一种榆钱提取物在制备治疗神经保护药物方面的用途

摘要

本发明公开了一种榆钱提取物在制备治疗神经保护药物方面的用途，本发明制备的榆钱提取物对人体无毒副作用，对利用去血清、鱼藤酮诱导PC12细胞损伤模型具有显著神经保护作用。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种榆钱提取物在制备治疗神经保护药物方面的用途。

背景技术

神经细胞是组成神经系统的基本功能单位,是中枢神经系统的主要功能载体，属于高度分化细胞,本身无再生能力。许多疾病都会导致神经细胞的损伤，例如中毒，缺氧、脑中风、退化性疾病等，一般可以归为三类，即氧化应激损伤、兴奋性氨基酸损伤和神经退化性损伤，而且神经细胞严重损伤后往往是不可逆的。神经细胞损伤会伴随严重后果，比如脑梗塞、脑出血、帕金森氏病、脑萎缩等等，严重危害人类健康和生命安全，给个人和社会造成沉重负担。目前就神经细胞的损伤做了大量研究，发现神经细胞损伤机制复杂，不是单一途径，也发现很多神经保护剂以及神经损伤治疗药物，例如钙离子拮抗剂、谷氨酸拮抗剂、地巴唑、维生素B1以及一些激素类药物，但是单用效果不稳定，还需要结合其他药物或中药以及物理疗法，周期长，治疗效果不明显，而且长期食用还容易有副作用。

中国专利CN105194504A公开了一种藏药舒更胶囊在制备具有神经保护作用药物中的应用，克服了现有技术应用方面的技术偏见，通过动物实验发现，舒更胶囊能显著增强细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低PC12神经细胞受损伤程度，降低大量一氧化氮(NO)所致神经细胞的损伤，对谷氨酸所致神经细胞损伤具有一定的修复保护作用。中国专利CN1728998A公开了一种杂环胺类化合物作为神经保护剂的用途，可以用于预防和减少患者神经元的损伤。但是这类治疗是以西药为主的治疗，副作用大，而从中草药中寻找新型的神经保护药物，是我国今后药物研究的一个必然趋势。

天然中草药种类丰富，天然化合物多种多样，在用于预防和治疗疾病时有得天独厚的优势。因此，越来越多的医药学家把天然中草药作为未来药物开发的重点对象。榆钱，又名榆实、榆子、榆仁、榆荚仁，为榆科植物榆树的翅果。在民间作为一种野菜，其营养物质非常丰富，深受人们的喜爱。现代医学研究表明，榆钱中不仅具有丰富的氨基酸和维生素，还含有大量的微量元素，如Mg、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、 Sr 和 Rb，具有降低血糖和胆固醇，通淋除湿、健脾益胃、安神以及促进儿童生长发育和减肥等功效。我们通过调研大量文献发现，有关榆钱在神经保护方面的研究未见有相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种榆钱提取物在制备治疗神经保护药物方面的用途，该榆钱提取物具有显著的神经保护作用，可用于制备治疗神经保护药物。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

榆钱提取物在制备治疗神经保护药物方面的用途。

一种榆钱提取物，由以下步骤制备：

（1）将榆钱烘干后粉碎，用体积分数为80-90%的乙醇溶液提取，提取液浓缩得乙醇提取浸膏；

（2）向所述乙醇提取浸膏中加蒸馏水混合均匀后，过滤得滤液，向所述滤液中加入氯仿进行萃取，得到氯仿层和水层，然后采用正丁醇对所述水层进行萃取得正丁醇萃取液，浓缩得正丁醇萃取浸膏；

