一种石墨烯信号放大的微囊藻毒素‑LR电化学检测方法

摘要

本发明涉及一种石墨烯信号放大的微囊藻毒素‑LR电化学检测方法，该方法包括以下步骤：(1)在MCH/Au NPs/Au电极的表面分别滴加体积比为(9‑11):(4‑6):(2‑4):(1‑3)的核酸内切酶反应缓冲液、石墨烯‑适配体复合物、待测的微囊藻毒素‑LR溶液和核酸内切酶溶液；(2)将MCH/Au NPs/Au电极在25‑35℃下培养1‑2个小时，用乙醇和超纯水轻轻淋洗电极表面，去除结合较弱的石墨烯，随后在氮气下干燥，取出后进行电化学方法检测，测定微囊藻毒素‑LR溶液的浓度。本发明所建立的方法利用了高灵敏的电化学分析技术与高专一性识别能力的核酸适配体有效地结合，实现了环境中痕量微囊藻毒素‑LR的超灵敏、高专一性的检测，且仪器廉价便携，方法简单易行，可以快速得到结果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微囊藻毒素-LR的检测方法，尤其是涉及一种石墨烯信号放大的微囊藻毒素-LR电化学检测方法。

背景技术

近年来，环境问题尤为严重，许多水域都出现了蓝藻爆发的情况。微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是由蓝藻在富营养化水体中产生的一种生物毒素，它是由七个氨基酸构成的具有生物活性的环状七肽类化合物。微囊藻毒素有着许多种类，目前已确认的异构体就达九十多种。其中微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MC-LR)便是其中的一种异构体，微囊藻毒素-LR在水中存在最为普遍，也是毒性最强的一种微囊藻毒素，对水体中微囊藻毒素-LR含量进行控制与高灵敏监测具有非常重要的环境意义。

目前，测定微囊藻毒素-LR的方法主要是采用传统仪器分析方法，例如高效液相色谱法，液-质联用法等，这些方法具有好的灵敏度和准确性，然而分析过程往往非常复杂，费力且耗时。近年来，有研究工作者利用抗体的特异性识别作用，构建微囊藻毒素-LR的免疫传感器，实现了对微囊藻毒素-LR的较为简单、快捷的检测，并取得较高的灵敏度和选择性。然而，微囊藻毒素-LR抗体提取的成本较高，过程极其复杂，且提取周期较长，因此在实际应用中鲜有报道。

核酸适配体，是通过SELEX技术筛选出具有高度专一性结合靶物质的一系列短链核苷酸序列，具有类似于抗体的特异性识别性能，具有可在体外化合成，合成周期短，不需要复杂的提取步骤，且稳定性好等优于抗体的诸多性质。由于其独特的性能，基于不同方法发展的核酸适配体传感器具有广泛的应用前景。自从微囊藻毒素-LR的核酸适配体于2004年被筛选出来后，用于微囊藻毒素-LR测定的适配体传感器已有大量报道，如荧光法，比色法等。其中，荧光适配体传感器需要对适配体进行荧光基团标记来获得响应信号，因此标记过程复杂，费时，且可能对微囊藻毒素-LR和适配体间的亲和性有一定影响。比色适配体传感器，方法简单，快速，但往往灵敏度较低。而电化学分析方法由于其具有操作简单、响应快速，且灵敏度高，环境友好，易实现在线监测等优点，受到了越来越多的关注与应用。因此，我们设想将高灵敏的电化学分析方法，与具有高亲和力的核酸适配体技术相结合，构筑微囊藻毒素-LR的电化学适配体传感器，进而建立用于实现高灵敏、高选择性检测微囊藻毒素-LR新型电化学分析方法。中国专利200810242879.5公开了一种微囊藻毒素-LR定量快速检测传感器的制备及应用，但是该专利为选用生物抗体作为选择性机制的电化学传感器，相对于核酸适配体，抗体培养的成本与周期较核酸适配体高，且过程较为复杂，不是很适合在实际检测中使用。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种制备简单、成本低廉、高灵敏度高选择性的检测微囊藻毒素-LR的电化学检测方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

