鉴定大鸨亲缘关系的成套引物与方法

摘要

本发明公开了鉴定大鸨亲缘关系的成套引物与方法。本发明公开的成套引物，由成套引物甲和能扩增大鸨线粒体DNA片段的引物对组成；大鸨线粒体DNA片段的序列为如下A1)、A2)或A3)：A1)序列表中序列23的核苷酸序列；A2)与A1)限定的DNA序列具有90％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列；A3)在严格条件下与A1)限定的DNA序列杂交的由A1)衍生的DNA序列；成套引物甲由序列表中序列3‑序列22所示的20条单链DNA组成。实验证明，本发明的成套引物与方法可以用来鉴定大鸨间的亲缘关系，为大鸨人工繁育和重引入过程中种源的选定、配对方案的制定、系谱的构建提供技术支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中鉴定大鸨亲缘关系的成套引物与方法。

背景技术

大鸨(Otis tarda)隶属鹤形目鸨科，是国际上高度关注的鸟类，而且是中国草原地带的旗舰物种和草原生态系统的指示物种。大鸨有两个地理亚种，即指名亚种(O.t.tarda)和东方亚种(O.t.dybowskii)(Palacín&Alonso,2008)，目前全世界大鸨指名亚种数量约为45000-51000只，而东方亚种却不足1000只，其中逾一半以上片段化分布于中国东北部，并在中国境内完成生活史的各阶段。非法猎捕、栖息地干扰和过度放牧等因素，导致中国大鸨东方亚种的分布区退缩和种群数量锐减。人工繁育是大鸨迁地保护的有效途径之一，但近亲繁殖影响了大鸨的种群健康，甚至会引发近交衰退。繁育过程中如何对大鸨个体择优配对以避免近亲繁殖，以及最大限度保持其遗传多样性，是繁育部门最为关心也亟待解决的问题。通过分子生物学技术，对大鸨个体进行遗传变异检测，并做亲缘关系分析和亲权鉴定能为大鸨的配对筛选和系谱建立提供技术支持，但相关研究尚未见报道。

对于具有复杂交配系统的濒危动物，依靠外形特征或行为学观察确定配种个体或鉴定亲子关系，存在较大误差。基于这样的误差登记的系谱记录，将会使误差随着繁殖代数的增加呈几何级数增大。线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是细胞核外、线粒体内的遗传物质，具有母系遗传的特征，即子代的线粒体DNA序列与母代的相同，而父代则对线粒体DNA的遗传不作贡献。微卫星DNA为核基因组中的短串联重复序列，为共显性遗传，被广泛应用于评价种群遗传多样性、分析个体间亲缘关系以及鉴定亲子关系。子代的微卫星等位基因一半来自于父代，一半来自于母代。线粒体DNA适用于排除母子关系，经济简便，而微卫星DNA能够确定父源关系，有效可靠。将这2种分子标记结合起来运用于亲子鉴定，有助于制定科学的配种方案、确定不明确的偷配或乱配行为，对于保护濒危动物遗传资源具有极大的理论和实践意义。

大鸨性情机警，应激性强。传统采血对其损伤较大甚至致死，且对于野生大鸨，采集血样有困难。粪便和/或羽毛等非损伤性样品在许多濒危动物中已被用于亲缘关系分析，但由于所用的分子标记具有物种特异性，且传统PCR方法费时费力，不及多重PCR方法经济高效，因此，目前急需一种利用非损伤性取样对大鸨进行亲缘关系分析和亲权鉴定的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何对大鸨进行亲缘关系分析和亲权鉴定。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的成套引物。

本发明所提供的鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的成套引物，其名称为成套引物甲，是成套引物1和/或成套引物2；

所述成套引物1由序列表中序列3-序列12所示的10条单链DNA组成；所述成套引物2由序列表中序列13-序列22所示的10条单链DNA组成。

其中，序列3和序列4所示的单链DNA组成一个引物对，序列5和序列6所示的单链DNA组成一个引物对，序列7和序列8所示的单链DNA组成一个引物对，序列9和序列10所示的单链DNA组成一个引物对，序列11和序列12所示的单链DNA组成一个引物对，序列13和序列14所示的单链DNA组成一个引物对，序列15和序列16所示的单链DNA组成一个引物对，序列17和序列18所示的单链DNA组成一个引物对，序列19和序列20所示的单链DNA组成一个引物对，序列21和序列22所示的单链DNA组成一个引物对。

