与早产发生相关的MMP-8基因多态性及其检测方法

摘要

本发明公开了与早产发生相关的MMP‑8基因多态性及其检测方法。本发明提供了检测新生儿基因组中MMP‑8基因rs11225395位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定新生儿是否为自发性早产儿中的应用。本发明研究了基因MMP‑8的多态性位点(rs11225395)与早产易感性的相关性，判明T等位型和TT基因型与发生SPTB的风险降低相关，是发生SPTB的保护性基因型。与之相对应的C等位基因及CT和CC基因型的个体对早产有更高的易感性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及与早产发生相关的MMP-8基因多态性及其检测方法。

背景技术

早产(Preterm Birth，PTB)是导致新生儿发病和死亡的重要原因，同时也是导致婴幼儿发生诸如脑瘫、发育迟缓、早产儿视网膜病变、慢性肺部疾病以及听觉和视觉障碍等并发症和后遗症的重要因素。75％的新生儿发病和死亡与早产有关。每年在全球约有1500万的早产儿，而且这个数字在不断上升。据世界卫生组织发布数据显示，2011年我国早产儿的发病率为7.8％，有近110万的早产儿出生，出生数量仅次于印度。早产已成为一个世界性的卫生问题。已有的流行病学研究表明早产有明显的家族聚集现象。而且早产的发病率具有种族和民族差异，在非洲裔的美国人群中早产的发病率是欧洲白种人的两倍。上述研究表明遗传因素在自发性早产发病中起重要作用。因此，鉴定早产的易感基因有助于预测早产发生的个体风险和群体风险，且有助于阐明与此疾病相关的发病机制。

金属蛋白酶8(MMP-8)又称为胶原酶2或嗜中性粒细胞胶原酶，是MMPs家族中的一员。它可由中性粒细胞表达，也可由其它类型的细胞产生，比如：纤维母细胞、平滑肌细胞、角膜上皮细胞、内皮细胞、软骨细胞和绒毛膜滋养层细胞。MMPs属于蛋白水解酶家族，这种锌依赖性蛋白酶可降解组成ECM的一种或多种胶原或非胶原成分，使胎膜的机械强度降低、宫颈扩张，还可活化多种细胞因子和抗菌多肽。因此，在炎症、宫内感染、PPROM和PTB的发病机制中发挥决定性的作用。有研究显示：当发生宫内感染、PPROM和PTB时，羊水和胎膜中MMP-8和MMP-9的浓度显著升高。因此,MMP-8基因是研究早产易感性很好的候选基因。

MMP-8基因位于11q22.2-22.3，包含12个外显子，MMP-8基因的C-799T多态性位点位于启动子上，上游200bp有一个P53的结合位点，其多态性可以影响启动子的转录活性，从而影响疾病的发生和转归。关于嗜中性粒细胞胶原酶MMP-8的生物学功能的研究提示，内源性MMP-8导致的胎膜ECM的降解是SPTB和PPROM的发病机制之一，MMP-8表达水平的升高通常伴随着SPTB和PPROM患病风险的增加。所以，能够影响细胞因子表达的SNPs就可以影响SPTB和PPROM的遗传易感性。2004年，Wang Hong yan等，选取了位于MMP-8基因启动子上的三个SNPs位点(C-799T、A-381G和C+17G)，以非洲裔美国人的新生儿为研究对象，进行病例(168名PPROM新生儿)-对照(216名足月新生儿)研究。首先，他们分别单独分析了三个位点的等位基因在病例组和对照组之间的分布频率，发现MMP-8基因三个位点的次要等位基因(-799T/-381G/+17G)在病例组的分布频率要低于对照组，主要等位基因(-799C/-381A/+17C)在病例组的分布频率要高于对照组。然后，分别单独研究了这3个SNPs位点与PPROM的遗传易感性之间的关联性，结果显示它们与PPROM的患病风险无显著的遗传学关联。接下来用这三个SNPs构建单体型，研究等位基因的功能，发现在类绒毛膜滋养层细胞(BeWo,HTR-8/Svneo和JEG-3)中，由次要等位基因构成的启动子片段的转录活性是主要等位基因构成的启动子片段以及其它由1到2个次要等位基因构成的启动子片段的2-3倍。电泳迁移率实验结果也显示：在BeWo细胞中，MMP-8基因的C-799T和A-381G多态性位点与核蛋白和寡核苷酸的绑定方面有所不同，提示这2个SNPs的次要等位基因对转录抑制因子的亲和力较低，与转录抑制因子的绑定减少，从而具有更高的转录活性。最后，进一步通过病例—对照研究来探讨由上述3个SNPs的次要等位基因构建的单体型与PPROM的遗传易感性之间的关联性，研究结果验证了上述功能实验的结果，说明携带-799T/-381G/+17G单体型的个体发生PPROM的风险显著升高(OR 4.63；P＜0.0001)，而-799C/-381A/+17C单体型可显著降低PPROM的患病风险，是保护性单体型(OR 0.52；P＜0.0002)。也就是说，次要等位基因单体型的携带者，体内MMP-8基因启动子片段的转录活性最高，表达的MMP-8最多，因而，也最易发生PPROM。