金纳米粒子(Au NPs)修饰裸金电极(Bare Au)为基体电极，同时在体系外将石墨烯与适配体复合形成石墨烯-适配体复合物，与核酸内切酶结合，构筑了一种简单，快速的电化学检测方法，可实现高灵敏和高选择性检测MC-LR。

一种石墨烯信号放大的微囊藻毒素-LR电化学检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)在MCH/Au NPs/Au电极的表面依次滴加体积比为(9-11):(4-6):(2-4):(1-3)的核酸内切酶反应缓冲液、石墨烯-适配体复合物、待测的微囊藻毒素-LR溶液和核酸内切酶溶液；

(2)将MCH/Au NPs/Au电极在25-35℃下培养1～2个小时，用乙醇和超纯水淋洗电极表面，去除结合较弱的石墨烯，随后在氮气下干燥，取出后进行电化学方法检测，测定微囊藻毒素-LR溶液的浓度。

所述的MCH/Au NPs/Au电极采用以下步骤制备：

(1)以金电极为工作电极，含有浓度为1～5mmol/L氯金酸的0.05-0.2mol/L的KCl溶液为电解液，采用三电极体系，在-1.2-1.0V电位范围内进行循环伏安法扫描，扫描圈数为10-25圈，得到Au NPs/Au电极；

(2)将得到的Au NPs/Au电极浸入含30-60mmol/L的6-巯基-1-己醇的乙醇溶液中密封，常温下培养24小时后将电极取出，分别用乙醇和水淋洗，得到MCH/Au NPs/Au电极，在氮气中干燥备用。

所述的石墨烯-适配体复合物采用以下步骤制备：

(1)在10～20μmol/L的微囊藻毒素-LR核酸适配体的溶液中，加入浓度为0.1～0.3mg/mL的石墨烯水溶液，将其置于冰水浴中，超声三小时，得到黑色分散悬浮液；

(2)将得到的黑色分散悬浮液离心5-10分钟后，取上清液，得到石墨烯-适配体复合物，在4℃下冷藏备用。

所述的微囊藻毒素-LR的核酸适配体的碱基序列为：

5’-GGCGC-CAAAC-AGGAC-CACCA-TGACA-ATTAC-CCATA-CCACC-TCAT T-ATGCC-CCATC-TCCGC-3’。

所述的核酸内切酶反应缓冲液为Tris-HCl缓冲液反应缓冲液(50-200mM，含12-50mM MgCl₂,0.5-2mM>2,PH＝7.5,25-35℃)。

所述的核酸内切酶溶液的酶的活力单位为500-1500U/mL。

所述的电化学方法为差分脉冲伏安法，根据峰电流值与微囊藻毒素-LR浓度之间的线性关系建立工作曲线。

所述的电化学方法采用的电解液为pH＝7.0，含3-10mmol/L的二茂铁甲酸及0.05-0.3mol/L高氯酸钠的10-30mmol/L的磷酸盐缓冲溶液。

本发明中用于MC-LR的选择性检测，可具体采用以下方法：

向含有MC-LR的溶液中加入100倍MC-LR溶液浓度的干扰物，采用差分脉冲伏安法测定混合溶液的峰电流响应。根据加入MC-LR和干扰物引起的峰电流的变化实现对MC-LR的选择性分析；所述的干扰物为百草枯，啶虫脒，敌百虫，杀虫单，氧乐果或草甘膦的一种。

