丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶及基因、检测抑制剂活性的方法

摘要

本发明公开了一种丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶及其基因、检测抑制剂性活性的方法。所述的基因其核苷酸序列为：1)序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或，2)编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白质的核苷酸序列。所述的检测抑制剂活性的方法避免了普通细胞筛选模型筛选药物时繁琐、高成本的缺陷，具有药物作用机制明确，成本低，效率高，灵敏度高，可实现高通量筛选的优越性。

说明书

技术领域

本发明属于抗丙型肝炎病毒药物筛选领域，具体涉及一种丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶及其基因、检测抑制剂活性的方法。

背景技术

丙型肝炎是常见的血源性传染疾病，其病因是丙型肝炎病毒(Hapatitis CVirus，HCV)的感染。HCV感染人肝细胞后可导致慢性肝炎，肝纤维化，肝硬化和肝癌。临床以干扰素联合利巴韦林治疗丙型肝炎，然而该种疗法患者依从性差，而且会产生副作用、易复发，因此迫切需要研发新的药物用于丙肝的治疗。

HCV病毒颗粒在体外无法复制，所以难以在体外建立其细胞培养模型和动物培养模型，极大地限制了特异性HCV药物的研发进展。近年来，随着细胞技术的不断进步，HCV的细胞培养模型逐渐建立，然而这些细胞培养模型建立成本高、条件繁琐苛刻。此外，许多研究表明随着培养时间的延长，已感染HCV的细胞经过几代后容易回复突变，因此以细胞培养为基础的药物筛选耗时耗力，效果平平。

NS3蛋白酶也称丝氨酸蛋白酶，与NS4A结合可以水解病毒前体蛋白间的连接，直接决定着病毒各功能蛋白的成熟，对病毒前体蛋白成熟和病毒复制起重要作用，因此NS3/4A蛋白酶是丙型肝炎治疗药物研究的重要靶点。目前已经上市的针对NS3/4A蛋白酶抑制剂有特拉匹韦(telaprevir)，博赛匹韦(boceprevir)和西甲匹韦(simeprevir)，这些药物在临床上具有较好的疗效，但也存在价格昂贵，口服利用度低，耐药屏障低，交叉耐药等不足。

曾有针对NS3/4A筛选模型用酶联免疫吸附法进行筛选的报道，由于测定方法繁琐，灵敏度低，成本高，该酶联免疫吸附法未能广泛应用。报道中涉及的NS3/4A蛋白酶表达基因序列冗长，表达的蛋白分子量过大，也不利于丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶体外表达的稳定性(酶联免疫吸附试验检测HCV NS3-4A蛋白酶活性，陈湘红等，中国医学科学院学报，第22卷第3期，第301～303页，公开日2000年6月)。因此优化NS3/4A蛋白酶序列，并建立高效的蛋白酶抑制剂体外筛选模型并用于筛选新型抗HCV蛋白酶药物具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中丙肝病毒药物筛选所采用的细胞模型繁琐耗时、安全问题难以保证的不足，以及现有的NS3/4A蛋白酶表达体系序列冗长、制备困难等的缺陷，提供一种丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶及其基因和检测抑制剂活性的方法。

发明人经过探索发现，可以将编码天然的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的基因的核苷酸序列进行优化，从而通过基因工程的手段获得丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶。而特定底物与所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的特异性反应能够产生代谢产物，代谢产物中的荧光剂EDANS能够被490nm的激发光激发产生512nm的荧光，因此能够根据代谢产物的荧光强度的变化检测丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶活性，从而获得灵敏度高、效率高的检测丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂活性的方法。

同时，发明人还进一步对上述方法中的多个参数条件，如所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的用量、底物P06221的浓度、反应时间、反应体系的pH值和反应温度等进行优化，从而进一步优化的检测抑制剂活性的方法。

本发明的技术方案之一是：一种丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的基因，其核苷酸序列为：

1)序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或，

2)编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白质的核苷酸序列。

本发明中，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的编码丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的基因的核酸序列全长2070bp，编码690个氨基酸，所用密码子有利于丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶体外表达的稳定性及水溶性。

