一种检测霉变烟叶中12种霉菌毒素浓度的方法

摘要

本发明公开一种检测霉变烟叶中12种霉菌毒素浓度的方法，经制备12种霉菌毒素混合母液、准备标准工作溶液、制备样品溶液、进行液相色谱‑串联三重四级杆质谱分析，绘制标准曲线及计算结果而完成检测霉变烟叶中12种霉菌毒素的浓度。本发明能够准确地对霉变烟叶中12种霉菌毒素进行定性及定量，能够有效的去除复杂基质对检测信号的干扰，同时不影响12种霉菌毒素相应值。本发明方法稳定性好，准确可靠、灵敏度高，操作简单快捷、重复性好，非常适合复杂基质霉变烟叶中12种霉菌毒素的分析。

说明书

技术领域

本发明属于霉变烟叶中霉菌毒素成分分析测定技术领域，具体涉及一种采用液相色谱-串联质谱法检测霉变烟叶中12种霉菌毒素浓度的方法。

背景技术

烟叶在复烤后的储藏、发酵和陈化统称为醇化过程，醇化过程是卷烟生产的重要环节，直接影响卷烟的质量。在醇化过程中，常常有烟叶霉变现象发生，霉变后烟叶会长毛、变青黑、发粘、变稀、发臭等，导致大量的烟叶成为垃圾，给烟草企业造成较大的经济损失。烟叶霉变主要是微生物类发酵引起，其中霉菌毒素是真菌的次生代谢产物，可对哺乳动物产生急性或慢性毒性，部分已被证实具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用。

因此，分析霉变烟叶中霉菌毒素含量的情况，有助于探索在此过程中真菌生长的变化规律，为有效防控微生物生长提供数据支持，现有检测方法分为快速筛选法和确证法两大类。快速筛选法主要是酶联免疫法，此方法具有存在一定的假阳性，不能作为最终的确证方法。真菌毒素检测的确证方法有薄层层析色谱法（TIC）、液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）以及液相串联质谱法（LC-MS/MS）等。LC-MS/MS可同时提供目标化合物的保留时间和分子结构信息，具有杂质影响小，对净化要求低、灵敏度高、适合多组分同时分析等特点。

为此，基于LC-MS/MS在定性定量的优势，探索开发采用液相色谱-串联三重四级杆质谱仪测定霉变烟叶中霉菌毒素含量的方法，对准确检测霉变烟叶中的霉菌毒素具有重要意义。

发明内容

为准确检测霉变烟叶中霉菌毒素的含量，本发明提供一种检测霉变烟叶中12种霉菌毒素浓度的方法，以准确定性定量检测霉变烟叶中的12种霉菌毒素浓度。

本发明通过以下技术方案实现：一种检测霉变烟叶中12种霉菌毒素浓度的方法，经过下列各步骤：

（1）制备12种霉菌毒素混合母液：分别称取桔青霉毒素、脱氧血腐镰刀菌醇、柄曲霉素、黄绿青霉素、T-2毒素、黄曲霉毒素M1、伏马毒素B2、伏马毒素B1、黄曲霉毒素混标的标准品于10mL容量瓶中，各采用甲醇溶解并定容，然后各分别移取1 mL上述12种溶液于25 mL容量瓶中，采用甲醇定容，得到12种霉菌毒素混合母液；取1ml标准溶液于25mL容量瓶中，并采用甲醇定容，得到内标溶液；

（2）准备标准工作溶液：分别移取0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL和1.0 mL步骤（1）所得12种霉菌毒素混合母液于10 mL容量瓶中，加入内标溶液1.0mL，采用体积浓度为0.1%的甲酸水溶液进行定容，得到标准工作溶液系列；

（3）制备样品溶液：称取1.0 g磨碎的待测霉变烟叶样品，置于50 mL离心管中，加入20 mL提取溶剂A，涡旋1min，振荡提取60min，再以5000rpm的转速离心5min后，将上清液转移到另一个50mL离心管中，然后向残渣中加入20mL提取溶剂B，涡旋1min，继续振荡提取30min，然后在5000rpm的转速下离心5min，合并第一次上清液；在合并两次提取的上清液时，可能会产生沉淀，因此，再次在5000rpm的转速离心5 min，取980μL终提取液（上清液）于样品瓶中，加入20μL内标溶液，充分混匀，经0.22μm过滤膜后得到样品溶液；

（4）进行液相色谱-串联三重四级杆质谱分析：采用液相色谱-串联三重四级杆质谱分析仪，分析检测的液相色谱、质谱条件如下：

色谱柱为Waters Acquity BEH C18（1.7μm，2.1mm×100mm），柱温：25℃；流动相A为体积浓度0.1%的甲酸水溶液，流动相B为体积浓度0.1%的甲酸甲醇溶液（溶质为甲酸，溶剂为甲醇）；梯度洗脱，条件为0 ~ 0.5 min：70% A，0.5 ~ 10 min：70% A ~ 0% A，10.0 ~10.1 min：0% A~70% A，10.1 ~14 min：70% A；流速：0.2 mL/min，进样体积5 μL；

