫FSHβ亚基氨基酸序列，登录号：NP_001291794，序列为：

MKSVQLCFLFCCWRAICCKSCELTNITITVEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKICTFKELAYETVKVPGCAHQADSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFNEMKE,并参考其它物种序列分析，设计了大熊猫FSHβ特异序列

LVYKDPARPNIQKICTFKELAYETVKVPGC(FSHβ-1)，并通过人工合成，并与KLH(匙空血蓝蛋白)偶联，作文生产特异性抗体的免疫原(FSHβ-KLH)。对于多肽片段的合成，此工艺比较成熟，通过本申请公开的序列，生工生物工程(上海)股份有限公司即可生产出多肽片段FSHβ-1以及免疫原FSHβ-KLH

1.2抗原小鼠免疫：用佐剂：抗原＝1:1的混合液接种，(抗原量不够可与氯化钠混合后再与佐剂乳化)。首免用弗氏完全佐剂，后面免疫用弗氏不完全佐剂。免疫之前准备好灭菌的注射器、三通管、一次性注射器。先用灭菌好的注射器将抗原和NaCl吸进注射器中(共400ul，四只的量)，再用灭菌好的注射器将佐剂吸入注射器中(共400ul，四只的量)；最后将灭菌好的注射器连在三通管中进行乳化(乳化大概10多分钟，至油包水状态即可)，最后再将融合好的混合液转入一次性注射器中进行注射。

第1天：腹腔注射，200ul一只。(抗原量为100ug/只)

第14天：腹腔注射，200ul一只。(之后抗原都为50ug/只)

第21天：腹腔注射，200ul一只。

第27天：腹腔注射，200ul一只。

…………………

(第三次免疫后3到4天可小鼠尾部采血，12000rmp,8min，取血清测定其效价，以FSHβ-1，包被浓度为2ug/ml作为抗原，ELISA方法检测血清效价,效价达标后即可准备融合，效价不够高者需继续免疫直至达标。)

1.3细胞融合：

1.3.1骨髓瘤细胞(SP2)的复苏：先从液氮中取出冻存好的细胞，快速放于37℃水浴锅中融化，使细胞松散；再将细胞放入15ml的离心管中，再取大概5ml的PBS，混匀，1000rpm，5min，离心，弃上清，重复两次清洗SP2细胞，将细胞养在培养瓶中，做好标记，最后将培养瓶放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

1.3.2SP2细胞的传代：当培养瓶中的细胞长满瓶底80％左右，就可进行细胞传代。用枪头将细胞吹打下来，将培养液吸出至15ml离心管内1000r/min，离心5分钟；弃上清，加PBS5ml，吹打混匀，再次离心弃上清，重复PBS洗涤步骤2次。洗涤完后加2ml 10％完全培养液重悬细胞，取适量细胞至培养瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养。

1.3.3滋养层巨噬细胞的制备(融合前一天可准备)：

小鼠脱颈椎致死，注意断颈椎时尽量减少对腹腔的压迫，避免损伤腹腔内血管，以防饲养细胞内含有大量血细胞。将小鼠浸泡于75％酒精中5分钟，然后手提住小鼠尾巴，上下于酒精中涮洗数次。置于无菌平皿中。用无菌剪刀从后腹剪开皮肤，用手将两侧皮肤撕开，暴露腹部，注意不要损伤腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜。用注射器吸取6-8ml的含双抗的不完全培养基注射入腹腔(双抗:不完全培养液＝1:100)，注意注射时用镊子提起腹膜，避免针头刺到肠管等腹腔脏器。用棉球轻轻按摩腹部一分钟，吸出注入的培养液，转入离心管中。1000r/min离心5min，弃去上清。再用PBS洗涤四次。将细胞重悬于10％的完全培养液中。

将上述细胞悬液加入96孔板，每孔加100ul,最后将96孔板放入CO₂的培养箱培养。(巨噬细胞不易过多，可视情况丢弃一部分收集到的细胞。)

1.3.4免疫脾细胞制备：

(1)取小鼠脾脏

取达到免疫要求的小鼠。首先要注意无菌操作，以防细胞污染，处死小鼠后，将其在75％的酒精中浸泡五分钟左右，放在无菌的平皿中，摆放在利于自己操作的位置(超净台中)，进行解剖。先用剪刀将小鼠尾部剪一个小口，再用手剖开皮毛层，用酒精棉球轻拭剖开部位，再用镊子挑起包裹内脏的那层半透明的薄膜，将其剪开，暴露出脾脏，轻轻取出脾脏，并尽量去除上面的脂肪组织，将取出的脾脏至于PBS中洗涤。