本发明所述的基因的制备方法为本领域常规，较佳地为从重组表达所述基因所编码的蛋白质的重组表达载体的质粒中扩增获得或人工合成获得。

本发明的技术方案之二是：提供一种含有所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的基因的重组表达载体。

所述的重组表达载体通过本领域常规方法将所述丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶基因连接于各种骨架载体上构建而成；较佳地，为由包括如下步骤的方法获得，通过PCR扩增获得的所述丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的基因的扩增产物与载体连接，形成克隆载体，将所述克隆载体和所述骨架载体用限制性内切酶进行双酶切，形成互补的粘性末端，再经连接酶连接，即可。所述PCR扩增的模板为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示的所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶基因。所述PCR扩增的引物为本领域常规的引物，能够扩增出如序列表中SEQ ID No.1所示的所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶基因即可；较佳地为上游引物S3-up：5’-AAACATATGGCGCCTATCACGGCTTACTC-3’(其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示)，下游引物S4A-down：5’-AAAGGATCCTTATTACTTCTTCTTTCC-3’(其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.4所示)。所述的载体为本领域常规的载体，较佳地为质粒pET28a。所述的限制性内切酶为本领域常规的内切酶，较佳地为BamH I和Nde I。较佳地，将所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的基因作为模板，利用所述引物S3-up和S4A-down进行PCR扩增获得扩增产物，通过BamH I和Nde I酶切位点构建含有所述基因的重组载体pET28a-NS3。

本发明的技术方案之三是：提供一种含有所述丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的基因的重组表达载体的转化子。

本发明所述转化子由通过本领域常规方法将所述重组表达载体转化至宿主微生物中制得；较佳地，将所述重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，即可。所述宿主微生物可为本领域常规的宿主微生物，只要能满足所述重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的基因可被有效表达即可；较佳地为大肠杆菌，更佳地为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的技术方案之四是：提供一种丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶具有丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶生物活性。编码所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的核苷酸序列与序列HCV-1b/US/BID-V130/1994(GenBank：EU155330.2)相比，其第1282-1284、1291-1293、1474-1476和1480-1482更改为编码丝氨酸的核苷酸序列，同时在序列HCV-1b/US/BID-V130/1994的末端增加编码3个赖氨酸和3个甘氨酸的核苷酸序列。

本发明的技术方案之五是：提供一种制备所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的制备方法，其包括以下的步骤：培养所述的转化子，从培养物获得所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶。

所述的转化子表达的方法为本领域常规的方法，较佳地为用IPTG诱导转化子表达。所述转化子的宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，较佳地为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的技术方案之六是：提供一种所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶在检测丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂活性中的应用。

本发明的技术方案之七是：提供一种利用所述的丙型肝炎病毒蛋白酶检测丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂活性的方法，其包括以下的步骤：

①将所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶、荧光物质标记的底物和待筛选的抑制剂进行温育，所述的荧光物质包括荧光剂和淬灭剂，所述的底物含有所述丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶特异性识别的Cys-Ala-Ser或Cys-Ser位点；

②步骤①所述的温育结束后在步骤①所述的荧光物质所对应的激发光和发射光的波长下检测荧光强度。

步骤①为：将所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶、荧光物质标记的底物和待筛选的抑制剂进行温育，所述的荧光物质包括荧光剂和淬灭剂，所述的底物含有所述丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶特异性识别的Cys-Ala-Ser或Cys-Ser位点。其中，较佳地，所述的底物为P06221，其氨基酸如序列表SEQID No.5所示。所述的荧光剂为本领域常规的荧光剂，较佳地为荧光剂EDANS。较佳地，所述荧光剂EDANS对应的激发光的波长为490nm。所述的猝灭剂为本领域常规的猝灭剂，较佳地为猝灭剂DABCUL(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。较佳地，所述猝灭剂DABCUL对应的发射光的波长为512nm。所述的温育的温度为本领域常规的温度，较佳地为25～37℃，更佳地为25～30℃。所述温育的时间为本领域常规的时间，较佳地为30～300min，更佳地为60～300min。所述温育的pH值为本领域常规的pH值，较佳地为7～8.5，更佳地为7.5～8.5。所述的底物P06221的浓度为本领域常规的浓度，较佳地为0.1～15μM，更佳地为0.5～10μM。所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的用量为本领域常规的用量，较佳地为0.2～2mg/mL，更佳地为0.8～2mg/mL。

