一种酶法拆分阿巴卡韦手性中间体文斯内酯的方法

摘要

本发明公开了一种酶法拆分阿巴卡韦手性中间体文斯内酯的方法，催化剂采用脂肪酶YCJ01，具体包括如下步骤：耐有机溶剂脂肪酶YCJ01在有机相中，催化底物N‑羟甲基文斯内酯和乙酸乙烯酯进行转酯反应，高效拆分N‑羟甲基文斯内酯。本发明采用来自于Burkholderia ambifaria YCJ01的具有独特底物特异性和立体选择性的耐有机溶剂脂肪酶YCJ01来催化拆分N‑羟甲基文斯内酯，能够达到很好的拆分效果，并获得高纯度的单一对映体。

说明书

技术领域

本发明涉及生物催化工程研究领域，具体涉及一种可以作为医药中间体的文斯内酯的手性拆分工艺。

背景技术

本发明所涉及的文斯内酯，是制备碳环核苷类药物的重要手性中间体。化学名称为2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，分子量为109.13，结构式为：

目前，碳环核苷类化合物在核苷类药物中的重要性与日俱增，在已经公开的抗病毒药物中核苷类药物占绝大多数。由光学纯的(1R，4S)-文斯内酯出发合成的药物主要有抗HIV药物阿巴卡韦，由(1S，4R)-文斯内酯出发合成的主要有抗流感药物帕拉米韦。阿巴卡韦是治疗艾滋病和疱疹病毒感染的药物，也是“鸡尾酒疗法”中的关键药物组成成分。目前世界上艾滋病发展趋势日趋严重，阿巴卡韦具有广阔的市场前景，销量正在逐年递增。此外，近年来全球爆发了数次流感疫情。在这种情况下，继续研究开发新型高效、副作用小的抗流感药物迫在眉睫。帕拉米韦是一种新型的抗流感病毒药物，能有效抑制各种流感病毒株的复制和传播过程，耐受性好、毒性小。研究表明，帕拉米韦在禽流感方面的治疗效果比“达菲”更加明显。因而拆分外消旋文斯内酯具有重要的经济价值和社会价值。

目前报道的文斯内酯的拆分方法主要有两种，不对称合成法、酶法拆分。Francisco Velazquez等(The application of chiral oxazolidinethiones and thiazolidine thioned in asymmetric synthesis.Current Organic Chemistry,2002,(6):1-38)首先利用不对称合成法来制备单一构型的文斯内酯，但该方法存在很大的弊端，步骤烦琐，成本高，不利于工业化生产。酶法主要有采用γ-内酰胺酶催化水解拆分(+/-)γ-内酰胺(即文斯内酯)以及利用脂肪酶催化拆分文斯内酯。Talorstephen等(Development of the biocatalytic resolution of 2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5en-3-one as anentry tosingle-enantiomer carbocyclic nucleosides.Tetrahedron:Asymmdtry，1993,4(6):1117-1118)利用内酰胺酶对拆分文斯内酯的效果进行了研究，他们通过完整细胞转化实验，达到了良好的拆分效果，并分离得到了两种分别可以专一性水解一种对映体的酶。但该方法会造成另一种单一对映体的浪费以及限制了最大的理论量。Brabban(R.Stereospecificγ-lactamaseactivity in aPseudomonas fluoreseens species.J Ind Microbiol,1996,16(1):8-14)和Mahmoudian等(A practicalenzymic procedure for resolution of N-substituted 2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-ones.Tetrahedron:Asymmdtry,1999,10(6):1201-1206)利用乙酰苯丙氨酸为唯一碳源筛选得到了产γ-内酰胺酶菌株，并应用于拆分γ-内酰胺。但是采用γ-内酰胺酶催化水解拆分文斯内酯仍然存在一些问题，高效率、高稳定性的适于工业化生产的γ-内酰胺酶不易寻找，拆分反应存在副产物γ-氨基丁酸，尚未见产业化报道，因此该方法并不是最优的方法。Hiroto Nakano等(Hiroto,N.,Kazuto,I.,Yuko,O.,Hiroshi,H.Lipase-catalyzed resolution of 2-azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-ones.Tetrahedron:Asymmetry.1996,7:2381-2386)首先利用脂肪酶对(+/-)γ-内酰胺(即文斯内酯)进行了拆分，由于脂肪酶的立体选择性，它只催化拆分消旋体中的一种，从而达到了拆分，但该方法底物浓度不高，拆分效果一般。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用酶法制备阿巴卡韦重要手性中间体文斯内酯的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