本发明以微囊藻毒素-LR核酸适配体为识别元素，将其与高灵敏的电分析方法相结合，进一步通过设计与利用核酸内切酶辅助石墨烯信号放大作用，实现了对微囊藻毒素-LR的高灵敏、特异性分析。选用金纳米粒子沉积修饰的金电极为基底电极，可以利用金纳米粒子提供更多的电化学活性面积和更好的导电性能，从而提供更加灵敏的电化学信号。之后在电极表面组装MCH单分子层，用以“阻断”电极表面的电子传递“通道”。同时石墨烯-适配体复合物存在于体系中，在体系中没有微囊藻毒素-LR存在时，石墨烯由于适配体的作用，不会自组装到电极上。但是当体系中存在微囊藻毒素-LR时，微囊藻毒素-LR会与适配体结合，从而使石墨烯裸露出来，裸露出来的石墨烯可以通过与MCH的作用，自组装到Au NPs/Au电极表面，使得被“阻断”的电流信号重新被“打开”，而获得响应电流值的增加。进一步地，当在体系中滴加核酸内切酶DNase I后，核酸内切酶会将与MC-LR结合的核酸适配体分解，使MC-LR又重新裸露出来，裸露出来的MC-LR又可以继续与新的适配体结合，使得更多的石墨烯裸露出来组装到电极上，如此循环，实现对电流信号的放大效应，从而利用所得的电流信号与MC-LR之间的浓度关系，实现对MC-LR的高灵敏电化学检测。

本发明将操作简便，响应迅速的电化学分析方法与对MC-LR有特异性识别作用的核酸适配体技术结合，并结合石墨烯优异的导电性与生物亲和性的特点，发明了一种新颖的MC-LR电化学检测方法。与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)与现有的生物传感器相比，本发明采用金纳米粒子沉积修饰金电极为基体电极材料，利用石墨烯优异的导电性与良好的生物兼容性。进一步通过设计与利用核酸内切酶辅助石墨烯信号放大作用，实现了对MC-LR的高灵敏、特异性分析。

(2)本发明将MC-LR的核酸适配体与石墨烯复合，得到石墨烯-适配体复合物。由于核酸适配体对待测物质MC-LR的专一性结合能力，大大提高了选择性，使得该电化学检测方法能够在100倍于待测物质浓度的结构相似的干扰物质中选择性的识别出待测物质MC-LR。

(3)与传统的检测微囊藻毒素-LR的方法相比，本发明所建立的方法利用了高灵敏的电化学分析技术与高专一性识别能力的核酸适配体有效地结合，实现了环境中痕量MC-LR的超灵敏、高专一性的检测，且仪器廉价便携，方法简单易行，可以快速得到结果。

附图说明

图1为本发明制备的Au NPs纳米结构图；

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种石墨烯信号放大的微囊藻毒素-LR电化学检测方法，其中所涉及的传感器的具体制作过程如下：

(1)首先对金电极进行预处理，处理方式如下：将金电极表面置于新鲜配置的食人鱼(H₂SO₄/H₂O₂＝7:3v/v)洗液中浸泡10-15分钟，取出后采用超纯水洗净后，依次分别采用粒径为1.0μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝以“8”字小心的打磨至表面光洁。之后用超纯水将电极表面的三氧化二铝冲洗干净，将电极依次分别置于超纯水，乙醇，超纯水超声5至10分钟。超声完毕后，将电极立即取出，以其为工作电极，铂丝电极为对电极，SCE为参比电极进行循环伏安(CV)扫描，直到得到稳定的重复的循环伏安图为止，则表明金电极预处理完毕。CV扫描设置参数如下：电势范围-0.2-1.55V，扫速50mV/s。将预处理好的金电极用超纯水淋洗干净，氮气干燥后取出，置于3mmol/L的氯金酸(含有0.1mol/L>

(2)在10μmol/L的MC-LR核酸适配体的溶液中，加入浓度为0.15mg/mL的石墨烯水溶液，将其置于冰水浴中，超声三小时，得到黑色分散悬浮液。之后将悬浮液离心5分钟后，取上清液，得到石墨烯-适配体复合物。将制备好的石墨烯-适配体复合物放入4℃冰箱冷藏备用。

(3)将(1)步骤中制备好的Au NPs电极浸入40mmol/L的MCH的乙醇溶液中，密封后常温下培养24小时，使Au NPs电极表面形成致密的MCH分子层。之后将电极取出，分别用乙醇和水轻轻的淋洗后，得到MCH/Au NPs/Au电极，在氮气气氛下干燥备用。