上述成套引物甲中，各单链DNA均可独立包装。各单链DNA的摩尔比可依据待测样本确定。各单链DNA的摩尔比可相同。

上述成套引物甲中，各单链DNA的5’端均可被HEX、FAM或TET等荧光基团标记。在本发明的实施例中，序列3、17和19所示的三条单链DNA的5’端均由HEX标记，序列5、9、11、13、15和21所示的各单链DNA的5’端均由FAM标记，序列7所示的单链DNA的5’端均由TET标记。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的成套引物。

本发明所提供的鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的成套引物，其名称为成套引物乙，由能扩增下述a1)、a2)或a3)的引物对与所述成套引物甲组成；

a1)大鸨线粒体DNA片段；

a2)a1)的任一片段；

a3)含有a1)的DNA片段；

所述大鸨线粒体DNA片段的序列为如下A1)、A2)或A3)：

A1)序列表中序列23的核苷酸序列；

A2)与A1)限定的DNA序列具有90％或90％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列；

A3)在严格条件下与A1)限定的DNA序列杂交的由A1)衍生的DNA序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列23的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件(如MEGA 5.0)，两个或多 个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述成套引物乙中，A2)所述序列具体可为序列表中序列24-序列28中任一序列。

上述成套引物乙中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述90％或90％以上同一性，可为90％或95％以上的同一性。

上述成套引物乙中，所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成。在本发明的一个实施例中，利用所述引物对对大鸨基因组DNA进行扩增，其PCR产物序列为序列24-序列28，该序列为线粒体DNA控制区dloop片段序列。

上述成套引物乙中，各单链DNA均可独立包装。所述成套引物甲与所述引物对的摩尔比可依据待测样本确定。所述成套引物甲与所述引物对中的各单链DNA的摩尔数均可相同。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定两个或两个以上大鸨是否具有母源关系的引物对。

本发明所提供的鉴定两个或两个以上大鸨是否具有母源关系的引物对，为能扩增上述a1)、a2)或a3)的引物对。

所述引物对的两条单链DNA可独立包装。所述引物对的两条单链DNA的摩尔比可为1:1。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的系统。

本发明所提供的鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的系统，包括X1；所述X1为所述成套引物甲、所述成套引物乙或所述引物对。

所述系统可由所述X1与X2组成；所述X2为进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器。进行PCR扩增所需的试剂可为北京博迈德基因技术有限公司的Biomed 2×Taq PCR MasterMix。进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。

所述系统还可由所述X1、所述X2与X3组成；所述X3为进行数据分析所需要的仪器和/或软件和/或模块。进行数据分析所需要的仪器具体可为测序仪(如ABI Prism377测序仪)和/或DNA序列分析仪(如ABI-3730xl型DNA序列分析仪)。进行数据分析所需要的软件具体可为序列比对软件和/或微卫星等位基因分析软件(如Genemarker软件)和/或亲缘关系分析软件(如MEGA系列软件或ML-Relate软件)和/或亲权关系分析软件(如CERVUS 2.0)。

上述系统还可为鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的试剂或试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的方法。

本发明所提供的鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的方法，将其命名为方法1，包括：利用所述成套引物甲分别对两个或两个以上待鉴定大鸨的基因组DNA进行PCR扩增，根据PCR扩增产物确定所述待鉴定大鸨间的亲缘关系。

上述方法1中，在利用所述成套引物甲进行PCR扩增时可采用单重PCR进行扩增，也可采用多重PCR进行扩增。在采用多重PCR进行扩增时可采用两个多重PCR扩增体系进行，其中一个多重PCR扩增体系含有序列3-12所示的10条单链DNA(即所述成套引物1)，另一个多重PCR扩增体系中可含有序列13-22所示10条单链DNA(即所述成套引物2)。无论进行单重PCR扩增还是多重PCR扩增，扩增体系中各单链DNA在扩增体系中的浓度均可为如下浓度：0.16μM。