选用耐有机溶剂脂肪酶YCJ01催化拆分阿巴卡韦手性中间体文斯内酯。所选用脂肪酶YCJ01已公开在同一发明人的在先授权专利CN102329745B中，产脂肪酶YCJ01菌株保藏登记号CCTCC NO：M2011058。

脂肪酶YCJ01催化拆分阿巴卡韦手性中间体文斯内酯步骤具体如下：

(1)向密封瓶中加入N-羟甲基文斯内酯，酰基供体，有机溶剂和脂肪酶YCJ01，置于摇床中反应。

(2)反应结束后，过滤反应液，滤液用乙醚萃取三次，合并有机相，之后过柱纯化，加入无水硫酸钠干燥，获得(1S,4R)-N-羟甲基文斯内酯固体，将(1S,4R)-N-羟甲基文斯内酯固体溶于甲醇后，加入NH₄OH，室温条件下搅拌后，经旋转蒸发除去溶剂，之后过柱纯化，真空干燥得淡黄色固体，即为(1S,4R)-文斯内酯。

其中摇床转速设定为180rpm/min。

其中反应底物外消旋体N-羟甲基文斯内酯采用化学法制备，具体制备方法参考HirotoNakano等的文献(Eliroto Nakano,Kazuto lwasa,Yuko Okuyanm,and Hiroshi Hongo.Lipase-catalyzed resolution of 2-azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-ones.Tetrahedron:Asymmetry.1996,7:2381-2386)，N-羟甲基文斯内酯最终产率为85％。

本发明的反应式如下：

其中，所述步骤(1)中脂肪酶YCJ01拆分在有机相中进行，所述有机溶剂可为单组分或双组分。所述有机溶剂采用单组分时，选自环己烷、甲苯、异丙醇、甲基叔丁基醚、正己烷或丙酮中的一种，优选甲基叔丁基醚。

当脂肪酶拆分在双组分有机溶剂中进行时，固定双组分中的其中一个组分为甲基叔丁基醚，另一组分为环己烷、甲苯、异丙醇、正己烷或丙酮；双组分有机溶剂优选甲基叔丁基醚和正己烷，其中正己烷在混合液中的体积浓度(v/v)为0％-40％，优选5％-15％，更优选10％。

所述步骤(1)中酰基供体选自乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、戊酸乙烯酯、己酸乙烯酯中的一种。优选的，所述酰基供体采用乙酸乙烯酯，所述乙酸乙烯酯的浓度为200～2000mM，优选1000～1400mM。

所述步骤(1)中耐有机溶剂脂肪酶YCJ01的用量为50～250U/ml，优选125～150U/ml，更优选150U/ml。

所述步骤(1)中N-羟甲基文斯内酯浓度为50～600mM，优选300～350mM。

所述步骤(1)中N-羟甲基文斯内酯和乙酸乙烯酯的反应浓度摩尔比为1:1～10，优选1:1～5，更优选1:4。

所述步骤(1)中，反应体系在摇床中反应温度为10～50℃，优选25℃～40℃，更优选32～37℃；反应时间为6～24h，优选12h。

采用本发明所述的方法拆分文斯内酯，转化率达49.9～50.1％，产物(1R，4S)-N-羟甲基文斯内酰胺酯的ee_p值≥99.0％；拆分后其中剩余底物(1S，4R)-N-羟甲基文斯内酯的ee_s值≥99.2％。。