离子源：采用电喷雾电离源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：500 V；干燥气温度：325℃；干燥气流量：6 L/min；鞘气温度：380℃；鞘气流量：10 L/min；毛细管电压：4000 V；

（5）绘制标准曲线及计算结果：分别吸取步骤（2）制备的标准工作溶液系列中的各不同浓度溶液进行LC-MS/MS分析，在步骤（4）确定的仪器参数下，以12种霉菌毒素定量离子峰面积对其所对应的质量浓度进行线性回归，得到各目标化合物的标准工作曲线；再吸取步骤（3）制备的样品溶液进行LC-MS/MS分析，在步骤（4）确定的仪器参数下，得到12种霉菌毒素定量离子峰面积，代入回归方程，计算得到样品溶液中12种霉菌毒素的浓度。

所述步骤（1）的黄曲霉毒素混标是由黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2组成。

所述步骤（1）的标准溶液是含有内标物质¹³C₃₄伏马毒素B1和¹³C₁₇黄曲霉毒素B1的溶液，¹³C₃₄伏马毒素B1和¹³C₁₇黄曲霉毒素B1的浓度分别为20μg/mL。

所述步骤（1）中的甲醇是色谱纯。

所述步骤（3）的提取溶剂A是乙腈：水的体积比为80：20的混合溶液，并加入甲酸至甲酸体积浓度为0.1%。

所述步骤（3）的提取溶剂B是乙腈：水的体积比为20：80的混合溶液，并加入甲酸至甲酸体积浓度为0.1%。

本发明所述的去离子水达到GB/T 6682 中一级水的要求。

本发明方法具有以下优点：

（1）本发明建立了一种液相色谱-三重四极杆串联质谱仪同时检测霉变烟叶中12种霉菌毒素的方法，能够准确地对霉变烟叶中12种霉菌毒素进行定性及定量。本发明方法准确可靠、灵敏度高，非常适合复杂基质霉变烟叶中12种霉菌毒素的分析。

（2）本发明使用不同极性溶剂（由于提取溶剂A、B中乙腈/水的体积比分别为80/20、20/80，乙腈和水存在极性差异，则提取溶剂A和B存在极性差异，为不同极性的两种溶剂）多次提取，能够有效的去除复杂基质对检测信号的干扰，同时不影响12种霉菌毒素相应值。

（3）本发明使用BEH C18色谱柱与0.1%甲酸水溶液+0.1%甲酸甲醇流动相的选择对12种霉菌毒素的分离达到了优异的分离效果。

（4）本发明脱氧血腐镰刀菌醇检出限为5.7 μg/kg，其余11种霉菌毒素检出限在0.08 μg/kg ~1.40 μg/kg之间，日内精密度RSD（n=3）1.31% ~ 8.92%，日间精密度RSD（n=3）4.80% ~ 12.09%，稳定性好，回收率在78.0% ~ 118.5%之间，准确性高；液相色谱-串联三重四级杆质谱仪操作简单快捷、准确可靠、重复性好。

附图说明

图1为桔青霉毒素定量离子的MRM图；

图2为脱氧血腐镰刀菌醇定量离子的MRM图；

图3为黄曲霉毒素B1定量离子的MRM图；

图4为黄曲霉毒素B2定量离子的MRM图；

图5为柄曲霉素定量离子的MRM图；

图6为黄曲霉毒素G1定量离子的MRM图；

图7为黄曲霉毒素M1定量离子的MRM图；

图8为黄曲霉毒素G2定量离子的MRM图；

图9为黄绿青霉素定量离子的MRM图；

图10为T-2毒素定量离子的MRM图；

图11为伏马毒素B2定量离子的MRM图；

图12为伏马毒素B1定量离子的MRM图；

图13为¹³C₃₄伏马毒素B1定量离子的MRM图；

图14为¹³C₁₇黄曲霉毒素B1定量离子的MRM图；

图15为某霉变烟叶黄曲霉毒素B1定量离子的MRM图；

图16为某霉变烟叶黄曲霉毒素G2定量离子的MRM图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行进一步说明。

准备测定仪器和材料：液相色谱-串联三重四级杆质谱仪（Agilent 1290-6460，美国）；分析天平（梅特勒AB204-S，瑞士）；容量瓶，10mL、100mL、锥形瓶，50mL；去离子水（达到GB/T 6682 中一级水的要求）；乙酸铵（分析纯，西陇化工股份有限公司）；甲醇（色谱纯，Dikma公司）；甲酸（分析纯，西陇化工股份有限公司）；高纯氮气（纯度≥99.999%，昆明梅塞尔气体产品有限公司）