发明内容

本发明一个目的是提供检测胎儿基因组中MMP-8基因rs11225395位点的多态性或等位基因或基因型的物质的用途。

本发明提供的检测胎儿基因组中MMP-8基因rs11225395位点的多态性或等位基因或基因型的物质在预测或辅助预测待测胎儿为早产易发个体概率性状中的应用；

或本发明提供的或检测胎儿基因组中MMP-8基因rs11225395位点的多态性或等位基因或基因型的物质在制备预测或辅助预测待测胎儿为早产易发个体概率性状产品中的应用。

本发明另一个目的是提供检测胎儿基因组中MMP-8基因rs11225395位点的多态性或等位基因或基因型的物质的用途。

本发明提供了检测胎儿基因组中MMP-8基因rs11225395位点的多态性或等位基因或基因型的物质在评估或辅助评估待测胎儿发生自发性早产的风险性状中的应用；

或本发明提供了检测胎儿基因组中MMP-8基因rs11225395位点的多态性或等位基因或基因型的物质在制备评估或辅助评估待测胎儿发生自发性早产的风险性状产品中的应用。

本发明第三个目的是提供检测新生儿基因组中MMP-8基因rs11225395位点的多态性或等位基因或基因型的物质的用途。

本发明提供的检测新生儿基因组中MMP-8基因rs11225395位点的多态性或等位基因或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定新生儿为自发性早产儿概率性状中的应用；

或本发明提供的检测新生儿基因组中MMP-8基因rs11225395位点的多态性或等位基因或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定新生儿为自发性早产儿概率性状产品中的应用。

上述应用中，所述rs11225395位点的基因型为CC或CT或TT；

所述rs11225395位点的等位基因为C或T；所述rs11225395位点位于人基因组第第11号染色体的MMP-8基因的5‘侧翼序列的启动子区第-799位。

和/或，所述MMP-8基因的核苷酸序列具体为序列1。

本发明第四个目的是提供一种预测或辅助预测待测胎儿为早产易发个体概率性状的方法。

本发明提供的方法，为如下A或B，

A包括如下步骤：检测待测胎儿的MMP-8基因的rs11225395位点的基因型是CC、CT或TT，CC基因型的待测胎儿为早产易发个体概率大于或候选大于CT基因型的待测胎儿或TT基因型的待测胎儿；

B包括如下步骤：检测待测胎儿的MMP-8基因的rs11225395位点的等位基因为C还是T，C等位基因的待测胎儿为早产易发个体概率大于或候选大于T等位基因的待测胎儿。

本发明第五个目的是提供一种评估或辅助评估待测胎儿发生自发性早产的风险性状的方法。

本发明提供的方法，为A或B，

A包括如下步骤：检测待测胎儿的MMP-8基因的rs11225395位点的基因型是CC、CT或TT，CC基因型待测胎儿发生自发性早产的风险性大于或候选大于CT基因型待测胎儿或TT基因型待测胎儿；