（3）将所述正丁醇萃取浸膏过大孔吸附树脂柱，依次用体积分数为10%、30%以及95%的乙醇溶液进行梯度洗脱；

（4）将体积分数为30%乙醇洗脱液浓缩干燥后过硅胶柱，依次用体积比为8:1、4:1和2:1的石油醚-丙酮进行梯度洗脱；

（5）将体积比为4:1的石油醚-丙酮洗脱液过凝胶柱，再采用体积分数为80-95 %甲醇溶液进行洗脱，得甲醇洗脱液，将所述甲醇洗脱液浓缩干燥，即得榆钱提取物。

进一步的，所述步骤（1）中烘干温度为40-50℃，所述乙醇溶液提取为超声波提取2-3次，所述榆钱与乙醇溶液的体积比为1:6-9，所述超声波功率为200-300W，提取时间为20-40min，所述提取液浓缩温度为40-50℃。

进一步的，所述步骤（2）中乙醇提取浸膏与蒸馏水的体积比为1:1-2，所述滤液与氯仿体积比为1:1。

进一步的，所述步骤（3）中大孔吸附树脂型号为D-101、X-5或H103。

进一步的，所述步骤（4）中硅胶柱中硅胶粒径为200-300目。

进一步的，所述步骤（5）中凝胶柱为Toyopearl HW-40凝胶柱或Sephadex LH-20凝胶柱。

本发明的有益效果是：

1、本发明公开了一种榆钱提取物在制备治疗神经保护药物方面的用途，该榆钱提取物原料来自纯天然植物，无毒、无公害，发明人对榆钱提取物进行了小鼠急性毒性试验，在试验期内小鼠活动正常，无死亡，十四日后解剖小鼠， 脏器未见异常现象。另外建立去血清、鱼藤酮诱导PC12细胞损伤药理模型，考察榆钱提取物的神经保护作用，试验结果表明榆钱提取物对利用去血清、鱼藤酮诱导PC12细胞损伤模型具有显著神经保护作用。因此，该榆钱提取物可用于制备治疗神经保护药物。

2、本发明中用于制备治疗神经保护药物的榆钱提取物的制备方法是发明人经过无数次的辛苦试验总结而得到的，其中整个提取过程控制低温即40-50℃，能最大限度减少提取过程中的提取物损失，提取过程中分别过大孔吸附树脂柱、硅胶柱以及凝胶柱，并采用不同的洗脱液洗脱，根据测试筛选出具有神经保护的提取物。其中根据对比试验确定出榆钱提取物制备方法中在步骤步骤（4）选取30%乙醇洗脱液浓缩干燥后过硅胶柱，在步骤（5）中选取体积比为4:1的石油醚-丙酮洗脱液过凝胶柱进而制备的榆钱提取物对利用鱼藤酮和去血清诱导PC12细胞损伤药理模型具有显著神经保护作用。

3、本发明制备方法简单方便，原料制备过程绿色环保、易于控制，所得提取物产率较高，因此，本发明具有很好的市场开发前景。

附图说明

图1为本发明榆钱提取物制备流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

一种榆钱提取物，如图1所示，由以下步骤制备：

（1）将榆钱在40℃下干燥后粉碎至30目，与体积分数为80%的乙醇溶液按体积比1:6混合后，浸泡20min，然后置于超声波提取仪中，在300W功率下超声提取20min，连续提取2次，提取后过滤合并滤液，所得滤液在40℃减压浓缩得乙醇提取浸膏；

（2）向乙醇提取浸膏中加入蒸馏水，其中乙醇提取浸膏与蒸馏水的体积比为1:1，然后搅拌均匀得分散液，静置20h后，过滤，得滤液，然后向滤液中加入相同体积的氯仿（滤液：氯仿=1:1 V/V），萃取2次，得氯仿萃取层和水层，然后采用正丁醇对水层进行萃取得正丁醇萃取液和水层，将正丁醇萃取液浓缩除正丁醇后得正丁醇萃取浸膏；