实施例2

在对MC-LR浓度测量前，将制备好的MCH/Au NPs/Au电极取出，在电极表面滴加10μL核酸内切酶(DNase I)反应缓冲液(pH＝7.0，含有浓度为100mmol/L的NaCl)，5μL石墨烯-适配体复合物，3μL的待测浓度的MC-LR，2μL的DNase I溶液(1000U/mL)，将电极置于30℃的生化培养箱中培养一个小时后取出。用乙醇和超纯水轻轻淋洗电极表面，以去除结合较弱的石墨烯。随后将电极在氮气气氛下进行干燥，取出后进行DPV检测。电化学检测均在含5mmol/L二茂铁甲酸及0.1mol/L的高氯酸钠的20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)中进行。

电流的变化和MC-LR的浓度在1.0×10^-12～1.0×10^-10mol/L范围内成良好线性关系，相关系数约为0.99.最低检测限为8.0×10^-13mol/L。这个最低检测限足以检测水体中微量存在的MC-LR。

实施例3

将制备好的电化学适配体传感器，将1.0×10^-11mol/L>-9mol/L的干扰物两两混合进行测定。考察了氧乐果，草甘膦，百草枯，杀虫单，啶虫脒，敌百虫三种环境常见污染物对MC-LR测定的干扰实验。采用实施例2中测试条件，测定电流响应，研究结果显示，100倍于MC-LR浓度的其他干扰物对MC-LR的电流造成的影响小于10.0％。可见，所制备的适配体传感器对MC-LR具有高的选择性。

实施例4

(1)按实施例1的处理方式对金电极进行预处理，将预处理好的金电极用超纯水淋洗干净，氮气干燥后取出，置于1mmol/L的氯金酸(含有0.1mol/L KCl)中，继续以其为工作电极，采用CV法对溶液中的金还原，从而在电极表面形成金纳米粒子(Au NPs)，得到金纳米粒子电极。参数设置如下：电势范围-1.2～-0.2V，扫速50mV/s，扫描圈数10圈。得到Au NPs电极，如图1所示。

(2)在10μmol/L的MC-LR核酸适配体的溶液中，加入浓度为0.1mg/mL的石墨烯水溶液，将其置于冰水浴中，超声三小时，得到黑色分散悬浮液。之后将悬浮液离心5分钟后，取上清液，得到石墨烯-适配体复合物。将制备好的石墨烯-适配体复合物放入4℃冰箱冷藏备用。

(3)将(1)步骤中制备好的Au NPs电极浸入30mmol/L的MCH的乙醇溶液中，密封后常温下培养24小时，使Au NPs电极表面形成致密的MCH分子层。之后将电极取出，分别用乙醇和水轻轻的淋洗后，得到MCH/Au NPs/Au电极，在氮气气氛下干燥备用。

(4)将制备好的MCH/Au NPs/Au电极取出，在电极表面滴加9μL核酸内切酶(DNase I)反应缓冲液(pH＝7.0，含有浓度为100mmol/L的NaCl)，4μL石墨烯-适配体复合物，2μL的待测浓度的MC-LR，1μL的DNase I溶液(1000U/mL)，将电极置于25℃的生化培养箱中培养1小时后取出。用乙醇和超纯水轻轻淋洗电极表面，以去除结合较弱的石墨烯。随后将电极在氮气气氛下进行干燥，取出后进行DPV检测。电化学检测均在含5mmol/L二茂铁甲酸及0.1mol/L的高氯酸钠的10-30mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)中进行。

电流的变化和MC-LR的浓度在一定范围内成良好线性关系，可以得到足以检测水体中微量存在的MC-LR的检测限。

实施例5

(1)按实施例1的处理方式对金电极进行预处理，将预处理好的金电极用超纯水淋洗干净，氮气干燥后取出，置于5mmol/L的氯金酸(含有0.1mol/L KCl)中，继续以其为工作电极，采用CV法对溶液中的金还原，从而在电极表面形成金纳米粒子(Au NPs)，得到金纳米粒子电极。参数设置如下：电势范围-1.2～-0.2V，扫速50mV/s，扫描圈数25圈。得到Au NPs电极，如图1所示。

