一种沙旋复花中标准化提取物及其分析方法和应用

摘要

本发明公开了一种沙旋复花中标准化提取物及其提取方法和应用。从沙旋复花中共分离得到16个化合物，综合运用核磁共振光谱、紫外光谱和质谱等现代波谱学技术，鉴定了它们的结构，新化合物化学式为C21H32O8，晶体颜色为白色，命名为II型泽兰内酯。活性研究发现，化合物IS‑10对黄曲条跳甲等害虫有驱避作用；化合物IS‑3，IS‑16有拒食作用，证明沙旋复花中倍半萜化合物是产生杀虫活性的有效成分。本发明还公开了一种标准化的沙旋复花提取物的制备和定量分析方法，活性测试发现提取物对黄曲条跳甲等害虫也具有明显的趋避和拒食作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从草药中提取的驱虫杀虫化学活性成分及其制备和分析方法，具体，涉及沙旋复花中杀虫化合物及一个新化合物的分离及活性和其标准化驱虫杀虫提取物的制备和定量分析方法。

背景技术

沙复旋花为菊科旋复花属植物沙地旋复花的花及全草，别名秃女子草、黄喇嘛、黄花嵩、蓼子朴。广泛分布于我国中部和西部地区，在蒙、冀、晋、陕、新、青海北部和东部和辽宁西部都有生长。国外分布于蒙古和原苏联中亚地区。一般在草原、戈壁荒漠、固定的沙丘以及黄土高原都能生长，在河岸冲积地区也见生长，对于海拔要求不高，海拔500到2000米都有分布，在潮湿的沙质土，流动沙丘边缘及河岸沙地上成片生长。是一种适应能力强的亚灌木植物。药用全草，夏秋采收，晒干备用。味辛性凉，有清热、利尿的功能。

已有文献报道，沙旋复花提取物具有一定的抑菌杀虫活性。屈秋耘等研究发现，沙旋复花在驱虫杀虫方面体现出很强的生物活性。它对大皱鳃金龟、蒙古丽金龟、八字白眉天蛾等三种害虫均显示出较高的毒杀效果，三种虫子死亡率在90％以上。张宏利等研究发现，沙旋复花提取物对粘虫的拒食和毒杀效果均大于80％，表明其对粘虫有较好拒食和毒杀效果。沙旋复花在宁夏盐池县被作为农田杂草处理。

林坤等研究沙旋复花乙醇提取物对小菜蛾的生物活性，研究过程中作者在室内测定了沙旋复花乙醇提取物对3龄小菜蛾幼虫的触杀、拒食、产卵忌避、胃毒、抑制生长发育5种生物活性作用。结果表明：沙旋复花乙醇提取物对小菜蛾3龄幼虫有很明显的触杀和拒食活性，校正死亡率和拒食率均随提取物浓度的升高而增大；乙醇提取物对小菜蛾也有胃毒、抑制 生长发育等活性。赵堂等也以小菜蛾为试虫，对沙旋复花不同部位乙醇提取物进行杀虫活性比较，筛选出活性最高部位，然后采用不同溶剂对其进行萃取分，得到不同溶剂萃取物后测试各萃取物对小菜蛾的触杀和拒食活性。结果表明，沙旋复花乙醇提取氯仿萃取物对小菜蛾的活性最好，且全草相较于其他各部位(花、叶、根、茎等)对小菜蛾的触杀和拒食活性最高。推断这应该是由于沙旋复花各部位所产生的协同效果，即全草中含有的杀虫活性成分较任一部位都高的缘故，各部位提取物在一起产生了增效作用。沙旋复花对小菜蛾拒食活性随着处理时间的增长，效果逐渐减弱，可能是沙旋复花中有拒食活性的成分易挥发或者小虫体内产生耐药性而导致活性持续期短。