较佳地，所述的温育在缓冲混合体系A中进行，所述的缓冲混合体系A包括25mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、150mM NaCl和10mM二硫苏糖醇(DTT)，pH7.5。

步骤②为：步骤①所述的温育结束后在步骤①所述的荧光物质所对应的激发光和发射光的波长下检测荧光强度。其中，所述的荧光强度根据抑制率来衡量，所述的抑制率越高，表示抑制作用越强，即表示所述的荧光强度越弱。所述抑制率的计算公式为：抑制率＝(A-B)/A×100％，A：空白对照的荧光变化值；B：待筛选的抑制剂的荧光变化值。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明用大肠杆菌获得具有生物活性的所述的丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶，并以此构建检测丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂活性的方法，避免了普通细胞筛选模型筛选药物时繁琐、高成本的缺陷。本发明所述的检测丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂活性的方法，具有药物作用机制明确，成本低，筛选效率高，灵敏度高，可实现高通量筛选等优点。

附图说明

图1为扩增NS3/4A蛋白酶基因的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M表示Maker DL2501(捷瑞)，泳道1、2分别表示pET28a经BamHI和NdeI酶切后获得的回收样品，大小为5.4Kb；泳道3、4表示利用引物S3-up和S4A-down获得的PCR扩增产物，大小为2.1Kb。

图2为重组质粒pET28a-NS3的酶切鉴定电泳图。其中，M:MakerDL2501(捷瑞)，泳道1～7分别表示构建的重组质粒。

图3为重组菌株诱导纯化后获得纯化的目的蛋白NS3/4A蛋白酶。其中，M表示蛋白Marker(TaKaRa)全液：细胞破碎样品全液；L0为上清液；L1为15mL缓冲液洗脱后的洗脱液；W1：为15mL冲洗缓冲液洗脱一次后的洗脱液；W2：为15mL冲洗缓冲液再次洗脱后的洗脱液；W3：为15mL冲洗缓冲液洗脱三次后的洗脱液；E为纯化后获得纯化的目的蛋白NS3/4A蛋白酶，大小为66.7KDa。

图4为pH值改变对NS3/4A蛋白酶活性的影响。

图5为不同底物浓度条件的荧光强度。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例中所述的底物P06221是一条多肽(Ac-Asp-Glu-Glu-Glu-Glu-Alg-Ala-Ser-Lys)，并用荧光剂EDANS和猝灭剂DABCUL标记(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)

实施例1重组质粒pET28a-NS3的构建

1)从NCBI网站获得所有报道的丙型肝炎1b亚型的全基因序列共计164条，利用http：//www.drive5.com/uclust软件进行聚类分析，选择相似度达到90％以上的、最具有代表性的序列作为研究对象，即序列HCV-1b/US/BID-V130/1994(GenBank：EU155330.2)。选取其中的编码NS3/4A的全部序列，该序列的核酸全长为2055bp，编码685个氨基酸。为了增加NS3/4A蛋白酶的体外活性及稳定性，对基因序列进行密码子优化，序列优化后的NS3/4A蛋白酶基因的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1。对优化后的基因采用化学合成的方法进行全基因合成(由上海捷瑞生物工程有限公司合成)，把合成的全长基因连接到载体pGH(购自上海捷瑞生物工程有限公司)上，获得克隆载体pGH-NS3，测序验证序列完全正确(由上海捷瑞生物工程有限公司测序验证)。