本发明的有益效果在于使用来自于Burkholderia ambifaria YCJ01的具有独特底物特异性和立体选择性的耐有机溶剂脂肪酶YCJ01来催化拆分N-羟甲基文斯内酯，并对其各个条件进行了优化，并筛选出了适合于使用脂肪酶YCJ01手性拆分N-羟甲基文斯内酯的生产条件。此方法步骤简单，无副产物，所使用的脂肪酶YCJ01立体选择性高，不但可以保证有比较高的收率，而且保证最终手性产品的ee值达到99％以上，达到了很好的拆分效果。

本发明所使用的自主知识产权的脂肪酶立体选择性高，应用于催化外消旋底物N-羟甲基文斯内酯的拆分反应，拆分后底物(1S，4R)-N-羟甲基文斯内酯ee_s值≥99％；产物(1R，4S)-N-羟甲基文斯内酰胺酯ee_p值≥99％。本发明的工艺路线具有较好的经济性和技术可行性，具备一定的科研与实用意义。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不限制本发明。

本发明所述的耐有机溶剂脂肪酶YCJ01来自于Burkholderia，所选用脂肪酶YCJ01已公开在同一发明人的在先授权专利CN102329745B中，产脂肪酶YCJ01菌株保藏登记号CCTCCNO：M2011058。

脂肪酶YCJ01的粗酶粉制备参考Yao等的文献(An organic solvent and thermally stablelipase from Burkholderia ambifaria YCJ01:Purification,characteristics and application for chiralresolution of mandelic acid)。

实施例1

向4ml的密封瓶中加入质量为83.4mg，浓度为300mmol的N-羟甲基文斯内酯，222μl浓度为1200mmol的乙酸乙烯酯和2ml甲基叔丁基醚(包含10％体积的正己烷)和30mg脂肪酶YCJ01，置于摇床中反应。摇床反应温度为35℃，摇床转速为180rpm/min，反应12h。

反应结束后，过滤反应液，滤液用乙醚萃取剂约12ml，分3次萃取，合并有机相，之后过柱子纯化，加入400mg无水硫酸钠干燥2h，获得(1S,4R)-N-羟甲基文斯内酯固体，将其溶于10ml甲醇后，加入1ml NH₄OH，室温条件下搅拌12h后，经旋转蒸发除去溶剂，之后过柱纯化，真空干燥得淡黄色固体，即为(1S,4R)-文斯内酯。

反应的转化率C％为50.1％，ee_p％为99.0％，ee_s为99.2％。

实施例2

本实施例反应体系中的底物浓度为：300mM的N-羟甲基文斯内酯，200mM的乙酸乙烯酯，并加入30mg脂肪酶YCJ01，在2ml甲基叔丁基醚(包含10％体积的正己烷)中置于35℃、180rpm的摇床中反应6h。实验操作步骤同实施例1中的步骤。具体的结果如下：

实施例3

本实施例反应体系中的底物浓度为：300mM的N-羟甲基文斯内酯，2000mM的乙酸乙烯酯，并加入30mg脂肪酶YCJ01，在2ml甲基叔丁基醚(包含10％体积比的正己烷)中置于35℃、180rpm的摇床中反应24h。实验操作步骤同实施例1中的步骤。具体的结果如下：

实施例4

本实施例反应体系中的底物浓度为：300mM的N-羟甲基文斯内酯，1400mM的乙酸乙烯酯，并加入30mg脂肪酶YCJ01，在2ml甲基叔丁基醚(包含10％体积比的正己烷)中置于35℃、180rpm的摇床中反应12h。实验操作步骤同实施例1中的步骤。具体的结果如下：

实施例5

本实施例反应体系中的底物浓度为：300mM的N-羟甲基文斯内酯，1000mM的乙酸乙烯酯，并加入30mg脂肪酶YCJ01，在2ml甲基叔丁基醚(包含10％体积比的正己烷)中置于35℃、180rpm的摇床中反应12h。实验操作步骤同实施例1中的步骤。具体的结果如下：