（1）制备12种霉菌毒素混合母液：分别称取桔青霉毒素、脱氧血腐镰刀菌醇、柄曲霉素、黄绿青霉素、T-2毒素、黄曲霉毒素M1、伏马毒素B2、伏马毒素B1、黄曲霉毒素混标（含有黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2）的标准品于10mL容量瓶中，各采用甲醇（色谱纯）溶解并定容，然后各分别移取1 mL上述12种溶液于25 mL容量瓶中，采用甲醇（色谱纯）定容，得到12种霉菌毒素混合母液；取1ml标准溶液于25mL容量瓶中，并采用甲醇（色谱纯）定容，得到内标溶液；其中标准溶液是含有内标物质¹³C₃₄伏马毒素B1和¹³C₁₇黄曲霉毒素B1的溶液，¹³C₃₄伏马毒素B1和¹³C₁₇黄曲霉毒素B1的浓度分别为20μg/mL；

（2）准备标准工作溶液：分别移取0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL和1.0 mL步骤（1）所得12种霉菌毒素混合母液于10 mL容量瓶中，加入内标溶液1.0mL，采用体积浓度为0.1%的甲酸水溶液进行定容，得到标准工作溶液系列；

（3）制备样品溶液：称取1.0 g磨碎的待测霉变烟叶样品，置于50 mL离心管中，加入20 mL提取溶剂A，涡旋1min，振荡提取60min，再以5000rpm的转速离心5min后，将上清液转移到另一个50mL离心管中，然后向残渣中加入20mL提取溶剂B，涡旋1min，继续振荡提取30min，然后在5000rpm的转速下离心5min，合并第一次上清液；在合并两次提取的上清液时，可能会产生沉淀，因此，再次在5000rpm的转速离心5 min，取980μL终提取液（上清液）于样品瓶中，加入20μL内标溶液，充分混匀，经0.22μm过滤膜后得到样品溶液；

其中，提取溶剂A是乙腈：水的体积比为80：20的混合溶液，并加入甲酸至甲酸体积浓度为0.1%；提取溶剂B是乙腈：水的体积比为20：80的混合溶液，并加入甲酸至甲酸体积浓度为0.1%；

（4）进行液相色谱-串联三重四级杆质谱分析：采用液相色谱-串联三重四级杆质谱分析仪，分析检测的液相色谱、质谱条件如下：

色谱柱为Waters Acquity BEH C18（1.7μm，2.1mm×100mm），柱温：25℃；流动相A为体积浓度0.1%的甲酸水溶液，流动相B为体积浓度0.1%的甲酸甲醇溶液（溶质为甲酸，溶剂为甲醇）；梯度洗脱，条件为0 ~ 0.5 min：70% A，0.5 ~ 10 min：70% A ~ 0% A，10.0 ~10.1 min：0% A~70% A，10.1 ~14 min：70% A；流速：0.2 mL/min，进样体积5 μL；

离子源：采用电喷雾电离源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：500 V；干燥气温度：325℃；干燥气流量：6 L/min；鞘气温度：380℃；鞘气流量：10 L/min；毛细管电压：4000 V；

12种霉菌毒素和2种内标物质的准分子离子峰（[M+H]⁺离子峰）、锥孔电压、定量离子、定性离子、碰撞能量（CE）参见表1，12种霉菌毒素标准品和和2种内标物质各定量离子MRM图见图1至图14。

表1各化合物的[M+H]+离子峰、锥孔电压、定量离子、定性离子、碰撞能量

（5）绘制标准曲线及计算结果：分别吸取步骤（2）制备的标准工作溶液系列中的各不同浓度溶液进行LC-MS/MS分析，在步骤（4）确定的仪器参数下，以12种霉菌毒素定量离子峰面积对其所对应的质量浓度进行线性回归，得到各目标化合物的标准工作曲线；再吸取步骤（3）制备的样品溶液进行LC-MS/MS分析，在步骤（4）确定的仪器参数下，得到12种霉菌毒素定量离子峰面积，代入回归方程，计算得到样品溶液中12种霉菌毒素的浓度。

对本发明方法做如下方法学验证：用3倍和10倍噪音值分别计算该方法的检测限和定量限。所得的相关数据见表2。

表212种霉菌毒素的线性方程、相关系数、检测限、定量限

选择某霉变烟叶样品，经前处理后检测结果为不含有12种霉菌毒素，因此作为空白样品，然后分别添加高、中、低三个含量水平的12种霉菌毒素混合标准母液进行加标回收实验，计算回收率；同时进行该方法的日内精密度和日间精密度测定，用测定结果的相对标准偏差（RSD）表示，见表3。

表312种霉菌毒素的日内精密度、日间精密度、回收率

样品测定：从待测样品的MRM图（图15和图16）中可以看到样品在4.882 min和4.746 min处有一色谱峰与黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素G2的保留时间相近，样品在M/Z＝258.9处的特征分子离子峰，与黄曲霉毒素B2的特征分子离子峰相同；样品在M/Z＝313.0处的特征分子离子峰，与黄曲霉毒素G2的特征分子离子峰相同，可确定样品中含黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素G2。

将样品中黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素G2的峰面积代入线性回归方程中，即可得到样品中黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素G2的浓度为0.446 ng/mL和2.60 ng/mL，再乘以定容体积，除以称重量，得到：该霉变含有黄曲霉毒素B2 7.22 μg/kg，黄曲霉毒素G2 42.11 μg/kg。