在筛选抗肿瘤植物时，陈杰等发现沙旋复花中的乙醚部位对白血病P-388细胞具有较强的抑制作用。1994年，Bing-Nan Zhou等人从沙旋复花中分得两个新的倍半萜内酯15-去氧沙地旋复花内酯inulasalsolin和沙地旋复花内酯inulasalsolide，和两个已知的化合物eupatolide和budlein B，并发现15-去氧沙地旋复花内酯(inulasalsolin)和沙地旋复花内酯(inulasalsolide)对KB和P-388细胞株显示出强烈的的细胞毒理活性。国内学者近年来报道的沙旋复花的药理活性研究比较少，李玉平等报道发现沙旋复花具有很强的抑菌活性，对小麦赤霉、苹果炭疽、辣椒疫霉、玉米大斑等多种病原菌有100％的抑制率。

传统化学农药的长期使用带来了种种弊端，如有害生物抗药性的产生、残留毒性以及环境污染等等。社会的发展、公众的需要，促使人们在微生物学、植物化学等不同方面寻求对人类健康和生态环境安全的新型有害生物控制剂。本课题基于陕北丰富的防风固沙天然植物资源沙旋复花，拟初步研究出其活性部位，为研制开发出用于高效防治有害生物的植物源杀虫剂打下理论基础，必将充分体现出我国的现代特色农业科技发展的特色。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种沙旋复花中标准化提取物及其提取方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种沙旋复花中标准化提取物，该提取物包括如下成分：巴德莱茵.B：2.122mg/g；卵南美菊素：0.544mg/g；沙地旋复花内酯：1.101mg/g；15-去氧沙地旋复花内酯：0.855mg/g；4α，5β-环氧卵南美菊素：0.669mg/g；泽兰内酯：11.199mg/g；芹菜素：0.362mg/g；总量为16.852mg/g。

从沙旋复花中分离得到的一个新化合物的化学式为C₂₁H₃₂O₈，晶体颜色为白色，命名为eupatolide-II，结构中共有21个碳原子，包括3个季碳原子，11个叔碳原子CH，5个仲碳原子CH₂和2个伯碳CH₃；结构中有一个羰基信号δ178.36(C-12)，四个烯碳原子信号δ139.21(C-4)和δ136.18(C-1)，δ132.01(C-5)，δ128.04(C-10)，一个连氧异头碳信号δ103.13(C-1’)，且δ103.13，76.70，73.65，68.80，61.04，57.02为一组葡萄糖信号；5个仲碳原子，分别为δ67.82(C-13)，61.04(C-6’)，42.07(C-9)，38.59(C-3)和25.24(C-2)；11个叔碳原子除去糖环上的6个，剩下为δ132.01(C-5)，128.04(C-10)，57.02(C-4’)，48.54(C-7)和38.46(C-11)；两个季碳为δ16.45(C-15)，13.26(C-14)；异头碳信号δ103.13(C-1’)与氢信号δ4.12(H-1’)直接相连。

为解决上述问题，本发明还提供了一种沙旋复花中标准化提取物和新化合物的提取方法，包括如下步骤：

S1、取干燥沙旋复花全草10kg，粉碎后用6倍体积的90％乙醇水溶液室温冷浸三次，每次24h，过滤，浓缩滤液，得0.93kg黑棕色膏状物，并回收溶剂；

S2、将步骤S1所得的膏状物用适当的水分散后，依次用二氯甲烷，乙酸乙酯分别萃取三次，每个萃取部位再分别浓缩至浸膏，分别得到308.8g二氯甲烷萃取物，81.62g乙酸乙酯萃取物，297.0g水层部分；

S3、将补助S1所得的滤渣部分继续用水冷浸提取，三次，每次24h，浓缩至浸膏，得沙旋复花水提取物；

S4、将步骤S2所得的二氯甲烷层，用300g硅胶拌样，旋蒸干后上1kg硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱后，用甲醇冲洗，洗脱过程中根据TLC检测结果，合并相同部分洗脱液并浓缩，得到10g Fr.1，12g流分Fr.3，18g流分Fr.4，10g流分Fr.5，8g流分Fr.6，Fr.7；

