口服独一味后大鼠血浆中胡麻属苷含量的测定方法

摘要

本发明涉及医药学检测技术领域，特别是中成药体内代谢研究技术领域，具体是一种口服独一味后大鼠血浆中胡麻属苷成分的确定及其含量测定方法，含量测定方法是采用高效液相色谱质谱联用检测方法，在所建立的检测方法下对口服独一味后大鼠血浆中胡麻属苷成分进行含量测定。本发明含量测定方法的精密度高，重现性佳，稳定性好，测定结果准确可靠，可有效评价独一味中的胡麻属苷在生物体内的药动学过程。

说明书

技术领域

本发明涉及医药学检测技术领域，特别是中成药体内代谢研究技术领域，具体地说，是口服独一味后大鼠血浆中胡麻属苷的鉴定及含量测定方法。

背景技术

独一味是中国传统中药，其植物全草收录于《中国药典》2005版，其地上部分收录于《中国药典》2010版，具有活血化瘀、消肿止痛的作用。用于术后的刀口疼痛、出血、骨质疏松、风湿及血瘀肿胀等症状，在止血和凝血方面具有确切的疗效。

根据文献报道，独一味的主要生物活性成分是环烯醚萜类、黄酮类和苯乙醇苷类化合物。2005版《中国药典》中指标成分为木犀草素，药用部位为全草，即地上部分和根、根茎部分；2010版《中国药典》中指标成分变更为山栀苷甲酯和8-乙酰山栀苷乙酯，药用部位为地上部分。指标成分和入药部位的变更论证尚属空白，且2010版《中国药典》未提及同样具有药理活性的环烯醚萜苷类化合物。为明确其有效成分在体内的代谢过程，必须建立一套对服用独一味后血浆中活性成分的浓度进行监测的方法，为独一味的后续研究工作提供可靠依据。

通过文献调研发现，目前对于独一味中的主要生物活性成分研究已经比较清楚，且随着中药领域技术的发展，中药成分药代动力学参数的重要性日益显现，但是仅有一篇报道独一味所含4种环烯醚萜类化合物在生物体内的代谢过程，阐明其浓度随时间的变化情况(P.C.Fan,M.X.Li,H.P.Ma,L.L.Jing,J.G.Qiu,Z.P.Jia,Simultaneous determination of four shanzhiside methylester derivatives in rabbit plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry.Biomed.Chromatogr.26(2012)1543-1551.)，该方法是在正离子模式下将[M+Na]⁺峰作为母离子进行检测，但[M+Na]⁺峰结合一般较稳定，较难以裂解形成子离子。

潘正等公开了采用高效液相色谱法测定独一味根中胡麻属苷等6种化学成分的方法(潘正,高运玲,张涛,邓杰.HPLC法测定独一味根中环烯醚萜苷和苯乙醇苷[J].中草药,2011,42(2):279-281.)，但采用此方法无法检测服药后血浆中胡麻属苷的含量。

目前关于一种口服独一味后大鼠血浆中胡麻属苷成分的确定及其含量测定方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种口服独一味后大鼠血浆中药物成分的确定及其含量测定方法。

为了对独一味开展药动学研究，本发明对比了大鼠服用独一味药材地上部分和全草后血浆所含药物成分的种类差别，并且建立大鼠血浆中胡麻属苷的含量测定方法。独一味进入体内后，血液中主要存在环烯醚萜类、苯乙醇苷类、黄酮类、糖类化合物，包括原型及其代谢产物，其数量众多，结构类似，对各物质的定量检测带来了较大的难度。

技术方案：(1)采用液质联用技术(LC-MS)确定胡麻属苷和替硝唑对照品的质谱条件；(2)优化色谱条件，使对照品溶液中胡麻属苷和替硝唑达到基线分离；(3)以替硝唑为内标，测定大鼠血浆中胡麻属苷的含量。具体步骤如下：

①选取替硝唑为本次实验的内标。

②胡麻属苷和替硝唑对照品质谱检测条件：胡麻属苷465.2→257.2，替硝唑246.0→125.9。

③液相色谱分离条件：Agilent 1200 HPLC液相色谱仪，反相色谱柱，柱温为35℃，流动相为：酸性乙腈(A)和酸性水(B)，流速为0.4mL/min，进样体积为10μL，梯度洗脱，检测时间为5min。后运行时间为5min。

④LC-MS参数：Agilent 6410 QQQ质谱系统，离子化方式为电喷雾条件，采用负离子条件下MRM模式，内标为替硝唑，干燥气流速为10L/min，干燥气温度为350℃，雾化气压力为40psi，毛细管电压为4000V。

