一套评测杀菌剂对自苹果花器侵染病害防治效果的方法

摘要

本发明公开了一套评测杀菌剂对自苹果花器侵染病害防治效果的方法，涉及植物病害防治药剂评测技术。针对病菌通过花器侵染果实的特点，本发明用苹果和海棠的干制花朵为基质，在干制花朵上接种靶标病菌，进行杀菌剂处理，并对接种病菌和药剂处理的干制花朵进行保湿培养，诱导靶标病菌在干制的花朵产生孢子，最后通过检查病菌是否产孢及产生孢子密度，评测杀菌剂对抑制病菌定殖花器和（或）铲除定殖花器病菌的效果。克服了田间药效试验周期长、费用高、成功率低，室内药剂筛选与实际应用效果差异大等问题，为苹果霉心病、黑点防治药剂的筛选提供一套简便、可靠的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病害防治药剂评测技术，尤其适用于评测防治自花器侵染病害杀菌剂的效果。

背景技术

苹果霉心病是苹果上的重要病害。霉心病在元帅系品种上病果率可达40%~50%，在大面积载培的富士苹果品种上，霉心病每年的病果率也不低于5%。目前研究认为，引起霉心病的真菌有多种，霉心病菌主要在苹果花期和幼果期侵染花柱、花瓣、花萼等部位，病菌在花器上定殖后，再沿花柱逐渐侵入果实内部，并在果实生长后期和贮藏期引起霉心病。

套袋苹果黑点病是套袋苹果上的重要病害。苹果套袋栽培是20世纪90年代推广的一项新技术，目前我国80%以上的苹果都实施了套袋栽培。苹果果实从5月下旬套袋到10月初解袋，果实的生长都处在果袋保护中。果实套袋有效控制了雨传病害和蛀果害虫的危害，降低了果实中农药的残留量，提高了的外观品质。然而，果实套袋后改变了果实表面的微生态环境，诱发了一种新的病害，即套袋果实黑点病，套袋苹果黑点病每年造成的产量损失为3%~30%。

套袋苹果黑点病由多种弱寄生菌单独或复合侵染所致，致病菌首先侵染残败的花器，在花器上定殖生长，当遇到持续高湿后，产生大量孢子散播到果实表面，自幼嫩果皮或自然裂口侵染，导致果肉组织坏死，形成黑点病斑。

筛选能抑制病菌在花器上定殖和（或）铲除定殖在花器病原菌的杀菌剂，防止病菌在残花上定殖和（或）铲除残花上已定殖的病菌是防治苹果霉心病和套袋果实黑点病的重要措施。

常规的药剂评测方法有孢子萌发法和菌丝生长抑制法，两种方法离体条件下完成。具体方法是从病组织上分离获得纯培养的病原菌，然后在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基或水琼脂中加入一定浓度的杀菌剂，再将纯培养病菌的分生孢子或菌丝接种到含药培养基中，在适宜的温湿度下培养一定时间后，检查药剂对孢子萌发和菌丝生长的抑制率，从而筛选出有效的防治药剂。

田间药效试验也是评测杀菌剂的防治效果的有效方法，筛选防治苹果霉心病和黑点病的杀菌剂需要在花期施药，在果实采收期，根据果实的发病率评价杀菌剂的防治效果，并筛选出有效的防治药剂。

离体评测法虽然简便快速，但纯培养条件与花器的营养和微生态环境差异较大，所筛选出的杀菌剂与实际的防治效果差异很大；田间药效试验周期长，成本高，而且受降雨、病菌数量等条件的影响，试验成功率不高，试验效果不稳定。

发明内容

针对目前的问题和缺陷，本发明的目的在于提供一套简便、可靠的技术与方法，用于快速评测杀菌剂抑制病菌定殖花器和（或）铲除花器上定殖原菌的效果，为苹果霉心病、黑点防治药剂的筛选提供一套新的方法。