2)设计用于PCR扩增NS3/4A蛋白酶基因的引物，上游引物S3-up的序列为5’-AAACATATGGCGCCTATCACGGCTTACTC-3’(如序列表SEQ IDNo.3所示)，下游引物S4A-down的序列为5’-AAAGGATCCTTATTACTTCTTCTTTCC-3’(如序列表SEQ ID No.4所示)。

3)以含有密码子优化的NS3/4A蛋白酶序列的克隆载体pGH-NS3为模板，利用引物S3-up和S4A-down在LA(TaKaRa)的催化下进行PCR扩增，获得2.1Kb的NS3/4A蛋白酶序列。扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2.5min，共30个循环，72℃再延伸5min。扩增结果如图1所示。图1中，泳道3和4利用引物S3-up和S4A-down，PCR扩增出清晰明亮的大小约为2Kb的条带。PCR扩增获得的NS3/4A蛋白酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，其所编码的NS3/4A蛋白酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

4)用BamH I和Nde I分别对PCR扩增获得的NS3/4A蛋白酶基因的核苷酸序列和大肠杆菌表达载体pET28a(购自上海捷瑞生物工程有限公司)进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，利用T4连接酶(购自TaKaRa)于4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，利用含有30μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板，37℃培养12h。

5)挑取抗性平板上生长的单菌落接种5mL含有30μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm 37℃下过夜培养，提取质粒，进行BamHI和NdeI双酶切鉴定，得到含有NS3/4A蛋白酶基因的核苷酸序列(如序列表SEQ IDNo.1所示)的重组质粒pET28a-NS3。对酶切鉴定正确的重组质粒进行测序验证，酶切电泳结果如图2所示。图2说明，泳道2、4、6和7所对应的重组质粒pET28a-NS3中的确含有如序列表SEQ ID No.1所示的NS3/4A蛋白酶基因的核苷酸序列。

实施例2重组菌株的构建、诱导表达及蛋白纯化。

1)将重组质粒pET28a-NS3转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含有30μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板，37℃培养12h。挑取抗性平板上生长的单菌落接种于5mL含有30μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm 37℃下过夜培养，提取质粒，进行Bam HI和NdeI双酶切鉴定，即获得重组菌株。保存验证正确的菌株。

2)接50μL步骤1)所述验证正确的单菌落于5mL LB中，200rpm 37℃下震荡过夜，得过夜培养物。接500μL过夜培养物于50mL LB中，200rpm 37℃下震荡培养至OD₆₀₀为0.6时，添加0.5mM>

3)将步骤2)获得的收集菌液4℃7000～8000g离心10min，收集沉淀的菌体。将1g菌体加20mL裂解缓冲液(包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)25mM、NaCl 300mM、咪唑(Imidazole)10mM、EDTA 1mM、甘油10％和Triton X-100)，在冰上混合，涡旋震荡混匀。将细胞悬浮起来，加入溶菌酶(0.3mg/mL)，混匀，冰上静置30min。加入10％TritonX-100，使Triton的终浓度为0.05％，所述的百分比为体积百分比，充分混匀，超声破碎细胞，4℃8000g离心30min，取上清。在上清中加入1mL Resin(上海生工)4℃震荡过夜，充分结合，过亲和层析柱空柱，依次用15mL缓冲液(包括Hepes25mM、NaCl 300mM、Imidazole 10mM、EDTA 1mM、甘油10％和TritonX-100)、15mL冲洗缓冲液(包括Hepes 25mM、NaCl 300mM、Imidazole 20mM、EDTA 1mM、甘油10％和Triton X-100)洗脱，得洗脱液。洗脱液中含有目的蛋白NS3/4A蛋白酶，将目的蛋白进行透析，用1L的透析液(包括Hepes25mM、NaCl 150mM、甘油10％、Triton X-1000.1％和二硫苏糖醇(DTT)10mM，PH7.5)4℃透析过夜后得纯化的目的蛋白，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化的目的蛋白的大小及纯度，结果如图3所示E为纯化后获得纯化的目的蛋白NS3/4A蛋白酶，其中目的蛋白的大小为66.7KDa，纯度可达到90％。后在纯化的目的蛋白中加入10mM的DTT，分装，-70℃保存。