⑤基于LC-MS系统，采用内标法对独一味中胡麻属苷进行含量测定。

⑥方法学验证：仔细考察测试方法的基质效应、提取回收率、精密度和稳定性。

本发明的目的是通过如下方案实现的：

本发明具体提供了一种口服独一味后大鼠血浆中胡麻属苷含量的测定方法，包括以下步骤：

(a)血浆的处理：取0.1mL大鼠血浆置于1.5mL EP管中，加入0.3mL甲醇溶液(含0.1％甲酸(v/v)和200ng/mL替硝唑内标)，涡旋混匀3min，再以13000rpm离心10min，取上清液0.2mL，于37℃氮气流吹干，再以0.4mL初始流动相(酸性乙腈和酸性水，8:92，v/v)复溶，取10μL作为血浆测试样品；

(b)精密吸取步骤(a)得到的血浆测试样品注入高效液相色谱-质谱联用仪，内标法定量，测得血浆中胡麻属苷的含量；其中，

液相条件为：Agilent 1200HPLC液相色谱仪，反相色谱柱，柱温为35℃，流动相为：酸性乙腈和酸性水，流速为0.4mL/min，进样体积为10μL，梯度洗脱，检测时间为5min；后运行时间为5min；所述的酸性乙腈和酸性水中，加入的酸均为甲酸，浓度为0.1％(v/v)；

所述的反相色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18色谱柱，具体规格为2.1mm×100mm，填料为3.5μm。

所述的梯度洗脱过程为：8-40％有机相酸性乙腈A(0-1min)，40-95％有机相酸性乙腈A(1-4min)，95％有机相酸性乙腈A(4-5min)。

质谱条件为：Agilent 6410 QQQ质谱系统，离子化方式为电喷雾条件，采用负离子条件下MRM模式，内标为替硝唑，干燥气流速为10L/min，干燥气温度为350℃，雾化气压力为40psi，毛细管电压为4000V。

所述的质谱检测为多反应监测模式，反应离子对分别为：胡麻属苷465.2→257.2，替硝唑246.0→125.9。

所述的大鼠血浆的制备方法包括以下步骤：

(a)将独一味地上部分或全草加入4-5倍体积的50％乙醇水溶液(v/v)提取3次，每次30min，得独一味的提取物。所得提取物溶于适量0.5％CMC-Na溶液(w/v)，得50mg/mL的溶液，以灌胃方式给大鼠(250±20g)独一味溶液0.8g/kg；

(b)分别在给药后5min、15min、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、12h和24h从大鼠眼眶取血0.3mL，置于1.5mL肝素化的聚乙烯管中，立即在4℃恒温离心10min，转速4000×g，得到口服独一味后的大鼠血浆。

对照品溶液的制备：精密称取胡麻属苷对照品，溶于甲醇，加入内标替硝唑得储备液。以空白血浆和10％甲醇(MeOH)(v/v)稀释成不同浓度的标准溶液，得浓度分别为4.00，10.00，30.00，50.00，100.00，150.00，250ng/mL的胡麻属苷溶液。