在采用两个多重PCR扩增体系进行PCR扩增时，其中的一个多重PCR扩增体系可为：Biomed Taq DNA Master Mix 12.5μl，所述成套引物1(所述成套引物1的各引物在该反应体系中的浓度均可为0.16μM)，待测大鸨基因组DNA 2μl，BSA水溶液(BSA的浓度为20mg/ml)0.1μl，补充去离子水至25μl。另一个多重PCR扩增体系可为：Biomed Taq DNA Master Mix 12.5μl，所述成套引物2(所述成套引物2的各引物在该反应体系中的浓度均可为0.16μM)，大鸨基因组DNA 2μl，BSA水溶液(BSA的浓度为20mg/ml)0.1μl，补充去离子水至25μl。

其中，Biomed 2×Taq PCR MasterMix为北京博迈德基因技术有限公司产品。

在采用两个多重PCR扩增体系进行PCR扩增时的退火温度均可为50℃。在采用两个多重PCR扩增体系进行PCR扩增时的条件均可为94℃预变性5min，然后进行30个循环(94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min)，之后72℃延伸10min。

上述方法1中，所述根据PCR扩增产物确定所述待鉴定大鸨间的亲缘关系具体可根据不同的引物对扩增的等位基因确定所述待鉴定大鸨间的亲缘关系。具体可采用亲缘关系分析软件进行，如ML-Relate软件。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定两个或两个以上大鸨是否具有母源关系的方法。

本发明所提供的鉴定两个或两个以上大鸨是否具有母源关系的方法，将其命名为方法2，包括：利用所述引物对对两个或两个以上待鉴定大鸨的基因组DNA进行PCR扩增，根据PCR产物的序列确定所述待鉴定大鸨间的亲缘关系：如所述待鉴定的大鸨间的所述PCR产物序列相同，所述待鉴定的大鸨间存在或候选存在母源关系；如所述待鉴定的大鸨间的所述PCR产物序列不同，所述待鉴定的大鸨间不存在或候选不存在母源关系。

上述方法2中，在利用所述引物对进行PCR扩增时，所述引物对的两条单链DNA 的浓度均可为0.2μM。具体可采用如下扩增体系进行：Biomed 2×Taq PCR MasterMix25μl，所述引物对，待测大鸨基因组DNA 2μl，去离子水补充至50μl。

其中，Biomed 2×Taq PCR MasterMix为北京博迈德基因技术有限公司产品。

在利用所述引物对进行PCR扩增时的退火温度可为50.6℃，具体PCR反应条件可为：95℃预变性6min，然后进行30个循环(95℃变性1min，50.6℃退火1min，72℃延伸1min)，之后72℃延伸10min。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的方法。

本发明所提供的鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系的方法，将其命名为方法3，包括下述1)和2)：

1)利用所述引物对对两个或两个以上待鉴定大鸨的基因组DNA进行PCR扩增，根据PCR产物的序列确定所述待鉴定大鸨间的亲缘关系：如所述待鉴定的大鸨间的所述PCR产物序列相同，所述待鉴定的大鸨间存在或候选存在母源关系；如所述待鉴定的大鸨间的所述PCR产物序列不同，所述待鉴定的大鸨间不存在或候选不存在母源关系；

2)利用所述成套引物甲分别对所述待鉴定大鸨得基因组DNA进行PCR扩增，根据PCR扩增产物确定所述待鉴定大鸨间的亲缘关系。

上述方法3中，所述待鉴定大鸨如根据步骤1)确定其具有母源关系，根据步骤2)确定其具有亲缘关系，则所述待鉴定大鸨具有母源关系；如根据步骤1)确定其不具有母源关系，根据步骤2)确定其具有亲缘关系，则所述待鉴定大鸨具有父源关系；如根据步骤1)确定其不具有母源关系，根据步骤2)确定其也不具有亲缘关系，则所述待鉴定大鸨不具有亲源关系。