（3）将正丁醇萃取浸膏与蒸馏水按体积比1:1混合后过D-101大孔吸附树脂柱，依次用体积分数为10%、30%以及95%的乙醇溶液进行梯度洗脱；

（4）将体积分数为30%乙醇洗脱液浓缩干燥后过硅胶柱，其中硅胶柱中硅胶粒径为200-300目，依次用体积比为8:1、4:1和2:1的石油醚-丙酮进行梯度洗脱；

（5）将体积比为4:1的石油醚-丙酮洗脱液浓缩干燥后用80%甲醇溶液溶解后过Toyopearl HW-40凝胶柱，再采用体积分数为80%甲醇溶液进行洗脱，得甲醇洗脱液，将所述甲醇洗脱液浓缩干燥，即得榆钱提取物。

实施例2

一种榆钱提取物，如图1所示，由以下步骤制备：

（1）将榆钱在45℃下干燥后粉碎至40目，与体积分数为85%的乙醇溶液按体积比1:7混合后，浸泡30min，然后置于超声波提取仪中，在250W功率下超声提取30min，连续提取3次，提取后过滤合并滤液，所得滤液在45℃减压浓缩得乙醇提取浸膏；

（2）向乙醇提取浸膏中加入蒸馏水，其中乙醇提取浸膏与蒸馏水的体积比为1:2，然后搅拌均匀得分散液，静置25h后，过滤，得滤液，然后向滤液中加入相同体积的氯仿（滤液：氯仿=1:1 V/V），萃取3次，得氯仿萃取层和水层，然后采用正丁醇对水层进行萃取得正丁醇萃取液和水层，将正丁醇萃取液浓缩除正丁醇后得正丁醇萃取浸膏；

（3）将正丁醇萃取浸膏与蒸馏水按体积比1:1混合后过X-5大孔吸附树脂柱，依次用体积分数为10%、30%以及95%的乙醇溶液进行梯度洗脱；

（4）将体积分数为30%乙醇洗脱液浓缩干燥后过硅胶柱，其中硅胶柱中硅胶粒径为200-300目，依次用体积比为8:1、4:1和2:1的石油醚-丙酮进行梯度洗脱；

（5）将体积比为4:1的石油醚-丙酮洗脱液浓缩干燥后用85%甲醇溶液溶解后过Sephadex LH-20凝胶柱，再采用体积分数为85%甲醇溶液进行洗脱，得甲醇洗脱液，将所述甲醇洗脱液浓缩干燥，即得榆钱提取物。

实施例3

一种榆钱提取物，如图1所示，由以下步骤制备：

（1）将榆钱在50℃下干燥后粉碎至50目，与体积分数为83%的乙醇溶液按体积比1:8混合后，浸泡40min，然后置于超声波提取仪中，在220W功率下超声提取35min，连续提取2次，提取后过滤合并滤液，所得滤液在50℃减压浓缩得乙醇提取浸膏；

（2）向乙醇提取浸膏中加入蒸馏水，其中乙醇提取浸膏与蒸馏水的体积比为1:1，然后搅拌均匀得分散液，静置28h后，过滤，得滤液，然后向滤液中加入相同体积的氯仿（滤液：氯仿=1:1 V/V），萃取2次，得氯仿萃取层和水层，然后采用正丁醇对水层进行萃取得正丁醇萃取液和水层，将正丁醇萃取液浓缩除正丁醇后得正丁醇萃取浸膏；

（3）将正丁醇萃取浸膏与蒸馏水按体积比1:1混合后过D-101大孔吸附树脂柱，依次用体积分数为10%、30%以及95%的乙醇溶液进行梯度洗脱；

（4）将体积分数为30%乙醇洗脱液浓缩干燥后过硅胶柱，其中硅胶柱中硅胶粒径为200-300目，依次用体积比为8:1、4:1和2:1的石油醚-丙酮进行梯度洗脱；

（5）将体积比为4:1的石油醚-丙酮洗脱液浓缩干燥后用90%甲醇溶液溶解后过Toyopearl HW-40凝胶柱，再采用体积分数为90%甲醇溶液进行洗脱，得甲醇洗脱液，将所述甲醇洗脱液浓缩干燥，即得榆钱提取物。