本发明优点在于：

1、本发明以独一味中的胡麻属苷成分为指标，建立了大鼠口服独一味后胡麻属苷在血浆中浓度随时间变化的情况进行了研究，为独一味药物体内药动学过程研究提供了依据；

2、本发明首次公开了大鼠服用独一味后，血浆中胡麻属苷的测定方法，使对独一味的药动学研究上了一个新台阶。

3、本发明含量测定方法的精密度高，重现性佳，稳定性好，测定结果准确可靠，可有效评价独一味中的胡麻属苷在生物体内的药动学过程。

附图说明

图1是口服独一味地上部分后，大鼠血浆中胡麻属苷检测图。

图2是条件优化时，乙腈-水(含0.1％甲酸)流动相系统的色谱图。

图3是条件优化时，甲醇-水(含0.1％甲酸)流动相系统的色谱图。

图4是条件优化时，Agilent Zorbax色谱柱的色谱图。

图5是条件优化时，Waters BEH色谱柱的色谱图。

图6是条件优化时，Agilent Proshell色谱柱的色谱图。

图7是条件优化时，6％有机相为初始流动相的色谱图。

图8是条件优化时，8％有机相为初始流动相的色谱图。

图9是条件优化时，乙腈为沉淀剂的色谱图。

图10是条件优化时，乙腈(含0.1％甲酸)为沉淀剂的色谱图。

图11是条件优化时，甲醇为沉淀剂的色谱图。

图12是条件优化时，甲醇(含0.1％甲酸)为沉淀剂的色谱图。

图13是条件优化时，丙酮为萃取剂的色谱图。

图14是条件优化时，二氯甲烷为萃取剂的色谱图。

图15是条件优化时，乙酸乙酯为萃取剂的色谱图。

图16是条件优化时，正丁醇为萃取剂的色谱图。

图17是条件优化时，乙酸乙酯和二氯甲烷(1：2)为萃取剂的色谱图。

图18是条件优化时，乙酸乙酯和二氯甲烷(1：1)为萃取剂的色谱图。

图19是条件优化时，乙酸乙酯和二氯甲烷(2：1)为萃取剂的色谱图。

图20是胡麻属苷标准品溶液检测图。

图21是空白血浆中胡麻属苷检测图。

图22是胡麻属苷的LLOQ图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例中采用的仪器和试药：

Agilent 1200高效液相色谱仪串联6410质谱仪(Agilent，美国)、AgilentZorbax SB-C18色谱柱(3.5μm,2.1×100mm)、VX-200涡旋混合器(美国，Labnet)、Allegra X-15R离心机(美国，Beckman Coulter)、SK7200H超声仪(上海科岛)、BSA124S-CW电子天平(德国，Sartorius)、Gilson移液器(美国)。

乙腈(德国，Merck)、甲醇(德国，Merck)、甲酸(美国，Tedia)，均为色谱纯，水由Milli-Q超纯水系统制得。

胡麻属苷对照品由实验室从独一味药材中提取获得，经光谱学和波谱学分析鉴定其结构，液相鉴定纯度大于99.0％，替硝唑购于中国药品生物制品检定所。

实施例1口服独一味全草和地上药材后大鼠血浆中胡麻属苷成分的含量测定

包括以下步骤：

1.1血浆测试样品的制备：

(1)将独一味地上部分的提取物溶于适量0.5％CMC-Na溶液，得50mg/mL的溶液，以灌胃方式给大鼠(250±20g)独一味溶液0.8g/kg；

(2)分别在给药后5min、15min、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、12h和24h从大鼠眼眶取血0.3mL，置于1.5mL肝素化的聚乙烯管中，立即在4℃恒温离心10min，转速4000×g，得血浆；

(3)取0.1mL血浆置于1.5mL EP管中，加入0.3mL甲醇溶液(含0.1％甲酸和200ng/mL替硝唑内标)，涡旋混匀3min，再以13000rpm离心10min，取上清液0.2mL，于37℃氮气流吹干，再以0.4mL初始流动相复溶，取10μL作为血浆供试品溶液1；

(4)重复步骤(1)至步骤(3)的方法对大鼠灌服独一味全草，得到血浆供试品溶液2。

(5)对照品溶液的制备：精密称取胡麻属苷对照品，溶于甲醇，加入内标替硝唑得储备液。以空白血浆和10％MeOH稀释成不同浓度的标准溶液，得浓度分别为4.00，10.00，30.00，50.00，100.00，150.00，250ng/mL的胡麻属苷溶液。

1.2LC-MS/MS分析的色谱分离条件和质谱检测条件：

液相条件为:Agilent 1200HPLC液相色谱仪，反相色谱柱，柱温为35℃，流动相为：酸性乙腈(A)和酸性水(B)，流速为0.4mL/min，进样体积为10μL，梯度洗脱，检测时间为5min。后运行时间为5min。

质谱条件为：Agilent 6410 QQQ质谱系统，离子化方式为电喷雾条件，采用负离子条件下MRM模式，内标为替硝唑，干燥气流速为10L/min，干燥气温度为350℃，雾化气压力为40psi，毛细管电压为4000V。

其中步骤2中，反相色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18色谱柱，具体规格为2.1mm×100mm，填料为3.5μm；

其中步骤2中，所用的酸性乙腈和酸性水中，加入的酸均为甲酸，浓度为0.1％；

其中步骤2中，梯度洗脱过程为：8-40％A(0-1min)，40-95％A(1-4min)，95％A(4-5min)；

其中步骤2中，质谱检测为多反应监测模式，反应离子对分别为：胡麻属苷465.2→257.2，替硝唑246.0→125.9；

1.3测定法：分别精密吸取血浆供试品溶液1、血浆供试品溶液2和对照品溶液注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得血浆中胡麻属苷的含量。如图1所示。