B包括如下步骤：检测待测胎儿的MMP-8基因的rs11225395位点的等位基因为C或T，C等位基因的待测胎儿发生自发性早产的风险性大于或候选大于T等位基因的待测胎儿。

本发明第6个目的是提供一种定或辅助鉴定新生儿为自发性早产儿概率性状的方法。

本发明提供的方法，为如下A或B，

A包括如下步骤：检测待测新生儿基因组中MMP-8基因rs11225395位点的基因型是CC、CT或TT，CC基因型的待测新生儿为自发性早产儿概率大于或候选大于CT基因型的待测新生儿或TT基因型的待测新生儿；

B包括如下步骤：检测待测新生儿基因组中MMP-8基因rs11225395位点的等位基因为C或T，C等位基因的待测新生儿为自发性早产儿概率大于或候选大于T等位基因的待测新生儿。

上述方法中，所述检测各样本基因型包括如下步骤：

A、用序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA分子组成的引物对对各样本基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

B、以序列3所示的单链DNA分子对所述PCR扩增产物进行单碱基延伸，得到延伸产物；

C、质谱检测所述延伸产物中的rs11225395位点的基因型或等位基因。

本发明第5个目的是提供产品A或B或C。

本发明提供的产品A或B或C，包括检测新生儿基因组中MMP-8基因rs11225395位点的多态性或等位基因或基因型的物质；

A、鉴定或辅助鉴定新生儿为自发性早产儿概率性状的产品；

B、预测或辅助预测胎儿为早产易发个体概率性状产品；

C、评估或辅助评估待测胎儿发生自发性早产的风险性状。

上述产品中，所述检测新生儿基因组中MMP-8基因rs11225395位点的多态性或基因型的物质具体包括序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA分子组成的引物对和序列3所示的单链DNA。

和/或，所述产品还包括如下1)-6)至少一种条件的可读载体：

1)MMP-8基因的rs11225395位点的基因型是CC基因型的待测胎儿为早产易发个体概率大于或候选大于CT基因型的待测胎儿或TT基因型的待测胎儿；

2)MMP-8基因的rs11225395位点的等位基因为C等位基因的待测胎儿为早产易发个体概率大于或候选大于T等位基因的待测胎儿；

3)MMP-8基因的rs11225395位点的基因型是CC基因型待测胎儿发生自发性早产的风险性大于或候选大于CT基因型待测胎儿或TT基因型待测胎儿；

4)MMP-8基因的rs11225395位点的基因型是C等位基因的待测胎儿发生自发性早产的风险性大于或候选大于T等位基因的待测胎儿；

5)MMP-8基因rs11225395位点的基因型为CC基因型的待测新生儿为自发性早产儿概率大于或候选大于CT基因型的待测新生儿或TT基因型的待测新生儿；

6)MMP-8基因rs11225395位点的等位基因为C等位基因的待测新生儿为自发性早产儿概率大于或候选大于T等位基因的待测新生儿；

和/或，所述产品具体为试剂盒。

上述的应用或上述的产品中，胎儿或新生儿为中国人。

本发明的实验证明，本发明研究了基因MMP-8的多态性位点C-799T(rs11225395)与早产易感性的相关性。通过基于医院的病例对照研究，进行了大量的临床和实验室实验和大样本的统计分析，判明MMP-8基因的C-799T多态性位点的T等位基因与发生SPTB的风险降低相关，是发生SPTB的保护性等位基因，且具有剂量效应；T等位型和TT基因型与发生SPTB的风险降低相关，是发生SPTB的保护性基因型。与之相对应的C等位基因及CT和CC基因型的个体对早产有更高的易感性。因此本发明鉴定了早产发生的一种新的易感基因和基因型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、检测MMP-8基因的rs11225395位点基因型