实施例4

一种榆钱提取物，如图1所示，由以下步骤制备：

（1）将榆钱在50℃下干燥后粉碎至30目，与体积分数为90%的乙醇溶液按体积比1:9混合后，浸泡35min，然后置于超声波提取仪中，在200W功率下超声提取40min，连续提取3次，提取后过滤合并滤液，所得滤液在50℃减压浓缩得乙醇提取浸膏；

（2）向乙醇提取浸膏中加入蒸馏水，其中乙醇提取浸膏与蒸馏水的体积比为1:1.5，然后搅拌均匀得分散液，静置30h后，过滤，得滤液，然后向滤液中加入相同体积的氯仿（滤液：氯仿=1:1 V/V），萃取3次，得氯仿萃取层和水层，然后采用正丁醇对水层进行萃取得正丁醇萃取液和水层，将正丁醇萃取液浓缩除正丁醇后得正丁醇萃取浸膏；

（3）将正丁醇萃取浸膏与蒸馏水按体积比1:1混合后过D-101大孔吸附树脂柱，依次用体积分数为10%、30%以及95%的乙醇溶液进行梯度洗脱；

（4）将体积分数为30%乙醇洗脱液浓缩干燥后过硅胶柱，其中硅胶柱中硅胶粒径为200-300目，依次用体积比为8:1、4:1和2:1的石油醚-丙酮进行梯度洗脱；

（5）将体积比为4:1的石油醚-丙酮洗脱液浓缩干燥后用95%甲醇溶液溶解后过Toyopearl HW-40凝胶柱，再采用体积分数为95%甲醇溶液进行洗脱，得甲醇洗脱液，将所述甲醇洗脱液浓缩干燥，即得榆钱提取物。

对比例1

对比例1中榆钱提取物的制备方法与实施例3基本相同，不同之处在于：

步骤（5）：将体积比为8:1的石油醚-丙酮洗脱液浓缩干燥后用90%甲醇溶液溶解后过Toyopearl HW-40凝胶柱，再采用体积分数为90%甲醇溶液进行洗脱，得甲醇洗脱液，将所述甲醇洗脱液浓缩干燥，即得榆钱提取物。

其他制备步骤均与实施例3相同。

对比例2

对比例2中榆钱提取物的制备方法与实施例3基本相同，不同之处在于：

步骤（5）：将体积比为2:1的石油醚-丙酮洗脱液浓缩干燥后用90%甲醇溶液溶解后过Toyopearl HW-40凝胶柱，再采用体积分数为90%甲醇溶液进行洗脱，得甲醇洗脱液，将所述甲醇洗脱液浓缩干燥，即得榆钱提取物。

其他制备步骤均与实施例3相同。

对比例3

对比例3中榆钱提取物的制备方法与实施例3基本相同，不同之处在于：

步骤（4）：将体积分数为10%乙醇洗脱液浓缩干燥后过硅胶柱，其中硅胶柱中硅胶粒径为200-300目，依次用体积比为8:1、4:1和2:1的石油醚-丙酮进行梯度洗脱。

其他制备步骤均与实施例3相同。

对比例4

对比例4中榆钱提取物的制备方法与实施例3基本相同，不同之处在于：

步骤（4）将体积分数为95%乙醇洗脱液浓缩干燥后过硅胶柱，其中硅胶柱中硅胶粒径为200-300目，依次用体积比为8:1、4:1和2:1的石油醚-丙酮进行梯度洗脱。

其他制备步骤均与实施例3相同。

榆钱提取物的急性毒性试验

取体重20±2g小鼠20只，雌雄各半，给药首日，禁食12h，不禁水，用实施例3制备的榆钱提取物，按100mg/10g，灌胃。饲养小鼠两周，观察小鼠生理表现和死亡情况。结果表明试验期内其小鼠活动正常，毛发色泽，摄食及排泄正常，两周内各组小鼠都无死亡，两周后剖杀小鼠，肉眼观察小鼠脏器， 未见异常现象。说明本发明榆钱提取物安全无毒副作用。