(2)脾细胞悬液制备

先用PBS洗涤脾脏，涮洗3次左右，将脾脏置于平皿中，用剪刀将脾脏尽可能的剪碎，加PBS洗涤过滤，不要组织细胞，收集分离的脾细胞悬液，1000r/min，离心5分钟，弃上清；再用5mlPBS洗涤，1000r/min，离心5分钟；重复三次,洗涤完后加2ml不完全培养液(DMEM)重悬细胞，稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。

(3)SP2细胞悬液的制备：用胶头吸管将吸取细胞液吸气吹打培养瓶底部的薄膜(细胞均为悬浮或轻微帖壁生长)，再将细胞液用加样抢转移至15ml离心管内1000r/min，离心5分钟；弃上清，再加PBS5ml，混匀，1000r/min，离心5分钟，重复洗涤两次，洗涤完后加2ml不完全培养液(DMEM)重悬细胞，稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。

1.3.5PEG作用下进行细胞融合

将SP2与脾细胞按1：4(1:10至1:4之间)的比例混合在一起，离心，600rpm,3min；弃上清。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。1min内缓慢加入37℃预热好的0.6ml 50％PEG溶液，边加边轻微摇动和叩击。加完后静置1min。37℃预热好的不完全培养液10ml以终止PEG作用，边滴边叩击并旋转离心管，匀速加入，加完后静置2min。离心，800rpm，5min，弃上清；再用PBS或不完全培养液洗涤2次，以去除PEG。

洗涤完后弃上清，用10mlHAT选择培养液重悬细胞。上述细胞加到已有饲养细胞层的96孔板内(用的是之前制备的巨噬细胞板，先将孔中的液体吸出不要，再用不完全培养液洗涤一次，吸出液体)，每孔加100ul；将培养板置CO₂培养箱中培养。4个小时之后再向孔中加入含HAT的完全培养液(19.6ml10％完全培养液+0.4mlHAT)，每孔加100ul；将培养板置CO₂培养箱中培养。

1.3.6选择培养

(1)融合培养的第四天半液法换HAT培养液：用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100ul，弃掉，再加入新的每孔100ulHAT培养液(HAT培养液配制为：10％的完全培养液：HAT＝1:50)，每块板子需要在10ml完全培养液中加入200ul 50×HAT。

(2)融合培养的第七天半液法换HT培养液：用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100ul，弃掉，再加入新的每孔100ulHT培养液(HT培养液的配制为：10％的完全培养液：HT＝1:50)，每块板子需要在10ml完全培养液中加入200ul 50×HT。

1.3.7阳性克隆筛选

在培养7天左右可见孔内明显的克隆细胞，待克隆细胞长得足够多时(大概在第12天左右)，可吸取培养液检测其有无分泌抗体。

(1)先将之前包被好的相应的ELISA(包被FSHβ-1，包被浓度为2ug/ml)板子从冰箱拿出让其恢复室温，再向板中加入要检测的培养液100ul每一孔，两孔做阴阳性对照，阴性对照用10％的培养液，阳性对照用稀释10000倍的血清(融合前小鼠眼眶采血的血清)。

(2)孵育：用封板膜封板后置37℃孵育箱中孵育1小时。

(3)洗涤：小心揭掉封板膜，洗涤4遍，最后尽量扣干水分。

(4)加双抗：双抗稀释10000倍，50ul每孔。

(5)孵育：用封板膜封板后置37℃孵育30分钟。

(6)洗涤：小心揭掉封板膜，洗涤4遍，最后尽量扣干水分。

(7)显色：每孔加显色剂TMB100ul，轻轻振荡混匀，孵育箱显色大概10min。

(8)比色测定：每孔加终止液50ul(终止液＝21.5ml的浓硫酸定容至200ml)，轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长为450nm，测定各孔值。

选取阳性结果高者(至少为阴性对照的4倍)，作为阳性克隆孔。

1.3.7有限稀释法筛选抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株

(1)阳性孔细胞的计数：将筛选得到的阳性克隆孔孔可做有限稀释。先将孔中的细胞转移到15ml的离心管中(边吹打边旋转，使细胞悬浮)，再补加10％的完全培养液至2ml；再用计数板计数，计数之后取只含1000个细胞的细胞液进行下一步实验(由于1个孔只需要一个细胞，96孔板一板就需要大约100个细胞，10板就是1000个细胞)。

(2)将细胞液加入200ml完全培养液中，混匀，96孔板加样，200ul/孔，共十块96孔板。

(3)最后将培养板置CO2培养箱中培养。

(4)培养4-5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，观察细胞的生长情况，记录单个细胞生长聚集的孔。