上述方法3中，在利用所述引物对进行PCR扩增时各单链DNA的浓度、体系和反应条件具体可同上述方法2。

上述方法3中，在利用所述成套引物甲进行PCR扩增时各单链DNA的浓度、体系和反应条件具体可同上述方法1。

上述方法3中，步骤2)具体可根据不同的引物对扩增的等位基因确定所述待鉴定大鸨间的亲缘关系。具体可采用亲缘关系分析软件进行，如ML-Relate软件。

上述方法1-上述方法3中，所述待鉴定大鸨的基因组DNA均可为提取所述待鉴定大鸨的离体的羽毛或粪便的基因组DNA得到的基因组DNA。

在实际应用中，可根据所述方法结合其他的大鸨的相关信息，如年龄、繁殖时间、辈分关系、繁殖地等，进一步确定待鉴定大鸨间的具体亲缘关系。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：

P1、所述成套引物甲或所述成套引物乙在鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系中的应用；

P2、所述成套引物甲或所述成套引物乙在大鸨育种中的应用；

P3、所述引物对在鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系中的应用；

P4、所述引物对在大鸨育种中的应用；

P5、所述系统在鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系中的应用；

P6、所述系统在大鸨育种中的应用；

P7、所述大鸨线粒体DNA片段在鉴定两个或两个以上大鸨亲缘关系中的应用；

P8、所述大鸨线粒体DNA片段在大鸨育种中的应用；

P9、所述方法1、所述方法2或所述方法3在大鸨育种中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了大鸨育种方法。

本发明所提供的大鸨育种方法，包括按照所述方法1、所述方法2或所述方法3鉴定大鸨间的亲缘关系，将无亲缘关系的大鸨作为亲本进行育种。

本发明通过分析大鸨个体的微卫星基因型，发现在成套引物甲的10对引物对应的10个微卫星位点上，平均等位基因数为3.9，平均期望杂合度为0.707，各位点平均多态信息含量为0.628，表明所选择的微卫星位点具有较高的变异。采用CERVUS 2.0进一步分析发现，在双亲未知的情况下累计亲权排除概率为95.96％，在已知父亲或母亲信息的情况下，累计亲权排除概率为99.67％，表明选择的微卫星多重PCR体系可用于大鸨亲权鉴定，准确率已达到法医学鉴定水平。

本发明还通过分析本发明的大鸨线粒体DNA片段，来确定大鸨间的母源关系，在本发明的实施例中通过F6和M7、Fe1和Ne1、Fe4和Ne2得到了验证，并且准确率达100％。

通过非损伤性取样如粪便或羽毛已经解决了很多因传统采样限制而解决不了的问题，包括物种鉴定、性别确定、个体识别、数量调查、遗传多样性、基因流等。本发明拟通过采集大鸨的粪便或羽毛，利用提取的粪便DNA或羽毛DNA，基于线粒体DNA和微卫星DNA双重分子标记，分析大鸨的母源关系，计算大鸨个体间的亲缘关系，为大鸨人工繁育和重引入过程中种源的选定、配对方案的制定、系谱的构建提供技术支撑。

附图说明

图1为大鸨6种线粒体DNA控制区dloop片段单倍型的邻接树法聚类图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、基于线粒体DNA和微卫星DNA双重分子标记鉴定大鸨亲缘关系

随机选择内蒙古图牧吉自然保护区的9只雄性大鸨和9只雌性大鸨，采集每只大鸨的自然脱落的羽毛或者粪便。通过分析线粒体DNA和微卫星双重分子标记，判断个体间亲缘关系。9只雄性大鸨编号为M1，M2，M3，M4，M5，M6，M7，M8，M9；9只雌性大鸨编号为F1，F2，F3，F4，F5，F6，F7，F8，F9。

一、粪便或羽毛DNA的提取

1、采集的大鸨粪便采用冷冻保存，使用粪便DNA提取试剂盒(QIAGEN的QIAamp DNA Stool Mini Kit(ID:51504))提取大鸨基因组DNA；采集的大鸨的离体的羽毛保存于无水乙醇，使用组织DNA提取试剂盒(北京博迈德基因技术有限公司产品，ID：DL110-01)提取大鸨基因组DNA。