一、检测MMP-8基因的rs11225395位点基因型的相关引物的设计合成

使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物，并交由生物公司合成。检测MMP-8基因的rs11225395位点(MMP-8基因的5‘侧翼序列的启动子区第799位，NG_012101.1:g.4206T>C；MMP-8基因的核苷酸序列为序列1，该位点在该序列第第1206位；)基因型的特异性引物对的序列为：正向引物5’-ACGTTGGATGAGAGCTGCTGCTCCACTATG-3’(序列表中的序列1)；反向引物5’-ACGTTGGATGGTTTAGAGAGACTGAGCTGG-3’(序列表中的序列2)。用于单碱基扩增反应的延伸引物序列为5’-AGACTACCATGCAGAGC-3’(序列表中的序列3)。

二、单碱基延伸反应检测MMP-8基因的rs11225395位点基因型

1、基因组DNA的提取

提取待测样品基因组DNA。

2、单碱基延伸反应

1)PCR扩增

PCR扩增在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5μL，按表1配制PCR反应体系。

表1 每个PCR反应体系的组分

取出上述1制备好的基因组DNA样品，调整加样体积为1ul，每个5ulPCR反应体系中包含模板DNA20-50ng，Hotstar Tag 0.5U，每条扩增引物0.5pmol，0.1ul的25mM dNTPs。

PCR反应程序为：94℃ 4分钟；94℃ 20秒，56℃ 30秒，72℃ 1分钟，45个循环；72℃ 3分钟；4℃保持。

得到PCR产物。

2)、PCR产物碱性磷酸酶处理：

在PCR反应结束后，将上述1)得到的PCR产物用SAP(shrimp alkalinephosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs，按表2配制SAP反应体系。

表2 SAP反应体系

试剂体积(μL)超纯水1.5310×SAP缓冲液0.17SAP酶(1.7U/ul)0.3PCR产物5总体积7

反应条件为：37℃40分钟；85℃5分钟；4℃维持。

得到碱性磷酸酶处理后产物。

3)单碱基延伸

在碱性磷酸酶处理结束后进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μL，按表3配制单碱基延伸反应体系。

表3 单碱基延伸反应体系

反应条件为：

I.94℃ 30秒

II.94℃ 5秒

III.52℃ 5秒

IV.80℃ 5秒

V.回到III，4次循环

VI.回到II，39次循环

VII.72℃ 3分钟

VII.4℃

得到单碱基延伸产物。

3、树脂纯化

将Clean Resin树脂(美国Sequenom公司)平铺到6mg的树脂板中；加16μl水到上述2得到的单碱基延伸产物的对应孔内；将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟,使树脂与反应物充分接触；离心使树脂沉入孔底部，得到树脂纯化后的延伸产物。

4、质谱检测

启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪(SEQUENOM公司)，将上述3得到的树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片(SEQUENOM公司)上。将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF分析，检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果。可以看出，MMP-8基因的rs11225395位点的基因型为CC或TT或CT。

实施例2、MMP-8基因的多态位点rs11225395基因型与早产易感性的研究

按照实施例1的二的方法对如下研究对象进行检测：

1、基因组DNA的提取

提取中国汉族人群(728例早产儿，662例足月儿)离体血清样本的基因组DNA。

上述离体血清来自北京军区总医院附属八一儿童医院2009年2月至2011年5月和2014年3月至2014年9月收治的新生儿。所有的个体均是居住于北京市及周边地区的血缘上无关的中国汉族人。

病例组为自发性早产儿，按照出生时孕周分为3组：中早产(33-36孕周，479例)；极早产(<32孕周，187例)；超早产(<28孕周，61例)；

正常对照组是随机选取的没有胎膜早破和早产史的孕母生产的单胎673例足月儿。

新生儿选择标准为排除患有胎儿畸形、外伤、多脏器疾病、子痫前期、宫内生长迟缓、胎儿危象、分娩前出血或者其他临床疾病导致的早产等疾病的新生儿。每个参与者的监护人均签署知情同意书，本研究得到中国人民解放军北京军区总医院医学伦理委员会的批准。