本发明采用的技术原理和方案如下：以苹果或海棠的干制花朵作培养基质，在干制花朵上，通过喷雾接种靶标病菌的孢子，并经过短期保湿培养后，再喷施杀菌剂，喷施杀菌剂后，再培养一定时间，直到没有喷药的对照花朵产孢后，检查干制花朵上病原菌产生孢子的密度，根据孢子密度，评测不同杀菌剂对定殖干花病原菌的铲除效果；或者，先在干制花朵上喷施杀菌剂，过一定时间后再喷雾接种靶标病菌的孢子，经保湿培养后，待对照处理的花朵上产生孢子后，检测靶标病菌的产生孢子的密度，依据孢子密度，评测不同杀菌剂对病菌在花器上定殖的抑制效果。

具体实施方案如下：

（1）干花准备：4到5月份苹果盛花期，采集苹果、西府海棠或八棱海棠的盛开的鲜花，在80~90℃的干燥箱中烘干，并放在塑料袋中干燥保存，备用；

（2）孢子悬浮液准备：将靶标病菌在PDA或其他培养基中培养，并诱导病菌产生分生孢子，用纯净水将分生孢子洗下，配制成分生孢子悬浮液，浓度控制10⁴~10⁶个孢子/毫升，分生孢子悬浮液现配现用，放置时间不能超过1小时；

（3）杀菌剂准备：根据试验设计，将待评测的杀菌剂用蒸馏水配制成所需要浓度的药液，药液随配随用，放置时间不能超过3小时；

（3）杀菌剂对病菌在花器上定殖的抑制效果及其持效期评测：将待评测的杀菌剂药液均匀的喷撒在苹果的干制花朵上，直到整朵花完全湿润为止，标记后，在自然条件下晾干存放；每种药剂的每个待测浓度处理3~10朵干花；施药后的第2~3天，或经过待评测的持效期过后，用靶标病菌的孢子悬浮液喷雾接种已施药的花朵，直到整个花朵湿润；将接种的施药干花在自然条件下晾干10~20分钟，然后分装到3个或5个培养皿中，用保鲜膜密封，转入20℃~30℃之间的恒温环境中培养，皿内相对湿度控制在90%以上，直到对照处理产生孢子后取出检查；

（4）杀菌剂对定殖于花器上病菌的铲除效果评测：用靶标病菌的孢子悬浮液喷雾接种干制花朵，直到整个花朵湿润；将接种花朵在自然条件下晾干10~20分钟后，转入较大的培养皿或者保湿缸内密封，置于20℃~30℃之间的恒温环境中培养，皿内或缸内相对湿度控制在90%以上；干花培养2~5天后，产生孢子前，将接种干花从培养皿或保湿缸内取出，再将待评测的杀菌剂药液均匀的喷撒到接种的干花上，直到整朵花完全湿润为止，在自然条件下晾干10~20分钟，并标记；每种药剂的每个待测浓度处理3~10朵接种干花；每个处理的干花分装到3个或5个培养皿中，用保鲜膜密封，然后在20℃~30℃之间的恒温环境中培养，皿内相对湿度控制在90%以上，直到对照处理产生孢子后取出检查；

（5）干花上产孢量检查：将培养花朵取出，检查靶樯病菌是否产生孢子；如果病菌已经产生孢子，再检查每一朵花上孢子最密集处，一定面积内所产生孢子的密度；可以对孢子的密度进行分级处理，通过肉眼估测每个花朵上孢子密度的级别；也可以在实体显微镜下检查固定面积朵孢子、孢子梗或孢子丛的数量；依据单位面积上孢子的密度，计算各种药剂的防治效果。

应用实例。

干制花朵：2014年4月，从青岛农业大学校园内采集盛开的西府海棠花朵，80℃烘箱内烘干制成干花，干燥保存，备用。

配制孢子悬浮液；2012年，自山东蓬莱大辛店的一个富士苹果园内采集黑点病果，分离获得粉红单端孢菌（Trichothecium>），在PDA保存；接种前将保存菌种转入PDA中活化，25℃下继代培养7天，然后用纯净水将孢子洗下，调成浓度为10⁴个/毫升的孢子悬浮液，加入0.1％吐温-20。