2、对提取的大鸨基因组DNA使用紫外分光光度计测定浓度和纯度，对于OD260/OD280值介于1.8-2.0的DNA保存于-20℃冰箱备用，对于DNA质量欠佳的样品，重新进行提取，直至DNA质量合格。用于进一步检测的大鸨基因组DNA的浓度为29.57±1.52ng/μl。

二、基于线粒体DNA和微卫星DNA双重分子标记鉴定大鸨亲缘关系

1、线粒体DNA控制区dloop片段引物

线粒体DNA控制区dloop片段引物用来鉴定大鸨母源关系，设计正反向引物：Otdloop-F:CCCCATAGACATATTATGCATTC-3’(序列表中序列1)和Otdloop-R:GGAAAGAATGGGCCTGAAGCTAGT-3’(序列表中序列2)，将这两条引物组成的引物对命名为鉴定两个或两个以上大鸨是否具有母源关系的引物对，Otdloop-F与Otdloop-R的摩尔比为1:1，两条引物独立包装。

2、微卫星多重PCR引物

微卫星多重PCR引物，其名称为成套引物甲，由成套引物1和成套引物2组成，均由5对微卫星引物组成，成套引物1与成套引物2中的各单链DNA均独立包装，成套引物1与成套引物2中的各单链DNA的摩尔数均相等。成套引物1和成套引物2中各单链DNA的序列见表1，其中，序列3、17和19所示的三条单链DNA的5’端均由HEX标记，序列5、9、11、13、15和21所示的各单链DNA的5’端均由FAM标记，序列7所示的单链DNA的5’端均由TET标记。

表1、大鸨微卫星多重PCR体系所采用的引物信息

3、利用设计的引物进行PCR扩增

(1)线粒体DNA控制区dloop片段扩增采用如下50μl体系：Biomed 2×Taq PCR MasterMix(北京博迈德基因技术有限公司产品)25μl，引物Otdloop-F和Otdloop-R各1μl(引物Otdloop-F和Otdloop-R在该反应体系中的浓度均为0.2μM)，大鸨基因组DNA 2μl，去离子水补充至50μl。PCR反应条件为：95℃预变性6min，然后进行30个循环(95℃变性1min，50.6℃退火1min，72℃延伸1min)，之后72℃延伸10min。

(2)多重微卫星PCR反应

成套引物1采用如下25μl多重微卫星PCR反应体系：Biomed Taq DNA Master Mix12.5μl，成套引物1(成套引物1的各引物在该反应体系中的浓度均为0.16μM)， 大鸨基因组DNA 2μl，BSA水溶液(BSA的浓度为20mg/ml)0.1μl，补充去离子水至25μl。

成套引物2采用如下25μl多重微卫星PCR反应体系：Biomed Taq DNA Master Mix12.5μl，成套引物2(成套引物2的各引物在该反应体系中的浓度均为0.16μM)，大鸨基因组DNA 2μl，BSA水溶液(BSA的浓度为20mg/ml)0.1μl，补充去离子水至25μl。

成套引物1与成套引物2的多重微卫星PCR反应条件均为：94℃预变性5min，然后进行30个循环(94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min)，之后72℃延伸10min。

4、测序和基因扫描

(1)对线粒体DNA控制区dloop的PCR扩增产物使用ABI Prism377测序仪进行双向测序。

(2)对多重微卫星PCR产物，进行基因扫描，用ABI-3730xl型DNA序列分析仪电泳分离和荧光扫描，以ROX荧光标记作为内参，使用Genemarker软件分析各个大鸨个体的微卫星等位基因。