(2)在20μmol/L的MC-LR核酸适配体的溶液中，加入浓度为0.3mg/mL的石墨烯水溶液，将其置于冰水浴中，超声三小时，得到黑色分散悬浮液。之后将悬浮液离心10分钟后，取上清液，得到石墨烯-适配体复合物。将制备好的石墨烯-适配体复合物放入4℃冰箱冷藏备用。

(3)将(1)步骤中制备好的Au NPs电极浸入30mmol/L的MCH的乙醇溶液中，密封后常温下培养24小时，使Au NPs电极表面形成致密的MCH分子层。之后将电极取出，分别用乙醇和水轻轻的淋洗后，得到MCH/Au NPs/Au电极，在氮气气氛下干燥备用。

(4)将制备好的MCH/Au NPs/Au电极取出，在电极表面滴加11μL核酸内切酶(DNase I)反应缓冲液(pH＝7.0，含有浓度为100mmol/L的NaCl)，6μL石墨烯-适配体复合物，4μL的待测浓度的MC-LR，3μL的DNase I溶液(1000U/mL)，将电极置于35℃的生化培养箱中培养2小时后取出。用乙醇和超纯水轻轻淋洗电极表面，以去除结合较弱的石墨烯。随后将电极在氮气气氛下进行干燥，取出后进行DPV检测。电化学检测均在含5mmol/L二茂铁甲酸及0.1mol/L的高氯酸钠的10-30mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)中进行。

电流的变化和MC-LR的浓度在一定范围内成良好线性关系，可以得到足以检测水体中微量存在的MC-LR的检测限。

实施例6

(1)按实施例1的处理方式对金电极进行预处理，将预处理好的金电极用超纯水淋洗干净，氮气干燥后取出，置于3mmol/L的氯金酸(含有0.1mol/L KCl)中，继续以其为工作电极，采用CV法对溶液中的金还原，从而在电极表面形成金纳米粒子(Au NPs)，得到金纳米粒子电极。参数设置如下：电势范围-1.2～-0.2V，扫速50mV/s，扫描圈数20圈。得到Au NPs电极，如图1所示。

(2)在15μmol/L的MC-LR核酸适配体的溶液中，加入浓度为0.3mg/mL的石墨烯水溶液，将其置于冰水浴中，超声三小时，得到黑色分散悬浮液。之后将悬浮液离心7分钟后，取上清液，得到石墨烯-适配体复合物。将制备好的石墨烯-适配体复合物放入4℃冰箱冷藏备用。

(3)将(1)步骤中制备好的Au NPs电极浸入20mmol/L的MCH的乙醇溶液中，密封后常温下培养24小时，使Au NPs电极表面形成致密的MCH分子层。之后将电极取出，分别用乙醇和水轻轻的淋洗后，得到MCH/Au NPs/Au电极，在氮气气氛下干燥备用。

(4)将制备好的MCH/Au NPs/Au电极取出，在电极表面滴加10μL核酸内切酶(DNase I)反应缓冲液(pH＝7.0，含有浓度为100mmol/L的NaCl)，5μL石墨烯-适配体复合物，3μL的待测浓度的MC-LR，2μL的DNase I溶液(1000U/mL)，将电极置于30℃的生化培养箱中培养1.5小时后取出。用乙醇和超纯水轻轻淋洗电极表面，以去除结合较弱的石墨烯。随后将电极在氮气气氛下进行干燥，取出后进行DPV检测。电化学检测均在含5mmol/L二茂铁甲酸及0.1mol/L的高氯酸钠的10-30mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)中进行。

电流的变化和MC-LR的浓度在一定范围内成良好线性关系，可以得到足以检测水体中微量存在的MC-LR的检测限。

上述的对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。