S5、将上述所得的流分进行分离操作

S51、将步骤S4所得的流分Fr.2，经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，将其划分为4段Fr2-1-Fr2-4，将Fr2-3流分，经反复硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯和石油醚-丙酮系统梯度洗脱，反复重结晶得到化合物36mg IS-7，54mg IS-8，将Fr2-4经反复硅胶层析得到化合物15mg IS-9；

S52、将步骤S4所得的流分Fr.3，经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱过程TLC跟踪检测，合并相同组分得到3段Fr3-1-Fr3-3，将Fr3-3流分经反复硅胶柱层析，得到化合物6mg IS-1，100mg IS-5，24mg IS-14；

S53、将步骤S4所得的流分Fr.4，经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱过程TLC跟踪检测，合并相同组分得到4段Fr4-1-Fr4-4，将Fr4-2流分经反复硅胶柱层析，得到化合物18mg IS-2，10mg IS-4；将Fr4-3流分经反复硅胶柱层析，并结合MCI CHP-20P，得到化合物18mg IS-3，10mg IS-6，14mg IS-12；

S54、将步骤S4所得的流分Fr.5，经硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，洗脱过程TLC跟踪检测，合并相同组分得到5段Fr5-1-Fr5-5，将Fr5-1流分经反复硅胶柱层析，并结合Sephadex LH-20得到化合物18mg IS-10，10mg IS-17；将Fr5-3流分经反复硅胶柱层析，并结合MCI CHP-20P，得到化合物45mg IS-11，10mg IS-13；将Fr5-4流分经反复硅 胶柱层析，纯化得到化合物7mg IS-15；

S55、将步骤S4所得的流分Fr.6，经硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，洗脱过程TLC跟踪检测，合并相同组分得到3段Fr6-1-Fr6-3，将Fr6-3流分经反复硅胶柱层析，并结合MCI CHP-20P，得到化合物14mg IS-16。

其中，所述步骤S4中的硅胶为100-200目；步骤S5中硅胶为200-300目。

其中，所述步骤S4中石油醚-乙酸乙酯的梯度为200∶1-0∶1；所述步骤S51中石油醚-乙酸乙酯的梯度为100∶1-5∶1；步骤S52中石油醚-乙酸乙酯的梯度为60∶1-0∶1；步骤S53中石油醚-乙酸乙酯的梯度为40∶1-0∶1。

其中，所述步骤S55中二氟甲烷-甲醇的梯度为60∶1-1∶1

本发明具有以下有益效果：

从沙旋复花90％乙醇提取物的醋酸乙酯部位，经硅胶，MCI CHP-20P，Sephadex LH-20羟丙基葡聚糖凝胶等各种柱层析色谱分离方法，并结合TLC跟踪检测以及HPLC纯度分析，从其中分离得到17个化合物，综合运用核磁共振光谱(¹³C-NMR、¹H-NMR、¹H-¹H>

附图说明

图1为本发明实施例中一种沙旋复花中标准化提取物的分子结构图。

图2为本发明实施例中一种沙旋复花中标准化提取物的提取流程图。

图3为本发明实施例中一种沙旋复花中标准化提取物的高效液相色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1所示，本发明实施例提供了一种沙旋复花中标准化提取物，该提取物包括如下成分：巴德莱茵.B：2.122mg/g；卵南美菊素：0.544mg/g；沙地旋复花内酯：1.101mg/g；15-去氧沙地旋复花内酯：0.855mg/g；4α，5β-环氧卵南美菊素：0.669mg/g；泽兰内酯：11.199mg/g；芹菜素：0.362mg/g；总量为16.852mg/g。从沙旋复花中分离得到的一个新化合物的化学式为C₂₁H₃₂O₈，晶体颜色为白色，分子量412.47。

其H谱和C谱数据如下表所示。

表1沙旋复花中标准化提取物的H谱和C谱(DMSO-d₆)

如图2所示，上述的提取物通过以下方法制备：

S1、取干燥沙旋复花全草10kg，粉碎后用6倍体积的90％乙醇水溶液室温冷浸三次，每次24h，过滤，浓缩滤液，得0.93kg黑棕色膏状物，并回收溶剂；

S2、将步骤S1所得的膏状物用适当的水分散后，依次用二氯甲烷，乙酸乙酯分别萃取三次，每个萃取部位再分别浓缩至浸膏，分别得到308.8g二氯甲烷萃取物，81.62g乙酸乙酯萃取物，297.0g水层部分；