榆钱提取物药理作用试验

取铺满单层的PC12细胞，弃去原培养液，加入5% 胎牛血清(FBS)、5%马血清的DMEM完全培养液，用吸管轻轻吹打使细胞分散完全，以5×10⁴个/mL密度，每孔100>

实验分为三组：

（1）空白组：正常的PC12细胞给予完全培养基培养；

（2）模型组：包括鱼藤酮模型组和去血清模型组；

鱼藤酮模型组是在完全培养基中加入4μM鱼藤酮作用48 h，即造成PC12细胞损伤模型；

去血清模型组是将完全培养基换成无血清DMEM培养基作用细胞48 h，即造成PC12细胞损伤模型；

（3）加药组：即模型组+药物组，在模型组中同时分别加入10 μM实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4中制备的榆钱提取物。

然后加入10 μL 5 mg/mL 噻唑蓝（MTT），4 h后去上清，加入150 μL二甲基亚砜（DMSO）用酶标仪于570nm测定吸光度，计算细胞存活率。其中细胞存活率=（加药组或模型组/对照组）×100%，进而筛选出活性单体化合物，测试结果如表1和表2所示。

表1 榆钱提取物对鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的影响(means士SD, n=6)

表2 榆钱提取物对去血清诱导PC12细胞损伤的影响(means士SD, n=6)

注：^##P<0.01,>###P<0.001与对照组比较；>*P<0.05,>**P<0.001与模型组比较

由表1和表2可以看出，在完全培养基中加入鱼藤酮后的鱼藤酮模型组的细胞存活率平均值（73.6±14.4）明显低于对照组（100±6.2），差异具有统计学意义（^##P<0.01），去血清模型组的细胞存活率平均值（60.2±12.1）也明显低于对照组（100±4.5），差异具有统计学意义（^###P<0.001）。在鱼藤酮模型组中加入10^-5M实施例3制备的榆钱提取物的细胞存活率（82.9±5.7）远高于鱼藤酮模型组的细胞存活率（73.6±14.4），差异具有统计学意义（^**P<0.001）；在去血清模型组中添加10^-5M实施例3制备的榆钱提取物的细胞存活率（67.1±7.3）也远高于去血清模型的细胞存活率（60.2±12.1），差异具有统计学意义（*P<0.05）。说明本发明制备的榆钱提取物对利用鱼藤酮和去血清诱导PC12细胞损伤药理模型具有显著神经保护作用。

而对比例1-4中制备的榆钱提取物的细胞存活率与鱼藤酮模型组的细胞存活率相比，没有明显的差异，对比例1-4中制备的榆钱提取物的细胞存活率与去血清模型组相比，也没有明显的差异，而且对比例的结果也具有统计学意义（*P<0.05, **P<0.001）。对比例1和对比例2与实施例3的不同之处是在步骤（5）中分别选用体积比为8:1和2:1的石油醚-丙酮洗脱液浓缩干燥后用90%甲醇溶液溶解后过Toyopearl HW-40凝胶柱；对比例3和对比例4与实施例3的不同之处是在步骤（3）中分别选取10%和95%乙醇洗脱液浓缩干燥后过硅胶柱，对比例1-4中的其他步骤均与实施例3相同，说明在步骤（4）选取30%乙醇洗脱液浓缩干燥后过硅胶柱，在步骤（5）中选取体积比为4:1的石油醚-丙酮洗脱液浓缩干燥后用90%甲醇溶液溶解后过凝胶柱进而制备的榆钱提取物对利用鱼藤酮和去血清诱导PC12细胞损伤药理模型具有显著神经保护作用。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。