5、亲缘关系分析

(1)通过软件MEGA5.0对线粒体DNA控制区dloop片段序列的比对，发现在18只大鸨中，线粒体DNA控制区dloop片段序列有六种，即存在6种单倍型(表2)，即大鸨在系统进化过程中至少有6个母系起源。其中，M1、M7、M8、F1、F6和F8的线粒体DNA控制区dloop片段序列均为序列表中序列23，单倍型为OtHap1；M4、M5和F4的线粒体DNA控制区dloop片段序列均为序列表中序列24，单倍型为OtHap2；F5和F7的线粒体DNA控制区dloop片段序列均为序列表中序列25，单倍型为OtHap3；M2、M3和M9的线粒体DNA控制区dloop片段序列均为序列表中序列26，单倍型为OtHap4；M6、F3和F9的线粒体DNA控制区dloop片段序列均为序列表中序列27，单倍型为OtHap5；F2的线粒体DNA控制区dloop片段序列均为序列表中序列28，单倍型为OtHap6。表明，M1、M7、M8、F1、F6和F8具有共同的母系来源，M4、M5和F4具有共同的母系来源，F5和F7具有共同的母系来源，M2、M3和M9具有共同的母系来源,M6、F3和F9具有共同的母系来源，F2与其余大鸨均不具有共同的母系来源。

根据这6种单倍型采用MEGA 5.0作邻接树(Neighbor-joining)，参数设置为Bootstrap法，Bootstrap重复次数为1000，核苷酸置换模型为Kimura 2-parameter model，发现这6种单倍型聚成两个支系(图1)。

基于此，利用本发明设计的线粒体DNA的dloop片段，可应用于：(1)在确定母源关系时，如果2个待检个体的线粒体DNA dloop序列不同，则可排除二者存在母源 关系，表明二者亲缘关系较远，如果作为参与繁殖的候选个体，可有效避免近亲繁殖；(2)在人工调配大鸨种源过程中，应该将来自于不同母系来源且分属不同支系的雌性个体挑选出来，优先与雄性大鸨参与繁殖，并确保该单倍型随着世代数的变化不丢失，有助于保持物种的遗传多样性。

表2、大鸨线粒体DNA控制区dloop片段的变异位点及单倍型分布

表2中，“.”表示OtHap2、OtHap3、OtHap4、OtHap5、OtHap6在相对应的碱基上，与OtHap1的碱基相同。

(2)根据多重微卫星PCR反应的基因扫描结果，分析18只大鸨个体的微卫星基因型，发现在这10对微卫星引物对应的10个微卫星位点上，平均等位基因数为3.9，平均期望杂合度为0.707，各位点平均多态信息含量为0.628，表明所选择的微卫星位点具有较高的变异。采用软件CERVUS 2.0进一步分析发现，在双亲未知的情况下累计亲权排除概率为95.96％，在已知父亲或母亲信息的情况下，累计亲权排除概率为99.67％，表明选择的微卫星多重PCR体系可用于大鸨亲权鉴定，准确率已达到法医学鉴定水平。

为了进一步分析待检测个体间的亲缘关系，将18只大鸨个体的微卫星等位基因数据，输入ML-Relate软件，设置置信水平(confidence level)为0.95，最大似然随机重复次数(maximum likelihood randmizations)设置为1000。ML-Relate软件首先通过假定大鸨个体两两间存在4种亲缘关系，分别为U、HS、FS和PO，其中U表示无亲缘关系(Unrelated)，HS表示半同胞(Half Sibs)，FS表示全同胞(Full Sibs)，PO表示亲子关系(Parent/Offspring)。然后根据大鸨个体在10个微卫星位点上的基因型分布情况，软件自动计算大鸨个体两两间每种亲缘关系条件下的最大似然概率。 当四种假定亲缘关系中，哪一个亲缘关系通过微卫星基因型计算得到的似然概率最大，则判断为存在该种亲缘关系。得到的亲缘关系矩阵(Relationship Matrix)，见表3。

表3、基于微卫星基因型计算的个体两两间亲缘关系判断矩阵

其中，U表示无亲缘关系(Unrelated)，HS表示半同胞(Half Sibs)，FS表示全同胞(Full Sibs)，PO表示亲子关系(Parent/Offspring)。