S3、将补助S1所得的滤渣部分继续用水冷浸提取，三次，每次24h，浓缩至浸膏，得沙旋复花水提取物；

S4、将步骤S2所得的二氯甲烷层，用300g硅胶(100-200目)拌样，旋蒸干后上1kg硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯(200∶1-0∶1)梯度洗脱后，用甲醇冲洗，洗脱过程中根据TLC检测结果，合并相同部分洗脱液并浓缩，得到10g Fr.1，12g流分Fr.3，18g流分Fr.4，10g流分Fr.5，8g流分Fr.6，Fr.7；

S5、将步骤S4所得的流分Fr.2，经硅胶(200-300目)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100∶1-5∶1)梯度洗脱，将其划分为4段Fr2-1-Fr2-4。其中Fr2-3流分，经反复硅胶柱层析(200-300目)，石油醚-乙酸乙酯和 石油醚-丙酮系统梯度洗脱，反复重结晶得到化合物36mg IS-7，54mg IS-8，将Fr2-4(220mg)经反复硅胶层析得到化合物15mg IS-9；

将步骤S4所得的流分Fr.3，经硅胶(200-300目)柱层析，石油醚-乙酸乙酯(60∶1-0∶1)梯度洗脱，洗脱过程TLC跟踪检测，合并相同组分得到3段Fr3-1-Fr3-3，将Fr3-3流分经反复硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯系统、二氯甲烷-甲醇梯度洗脱)，得到化合物6mg IS-1，100mg IS-5，24mg IS-14；

将步骤S4所得的流分Fr.4，经硅胶(200-300目)柱层析，石油醚-乙酸乙酯(40∶1-0∶1)梯度洗脱，洗脱过程TLC跟踪检测，合并相同组分得到4段Fr4-1-Fr4-4，将Fr4-2流分经反复硅胶柱层析(二氯甲烷-甲醇梯度洗脱)，得到化合物18mg IS-2，10mg IS-4；将Fr4-3流分经反复硅胶柱层析(二氯甲烷-甲醇梯度洗脱)，并结合MCI CHP-20P(甲醇-水)，得到化合物18mg IS-3，10mg IS-6，14mg IS-12；

将步骤S4所得的流分Fr.5，经硅胶(200-300目)柱层析，二氯甲烷-甲醇(60∶1-1∶1)梯度洗脱，洗脱过程TLC跟踪检测，合并相同组分得到5段Fr5-1-Fr5-5，将Fr5-1流分经反复硅胶柱层析(二氯甲烷-甲醇梯度洗脱)，并结合Sephadex LH-20(甲醇-水)得到化合物18mg IS-10，10mg IS-17；将Fr5-3流分经反复硅胶柱层析(二氯甲烷-甲醇梯度洗脱)，并结合MCI CHP-20P(甲醇-水)，得到化合物45mg IS-11，10mg IS-13；将Fr5-4流分经反复硅胶柱层析(二氯甲烷-甲醇梯度洗脱)，纯化得到化合物7mg IS-15；

将步骤S4所得的流分Fr.6，经硅胶(200-300目)柱层析，二氯甲烷-甲醇(60∶1-1∶1)梯度洗脱，洗脱过程TLC跟踪检测，合并相同组分得到3段Fr6-1-Fr6-3，将Fr6-3流分经反复硅胶柱层析(二氯甲烷-甲醇梯度洗脱)，并结合MCI CHP-20P(甲醇-水)，得到化合物14mg IS-16。

上述沙旋复花提取物的分析方法，包括以下步骤：

步骤一、标准溶液的制备

用电子天平准确称取上述7个化合物1.0mg标准品(精确至0.001g)，用0.2mL甲醇溶解，并定容至1.0mL容量瓶中，冷冻保存。分别取10μL、40μL、80μL、150μL、200μL上述标准溶液至1.0mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀后配制成浓度为10mg/L、40mg/L、80mg/L、150mg/L、200mg/L的系列标准溶液。4℃下保存待用。