实施例2检测条件的优化

2.1质谱条件的优化

以胡麻属苷标准品溶液为对象，通过调整碎裂电压和碰撞电压，确定质谱检测条件，最终确定质谱条件如表1所示。

表1以MRM模式优化胡麻属苷和替硝唑对照品形成稳定离子所需碰撞能量

2.2色谱条件的优化

(1)参考文献中类似物质的分离条件，确定加入0.1％甲酸调节酸度。后分别对乙腈-水(含0.1％甲酸)和甲醇-水(含0.1％甲酸)两种流动相组成进行考察，结果见图2-3，由图可见，乙腈-水(含0.1％甲酸)系统峰形较佳。

(2)分别对Agilent Zorbax SB-C18(2.1mm×100mm,3.5μm)、Waters BEH(2.1mm×50mm，2.5μm)和Agilent Proshell 120(2.1mm×100mm，2.7μm)色谱柱进行考察，结果见图4-6，如图所示，Agilent Proshell和Zorbax柱能将胡麻属苷与其它杂质有效分离，Zorbax色谱柱的响应高于Proshell，且Proshell色谱柱的柱压显著高于Zorbax，在本仪器上使用时容易因柱压过高而被冲开，因此确定Zorbax作为本实验的反相色谱柱。

(3)分别以6％和8％有机相为初始流动相组成，考察其分离效果和响应强度，结果见图7-8，由图可见，将初始流动相中有机相的比例调整为8％时，可以有效地缩短分析时间。后经调整整体梯度方式，确定流动相梯度为0-1min，8-40％有机相酸性乙腈；1-4min，40-95％有机相酸性乙腈；4-5min，95％有机相酸性乙腈。

2.3提取条件的选择

分别采用液液萃取和蛋白沉淀两种提取方式进行提取，液液萃取时分别考察了乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、正丁醇和不同比例乙酸乙酯与二氯甲烷的混合溶剂(1:2,1:1和2:1)的提取效率，蛋白沉淀时考察了乙腈、乙腈(含0.1％甲酸)、甲醇和甲醇(含0.1％甲酸)，结果显示，含0.1％甲酸的甲醇进行蛋白沉淀时提取效率最高，结果见图9-19。

实施例3方法学验证实验2

3.1专属性的考察

将口服独一味地上部分后的大鼠血浆、添加胡麻属苷标准品的空白血浆溶液和未添加胡麻属苷标准品的空白血浆溶液，按上述提取条件进行操作，按上述色谱质谱条件进行检测并对比，结果见图20-22。由图可以看出该检测方法专属性良好，可以满足检测要求。

3.2线性关系的考察

将7个不同浓度的胡麻属苷溶液，按上述提取条件进行操作，按上述色谱质谱条件进行测定，并以浓度作为横坐标，对照品与内标的峰面积比值作为纵坐标，以最小二乘法绘制标准曲线，回归方程分别为：y＝16.2523x-0.0106，r>0.993，表明胡麻属苷在4.00～250.00ng/mL范围内线性关系良好。

3.3基质效应的考察

将胡麻属苷和替硝唑的混合标准品溶液分别加入10％的甲醇溶液和未服用独一味药物的大鼠血浆，按照上述提取条件进行操作，然后取供试品进行检测并对比，结果显示该基质对检测干扰较小，可以满足胡麻属苷浓度检测的要求。结果见表2。

表2胡麻属苷的基质效应、提取回收率、精密度和稳定性表

3.4提取回收率的考察

将胡麻属苷和替硝唑的混合标准品溶液加入空白血浆，并按上述提取条件进行操作，然后取供试品溶液与混合标准品溶液进行检测并对比，结果显示该方法提取效率较高，能够满足实际样本的检测需要。结果见表2。

3.5精密度试验

(1)日内精密度

日内精密度：在标准曲线范围内，选择胡麻属苷的低、中、高3个浓度制备质量控制样品，每一浓度进样6次，计算日内精密度，结果符合生物样品中定量分析研究的方法学要求。结果见表2。

(2)日间精密度

连续进样3天，计算日间精密度，结果符合生物样品中定量分析研究的方法学要求，说明该方法具有良好的精密度。结果见表2。

3.6准确度试验

取不同浓度的质控样品，与标准曲线同时进行，计算准确度。结果符合生物样品中定量分析研究的方法学要求。结果见表2。

3.7稳定性试验

取不同浓度的质控样品，与标准曲线同时进行，做短期、长期和冻融实验，检测其稳定性。结果见表2，说明该方法具有良好的稳定性。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。