根据多重微卫星PCR反应的结果发现M1与M2存在亲子关系，因为M1和M2均为雄性，可判断M1和M2存在父子关系，这与繁殖记录一致。

根据多重微卫星PCR反应的结果发现F6和M7为全同胞关系，而F6和M7的线粒体DNA控制区dloop片段序列相同，也说明F6和M7具有共同的母系来源。F6和M7是从野外救护而来，来自于同一个野外巢，为全同胞关系，与上述鉴定结果一致。

根据多重微卫星PCR反应的结果发现M5与M6、M1与M8、M7与M9、F1与M1、M5与F2、F4与M4、F3与M9、M4与F5、M5与F5、F5与F4、F6与M1、F6与F4、F7与F5、F8与M1、F8与M6、F9与M5、F9与M6、F9与F3均为半同胞关系；根据大鸨的线粒体DNA控制区dloop片段结果得知，M1与M8、F1与M1、F4与M4、F6与M1、F7与F5、F8与M1、F9与M6、F9与F3均具有相同的母系来源，这与多重微卫星PCR反应的结果一致；而大鸨的线粒体DNA控制区dloop片段结果显示M5与M6、M7与M9、M5与F2、F3与M9、M4与F5、M5与F5、F5与F4、F6与F4、F8与M6、F9与M6均不 存在母源关系，表明这几对大鸨间存在父源关系。

根据多重微卫星PCR反应的结果发现剩余的大鸨间无亲缘关系，并且根据各对大鸨的线粒体DNA控制区dloop片段得到的剩余的大鸨间也不存在相同的母系来源。在筛选繁殖个体时，则需要参考这些无亲缘关系个体的线粒体单倍型和支系，尽量选择具有不同线粒体单倍型且属于不同母系分支的个体参与繁殖。

实施例2、基于线粒体DNA和微卫星DNA双重分子标记进行大鸨亲权鉴定的验证

采集内蒙古图牧吉国家级自然保护区一个散养繁殖场(400m×300m)的2只成年雄性大鸨、4只成年雌性大鸨和2只雏鸟的粪便样品或羽毛样品，鉴定雏鸟的生物学父亲和生物学母亲。2只成年雄性大鸨的编号为Male1(简写为Ma1,以下同)和Male2(Ma2)；4只成年雌性大鸨的编号为Female1(Fe1)、Female2(Fe2)、Female3(Fe3)和Female4(Fe4)；2只雏鸟的编号为Nestling1(Ne1)和Nestling2(Ne2)。

一、粪便或羽毛DNA的提取

1、采集的大鸨粪便采用冷冻保存，使用粪便DNA提取试剂盒(QIAGEN的QIAamp DNA Stool Mini Kit(ID:51504))提取大鸨基因组DNA；采集的大鸨的离体的羽毛保存于无水乙醇，使用组织DNA提取试剂盒(北京博迈德基因技术有限公司产品，ID：DL110-01)提取大鸨基因组DNA。

2、对提取的大鸨基因组DNA使用紫外分光光度计测定浓度和纯度，对于OD260/OD280值介于1.8-2.0的DNA保存于-20℃冰箱备用，对于DNA质量欠佳的样品，重新进行提取，直至DNA质量合格。用于进一步检测的大鸨基因组DNA的浓度为26.16±1.87ng/μl。

二、基于线粒体DNA和微卫星DNA双重分子标记进行大鸨亲权鉴定

1、线粒体DNA控制区dloop片段引物

线粒体DNA控制区dloop片段引物用来鉴定大鸨母源关系，设计正反向引物：Otdloop-F:CCCCATAGACATATTATGCATTC-3’(序列表中序列1)和Otdloop-R:GGAAAGAATGGGCCTGAAGCTAGT-3’(序列表中序列2)，将这两条引物组成的引物对命名为鉴定两个或两个以上大鸨是否具有母源关系的引物对，Otdloop-F与Otdloop-R的摩尔比为1:1，两条引物独立包装。

2、微卫星多重PCR引物

微卫星多重PCR引物，其名称为成套引物甲，由成套引物1和成套引物2组成，均由5对微卫星引物组成，成套引物1与成套引物2中的各单链DNA均独立包装，成套引物1与成套引物2中的各单链DNA的摩尔数均相等。成套引物1和成套引物2中各单链DNA的序列见表1，其中，序列3、17和19所示的三条单链DNA的5’端均由 HEX标记，序列5、9、11、13、15和21所示的各单链DNA的5’端均由FAM标记，序列7所示的单链DNA的5’端均由TET标记。