步骤二、HPLC方法

表2 HPLC分析方法

色谱柱：Phenomenex Luna C-18(250mm×4.6mm 5um)

柱温：20℃

流动相：A(水)-C(乙腈)

流速：1mL/min

检测波长：210nm

步骤三、线性关系考查

用高效液相色谱仪分析表2中所配制的各化合物的系列标准溶液，进样量6μL，分别记录各标准液的峰面积。绘制标准曲线时，以标准溶液浓度为横坐标，以其相应峰面积为纵坐标，标准曲线及其各参数见表3。结果表明，各化合物浓度在10-200mg/L范围内时峰面积与浓度呈良好的线性关系，R²值均大于0.999。

表3 7个化合物标准曲线

供试品溶液的制备

准确称取两种沙旋复花样品各10.0g，加入40mL90％乙醇，70°超声提取两次，每次2h，合并滤液后真空浓缩定容至10mL，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后4℃下保存待用。

样品中各化合物含量测定

精密吸取60μL供试品溶液，用高效液相色谱仪进行测定。对比保留时间以及紫外图谱，确定各单体化合物在供试品溶液中的出峰位置。并记录提取物中各化合物的峰面积，利用标准曲线法计算各化合物在总的植物提取物中的含量，平行测定三次。计算结果见表4。

表4沙旋复花中各化合物含量

^b提取率＝提取液中的固体含量/样品量.

化合物提取物对黄曲条跳甲的驱避和拒食效果研究

在同一个培养皿里放2片叶(未受害的，面积一样均为20平方厘米)，一 片处理、一片对照。然后放入10头黄曲条跳甲，24小时后调查处理和对照上面的虫口数，根据差异得到驱避效果；调查两者的受害面积，得到忌食效果。把菜叶直接浸在药液里然后马上取出来，药液干后放入试虫。每种药剂做3个重复。结果表明这12个样品没有体现出明显的拒食或者杀虫活性。

表5沙旋复花提取物及单体化合物对黄曲条跳甲的驱避和拒食效果选择性实验研究

非选择性实验

把处理和对照叶片(面积为20平方厘米)分别单独放在2个培养皿里，其它步骤同选择性实验一样，放的虫量是选择性实验的一半，5头。非选择性实验结果表明，化合物4对黄曲条跳甲具有趋避活性，趋避率达到69.99％。而化合物1和5具有拒食活性，拒食率分别为47.06％和65.22％。

化合物4：IS-4(1-Cyclodecene-2，5，6，9-tetrol，1，8-dimethyl-7-(1-methylethyl)-，[(2α，5β，6α，7α，8β，9α)])

化合物1：IS-10(新化合物，eupatolide-II)

化合物5：IS-5(去氧沙地旋复花内酯)

表6沙旋复花提取物及单体化合物对黄曲条跳甲的驱避和拒食效果非选择性实验研究

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明权利要求所限定的范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。本实验研究表明，沙旋复花中的倍半萜类化合物是其具有杀虫活性的基础，尤其是化合物4(1-Cyclodecene-2，5，6，9-tetrol，1，8-dimethyl-7-(1-methylethyl)-，[(2α，5β，6α，7α，8β，9α)])、化合物1(eupatolide-II)、化合物5(去氧沙地旋复花内酯)等对害虫黄曲条跳甲具有明显的趋避及拒食活性，且标准化的提取物的杀虫活性也是基于此。另外，本发明对于化合物活性研究部分，选择的是害虫黄曲条跳甲，但前述背景技术里引用文献可知，沙旋复花中标准化提取物对于其他类的农田害虫例如粘虫、小菜蛾等，也具有同等的趋避以及拒食作用。对于沙旋复花中的倍半萜内酯类化合物所具有的其他广泛生物活性，例如抗菌抗炎、抗肿瘤等活性，也将落入本发明的保护范围内。