(5)培养第5天给有记录单个细胞生长聚集的孔进行换液，加10％完全培养液100ul/孔。

(6)第8-9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测，将由单个细胞生长聚集的孔并且生长情况比较好的孔进行培养液的检测(ELSIA检测)，阳性强的孔即为抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株。本发明最终筛选得到一株抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株09199。

1.3.8亚型鉴定

使用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit 37503试剂盒进行亚型鉴定。

准备工作：将试剂盒中TBS溶于500ml双蒸水中，用于稀释样品，870ml双蒸水与30ml30X Wash Buffer混匀，用于洗板，根据所做样品的量确定需要多少条板子，其余放回4℃冰箱保存，准备450ul的样品稀释液，吸取20ul的细胞培养液加入980ul的TBS中混匀。

实验步骤：将板子平衡到室温，加入待测样品到每孔，50ul/孔，每个样需加8孔即一条，加入50ul/孔的Goat Anti-Mouse IgG+IgA+IgM HRP，轻柔的晃动板子混匀盖上封板膜，室温孵育一个小时，洗板4次，扣干水分，加入75ul/孔的TMB显色液显色，将会看到孔内液体变成蓝色，显色5-15min之后加入75ul/孔的终止液终止反应，液体由蓝色变为黄色。经鉴定筛选所得到的抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株09199所分泌的抗体亚型为IgG1型。

1.3.9单克隆抗体的扩大培养及纯化，浓缩。

(1)批量培养：将进行了亚型鉴定，结果为单抗的细胞孔转移到24孔板中(边旋转边吹打，使细胞悬浮，进行完全转移)培养，并加600ul的10％完全培养液培养。

(2)观察细胞的生长情况，长得比较多之后进行效价测定，效价高的细胞进行转移，转移到小的培养瓶中培养(先将24孔板中的细胞吹打使细胞悬浮，在用加样枪将细胞转移到培养瓶中，补加10％的完全培养液7ml)。

(3)观察细胞生长情况，长得比较好之后再转移至大的培养瓶中培养。一个小的培养瓶分别转移两个大的培养瓶中进行培养(细胞传代)。

(4)可多传几个培养瓶培养，冻存一部分细胞，再拿培养液进行抗体过柱纯化。所用柱子为所用填料为Pierce Protein G Agarose，并用10000kda超滤管浓缩纯化过的抗大熊猫FSHβ单克隆抗体，-20度保存备用。

1.3.10单克隆抗体细胞株冻存

将鉴定的抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株09199培养稳定后，将培养瓶中的细胞吹打使细胞悬浮在培养液中(细胞一般悬浮在培养液中或贴壁生长)，在将细胞转移至15ml的离心管中。离心，1000转/5分钟。用PBS洗涤两次：先将离心管中的上清液吸出，弃掉，加PBS，混匀，离心1000转/5分钟，最后重复一次。最后再用加样枪吸出上清液，再向细胞中加入适量冻存液(冻存液＝5ml血清+4mlDMEM+1mlDMSO,颠倒混匀，过滤备用)，混匀。最后加入冻存管中，每管1ml细胞液。放入冻存盒，先放-80℃过夜，再将细胞株B10放入液氮中长期保存备用。

实施例2

抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体在western blot技术中的应用。

1.目的组织总蛋白的提取

应用蛋白提取试剂盒：C510004-0020，生工生物工程(上海)股份有限公司提供，提取成年大熊猫睾丸和卵巢组织总蛋白，并通过BCA法对总蛋白浓度进行测定。

2制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶5％，分离胶12％。

4.制样：蛋白上样量为80ug

5.电泳：浓缩胶80V，30min；分离胶120V，90min。

6.转膜：250mA，40min。

7.封闭：5％脱脂乳，37℃缓慢震荡2h。

8.孵育一抗：杂交瘤细胞株09199(2)、C12(3)抗体均1:500稀释，4℃缓慢振荡过夜，次日37℃复温1h。

9.孵育二抗：1:8000稀释，37℃孵育1h。

10.ECL曝光。

应用结果

1.细胞蛋白浓度

(1)标准曲线

标准曲线图如图1所示。

(2)蛋白浓度

(3)Western-blot检测结果如图2所示。

本发明开发的抗大熊猫FSHβ亚基单克隆抗体，能准备识别目标蛋白FSH,为为FSH蛋白的定位和组织表达信息，及利用FSH高特异性的单克隆抗体对FSH受体的配体、拮抗物、抗拮抗物进行深入研究，为特异性配体、拮抗物、抗拮抗物的发现创造条件。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。