3、利用设计的引物进行PCR扩增

(1)线粒体DNA控制区dloop片段扩增采用如下50μl体系：Biomed 2×Taq PCR MasterMix(北京博迈德基因技术有限公司产品)25μl，引物Otdloop-F和Otdloop-R各1μl(引物Otdloop-F和Otdloop-R在该反应体系中的浓度均为0.2μM)，大鸨基因组DNA 2μl，去离子水补充至50μl。PCR反应条件为：95℃预变性6min，然后进行30个循环(95℃变性1min，50.6℃退火1min，72℃延伸1min)，之后72℃延伸10min。

(2)多重微卫星PCR反应

成套引物1采用如下25μl多重微卫星PCR反应体系：Biomed Taq DNA Master Mix12.5μl，成套引物1(成套引物1的各引物在该反应体系中的浓度均为0.16μM)，大鸨基因组DNA 2μl，BSA水溶液(BSA的浓度为20mg/ml)0.1μl，补充去离子水至25μl。

成套引物2采用如下25μl多重微卫星PCR反应体系：Biomed Taq DNA Master Mix12.5μl，成套引物2(成套引物2的各引物在该反应体系中的浓度均为0.16μM)，大鸨基因组DNA 2μl，BSA水溶液(BSA的浓度为20mg/ml)0.1μl，补充去离子水至25μl。

成套引物1与成套引物2的多重微卫星PCR反应条件均为：94℃预变性5min，然后进行30个循环(94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min)，之后72℃延伸10min。

4、测序和基因扫描

(1)对线粒体DNA控制区dloop的PCR扩增产物使用ABI Prism377测序仪进行双向测序。

(2)对多重微卫星PCR产物，进行基因扫描，用ABI-3730xl型DNA序列分析仪电泳分离和荧光扫描，以ROX荧光标记作为内参，使用Genemarker软件分析各个大鸨个体的微卫星等位基因。

5、亲权鉴定

通过软件MEGA5.0对线粒体DNA控制区dloop片段序列的比对，发现大鸨雏鸟Ne1、成年雌鸨Fe1和成年雌鸨Fe3的线粒体DNA控制区dloop片段序列相同，一致性为100％，对应的单倍型为表2的OtHap2；大鸨雏鸟Ne2的线粒体DNA控制区dloop片段序列与Fe4的一致性为100％，对应的单倍型为表2的OtHap1。基于此，可判断，Ne1、Fe1和Fe3存在母源关系；Ne2与Fe4存在母源关系。

为了进一步分析待检测个体间的亲缘关系，将这8只大鸨个体的微卫星等位基因数据，输入ML-Relate软件进行进一步的分析，结果发现：(1)Ma1和Ne1存在亲子关系，Fe1和Ne1存在亲子关系，由于Ma1和Fe1均为成年大鸨，Ne1为大鸨雏鸟，表明，Ma1和Fe1分别为Ne1的生物学母亲和父亲；(2)Ma2和Ne2存在亲子关系，Fe4和Ne2存在亲子关系，由于Ma2和Fe4均为成年大鸨，Ne2为大鸨雏鸟，表明，Ma2和Fe4分别为Ne2的生物学母亲和父亲。存在亲缘关系的7只大鸨的微卫星等位基因如表4所示，10个微卫星位点上的基因型也表明符合孟德尔遗传。根据繁育部门的基于红外摄像监控和行为学观察，雄鸨Ma1和雌鸨Fe1发生了交配行为，雌鸨Fe1孵育出的幼雏正是Ne1；雄鸨Ma2和雌鸨Fe4发生了交配行为，雌鸨Fe4孵育出的幼雏正是Ne2；表明本发明的方法在鉴定大鸨亲缘关系时准确可靠。

表4、7只大鸨的微卫星等位基因在10个微卫星位点上的等位基因