2、单碱基延伸反应

按照实施例1的二的方法检测上述1获得的每个离体血清样本中rs11225395基因型。

病例组和对照组基因型分布均符合哈-温遗传平衡定律(P＞0.05)，具有良好的群体代表性。

结果如表4所示，在所有样本中，与对照组比较，T等位基因在病例组的分布频率要显著低于对照组(χ2＝6.64，P＝0.01，df＝1)，病例组和对照组之间CC、CT、TT基因型的分布频率有显著性差异(χ2＝6.63，P＝0.034，df＝2)。通过Logistic回归分析校正母亲年龄和胎儿性别后，我们分析共显性(CT vs.CC；TT vs.CC)遗传模式，相对于CC基因型，TT基因型与发生SPTB的风险降低相关(OR 0.65；95％CI，0.47-0.92；P＝0.015)；分析显性(CT+TT vs.CC)遗传模式，发现相对于CC基因型来说，T等位型(CT+TT基因型)与发生SPTB的风险降低相关(OR 0.79；95％CI，0.63-0.9；P＝0.027)；分析隐性(TT vs.CC+CT)遗传模式，发现相对于C等位型(CC+CT基因型)，TT基因型与SPTB的风险降低相关(OR 0.72；95％CI，0.53-0.99；P＝0.044)；分析超显性(CT vs.CC+TT)遗传模式，发现相对于CC+TT联合基因型，CT基因型与SPTB的遗传易感性不相关(OR 0.91；95％CI，0.74-1.13；P＝0.41)。用加性模式进行T等位剂量分析，发现T等位基因递增与SPTB的风险降低相关(OR 0.81；95％CI，0.70–0.95；P＝0.10)，说明MMP-8基因的rs11225395多态性位点的T等位基因与发生SPTB的风险降低相关，是发生SPTB的保护性等位基因，且具有剂量效应；T等位型和TT基因型与发生SPTB的风险降低相关，是发生SPTB的保护性基因型。

表4 为病例组和对照组MMP-8基因的rs11225395多态性位点的基因型和等位基因频率

注：OR：比值比CI：置信区间NA：未计算

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上述结果表明，MMP-8基因的rs11225395位点的基因型或等位基因与早产发生相关，可以用来鉴定或辅助鉴定待测新生儿为自发性早产儿概率性状；也可以预测或辅助预测待测胎儿为早产易发个体概率性状；也可以评估或辅助评估待测胎儿发生自发性早产的风险；

上述鉴定或辅助鉴定待测新生儿为自发性早产儿概率性状的方法包括如下步骤：检测待测新生儿的MMP-8基因的rs11225395位点的基因型是CC、CT或TT，CC基因型的待测新生儿为自发性早产儿概率大于或候选大于CT基因型的待测新生儿或TT基因型的待测新生儿。

或，上述鉴定或辅助鉴定待测新生儿为自发性早产儿概率性状的方法包括如下步骤：检测待测新生儿的MMP-8基因的rs11225395位点的等位基因为C还是T，C等位基因的待测新生儿为自发性早产儿概率大于或候选大于T等位基因的待测新生儿。

上述预测或辅助预测待测胎儿为早产易发个体概率性状的方法包括如下步骤：检测待测胎儿的MMP-8基因的rs11225395位点的基因型是CC、CT或TT，CC基因型的待测胎儿为早产易发个体概率大于或候选大于CT基因型的待测新生儿或TT基因型的待测胎儿。

或上述预测或辅助预测待测胎儿为早产易发个体概率性状的方法包括如下步骤：检测待测胎儿的MMP-8基因的rs11225395位点的等位基因为C还是T，C等位基因的待测胎儿为早产易发个体概率大于或候选大于T等位基因的待测胎儿。

上述评估或辅助评估待测胎儿发生自发性早产的风险性状的方法包括如下步骤：检测待测胎儿的MMP-8基因的rs11225395位点的基因型是CC、CT或TT，CC基因型的待测胎儿发生自发性早产风险性大于或候选大于CT基因型的待测胎儿或TT基因型的待测胎儿。

或上述评估或辅助评估待测胎儿发生自发性早产的风险性状的方法包括如下步骤：检测待测胎儿的MMP-8基因的rs11225395位点的等位基因为C还是T，C等位基因的待测胎儿发生自发性早产的风险性大于或候选大于T等位基因的待测胎儿。

在检测胎儿时，可以取胎儿的脐带血或所处羊水提取基因组DNA。