实施例3NS3/4A蛋白酶的活性实验

将100μg/mL NS3/4A蛋白酶与底物P06221进行反应，在反应体系中加入NS3/4A蛋白酶、底物，进行温育，所述的反应体系为：NS3/4A蛋白酶液95μL，5μM底物2.5μL，30℃下温育60分钟，设定5组平行对照，调整pH分别为6.5、7、7.5、8和8.5。测定不同pH条件下的荧光-pH曲线。结果显示在测定60min时，显示pH值7.5时荧光强度最高(图4)。

实施例4NS3/4A蛋白酶的活性实验

将100μg/mL NS3/4A蛋白酶与底物P06221进行反应，在反应体系中加入NS3/4A蛋白酶、底物，25℃下温育300分钟，所述的反应体系为：NS3/4A蛋白酶液97.5μL，底物2.5μL，pH7.5条件下温育，设定4组平行对照，底物浓度分别为1μM，2.5μM，5μM，10μM，测定不同浓度底物的荧光-时间曲线。结果显示底物浓度越高，最终测得荧光强度越高，最终底物浓度为5μM效果较好(图5)。

实施例5NS3/4A蛋白酶的活性抑制实验

将NS3/4A蛋白酶与底物P06221进行反应，用特拉匹韦(购自Selleck)进行抑制实验，实验仪器为BioTek多功能酶标仪和96孔黑色酶标板。特拉匹韦用DMSO溶解，分别稀释至50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL和0.5μg/mL，在反应体系中加入NS3/4A蛋白酶、底物，进行温育，所述的反应体系为：1μL待测抑制剂、94μLNS3/4A蛋白酶液，2.5μL底物，pH7.5条件下温育60分钟。30℃温育后在490nm的激发光和512nm的发射光下检测荧光强度的变化。抑制实验结果如表1所示。

表1 特拉匹韦对NS3/4A蛋白酶的抑制率(％)

表1的结果说明，测得的特拉匹韦的IC₅₀值为1.25μg/mL，与理论特拉匹韦的IC₅₀值相近。且当底物为0.1μg/mL时其抑制率为8.9％，说明所构建模型能检测nM级别的待测药物，灵敏度高(可准确检测0.1μg/mL的底物)。

实施例6NS3/4A蛋白酶的活性抑制实验

将NS3/4A蛋白酶与底物P06221进行反应，用特拉匹韦进行抑制实验，实验仪器为BioTek多功能酶标仪和96孔黑色酶标板。特拉匹韦用DMSO溶解，分别稀释至50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL和0.5μg/mL，在反应体系中加入NS3/4A蛋白酶、底物，进行温育，所述的反应体系为：1μL待测抑制剂，94μL NS3/4A蛋白酶液、2.5μL底物，37℃温育30分钟。温育后在490nm的激发光和512nm的发射光下检测荧光强度的变化。实验结果显示温度变化荧光强度变弱，检测信号值变小，但对抑制剂测得的IC₅₀值无明显影响。

实施例7NS3/4A蛋白酶的活性抑制实验

将NS3/4A蛋白酶与底物P06221进行反应，用特拉匹韦进行抑制实验，实验仪器为BioTek多功能酶标仪和96孔黑色酶标板。特拉匹韦用DMSO溶解，分别稀释至50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL和0.5μg/mL，在反应体系中加入NS3/4A蛋白酶、底物，进行温育，在其余条件不变的情况下体系增加至200μL，温育后在490nm的激发光和512nm的发射光下检测荧光强度的变化。实验结果显示体系变大后，对抑制剂测得的IC₅₀值无明显影响，但酶量，底物等消耗增加，因此优选100μL反应体系。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不构成对权利要求范围的限制，本领域内技术人员可以想到的其他实质上等同的替代，均在本发明保护范围内。