杀菌剂对病菌在花器上定殖的抑制效果：采用先施药后接种的方法，测试了10种杀菌剂抑制粉红单端孢侵染定殖残花的效果。每个药剂设置一个浓度，每种药剂处理6朵西府海棠花，以清水为对照。试验时，用手持喷雾器将药液均匀地喷洒到西府海棠花上，直到花朵全部湿润为止。处理后的花朵放在托盘上，置于室外自然条件下。施药3天后，用粉红单端孢的孢子悬浮液喷雾接种药剂处理的花朵，接种后立即置于25℃、相对湿度为100%（RH=100%）恒温箱中保湿培养。4天后取出，在80倍体视镜（Leica S8APO）下检查残花上粉红色霉层最密集处分生孢子梗的数量。每朵残花检查1处，以目镜测微尺为标尺，记录目镜测微尺覆盖面积（2.5 mm×0.25 mm=0.625mm²）内分生孢子梗的数量。全部试验在不同时间重复三次。

试验结果：甲基硫菌灵、多菌灵和代森锰锌3种药剂处理的花朵上没有发现粉红单端孢形成的分生孢子梗和霉层，对粉红单端孢在残花上定殖的抑制效果达到100%，与对照存在显著差异（P<0.05）。百菌清等6种药剂处理的花朵上，仅产生稀疏霉层和少量的分生孢子梗，分生孢子梗的平均密度在6.3~20.0/0.625mm²>2，显著的低于对照（P<0.05），而高于甲基硫菌灵、多菌灵和代森锰锌3种药剂（P<0.05）。试验数据见表1。

杀菌剂对定殖花器病菌的铲除效果：采用先接种后施药的方法测试了10种杀菌剂对定植花器上粉红单端孢的铲除效果。每种药剂设置1个浓度，每种药剂处理6朵西府海棠的花朵，以清水为对照（CK）。2014年6月份，用手持喷雾器将粉红单端孢的分生孢子悬浮液均匀的喷洒到西府海棠的花朵上，接种花朵置于25℃、RH=100%恒温箱中保湿培养。48h后，取出花朵，用手持喷雾器将药液均匀地喷洒到已接种花朵上，直到完全湿润为止，然后再将处理花朵放回原处继续培养。4天后取出，检查各处理及对照花朵上粉红色霉层最密集处分生孢子梗的数量。全部试验在不同时间重复三次。

试验结果：代森锰锌、甲基硫菌灵和丙森锌3种杀菌剂处理的花朵上没有发现粉红单端孢产生的霉层和分生孢子梗，对定殖于花器上的粉红单端孢铲除效果达100%，与对照有显著差异（P<0.05）。烯酰吗啉等7种杀菌剂处理悬浮剂处理的花朵上有少量的粉红单端孢霉层和分生孢子梗，分生孢子梗的平均密度在6.8~24.7个/0.625mm²之间，与对照存在显著差异，而与代森锰锌、甲基硫菌灵和丙森锌3种药剂没有显著差异。试验数据见表1。

表1 10种杀菌剂对粉红单端孢的抑制及铲除效果

杀菌剂抑制病菌定殖花器的持效期：根据病菌在花器上定殖的抑制效果试验结果，选用代森锰锌、百菌清、多菌灵、甲基硫菌灵和嘧菌酯5种防治效果较好的杀菌剂，采用施药后不同时间接种致病菌孢子的方法，测试了5种杀菌剂持续保护花器不受粉红单端孢侵染的持效期。试验设置施药后第10天、第20天、第40天、第50天和第60天接种病菌5个时间处理，全部试验共5个药剂和1个清水对照，每种药剂5个时间处理，共30个组合，每个组合处理6朵西府海棠干制花朵。施药、病菌接种和病菌产孢的检查方法同病菌定殖抑制效果试验。本试验不同时期重复三次。

结果表明：80%代森锰锌可湿性粉剂、70%甲基硫菌灵水分散粒剂、80%多菌灵可湿性粉剂3种药剂抑制粉红单端孢定殖花器的效果均达到100%，且持效期至少维持40天。试验数据见表2。

表2 5种杀菌剂施药后不同时间接种粉红单端孢的分生孢子梗密度及抑制效果

去获取专利，查看全文>