实施例6：有机溶剂对N-羟甲基文斯内酯酶促拆分的影响

实施例6采用和实施例1同样的实验步骤，对有机溶剂种类对N-羟甲基文斯内酯酶粗拆分的影响进行了讨论。

由于有机溶剂可以通过改变酶蛋白分子的动态移动性及构象，从而显著影响酶的活性及立体选择性，所以在有机相中进行酶促反应时，选择合适的有机溶剂是十分必要的。相关研究表明有机溶剂对酶活性及立体选择性的影响大小主要与溶剂的极性(log P)有关，因此同时根据脂肪酶YCJ01对有机溶剂的耐受性，选择环己烷、甲苯、异丙醇、甲基叔丁基醚、环己烷和丙酮作为溶剂，考察它们对N-羟甲基文斯内酯拆分效果的影响。在本实施例中，底物N-羟甲基文斯内酯的浓度为100mM，乙酸乙烯酯的浓度为500mM，分别选取以上几种有机溶剂，在35℃条件下反应12h来催化拆分N-羟甲基文斯内酯，其中耐有机溶剂脂肪酶的用量为100U/ml。具体的拆分效率与不同有机溶剂的关系为：

表1.不同有机溶剂对N-羟甲基文斯内酯拆分的影响

由此可见，甲基叔丁基醚最适合作为脂肪酶YCJ01催化N-羟甲基文斯内酯转酯反应的反应介质。在极性较强的溶剂中，酶通常不会有太高的活力，并且通常反应体系需要较高的水活度才能保持酶分子的适当活性构象，从而使酶表现出一定的催化活力。此外，有的有机溶剂还可能渗透到酶的活性中心从而改变酶的构像，进而影响酶的性能。以甲基叔丁基醚作为反应溶剂效果佳，故而进一步通过条件的进一步优化来提高拆分效率。

实施例7：两种底物浓度摩尔比对N-羟甲基文斯内酯酶促拆分的影响

在酶促反应体系中，底物浓度的变化会影响酶的催化活性及立体选择性，而底物浓度的变化可以通过改变反应体系中两种底物的摩尔浓度比来实现。通常在此类反应中，过量的乙酸乙烯酯可以防止产物酯的水解，从而提高了反应平衡以及增加理论最大的产品产量。本实验中固定N-羟甲基文斯内酯的摩尔浓度为100mM，通过改变乙酸乙烯酯的摩尔浓度来调节两种底物的摩尔浓度比(N-羟甲基文斯内酯与乙酸乙烯酯摩尔浓度比为1：1～6)，选取甲基叔丁基醚作为反应溶剂，在35℃条件下反应12h来催化拆分N-羟甲基文斯内酯，其中耐有机溶剂脂肪酶的用量为100U/ml。具体的拆分效率与不同摩尔浓度比的关系为：

表2：不同底物摩尔浓度比对N-羟甲基文斯内酯拆分的影响

由此可见，脂肪酶YCJ01的催化活力随乙酸乙烯酯与N-羟甲基文斯内酰胺的摩尔浓度比的增加而增大，当比值为4：1时达到最大，继续增大摩尔浓度比，随着乙酸乙烯酯浓度的增大，催化活力逐渐降低。

实施例8：催化剂用量对N-羟甲基文斯内酯酶促拆分的影响

脂肪酶催化非对称转酯反应时的催化活力和立体选择性在很大程度上受用酶量的影响。本实验针对甲基叔丁基醚中脂肪酶YCJ01的用量对N-羟甲基文斯内酯的转酯反应的影响进行了研究。本实验中底物N-羟甲基文斯内酯的浓度为100mM，乙酸乙烯酯的浓度为400mM，选取甲基叔丁基醚作为反应溶剂，在35℃条件下反应12h来催化拆分N-羟甲基文斯内酯，脂肪酶YCJ01的用量分别为10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg。具体的加酶量对N-羟甲基文斯内酯拆分的影响关系为：

表3：不同加酶量对N-羟甲基文斯内酯拆分的影响

由此可见，在50～200U/ml的用酶量范围内，随着酶量的增加，脂肪酶YCJ01的催化活性升高，且在用酶量为125～150U/ml时活性达到最大，超过150U/ml时活性提高甚微。原因可能是当用酶量较少时，酶与底物碰撞机会小，导致酶活不高，随着用酶量的增加，酶与底物碰撞几率增大，使酶的活性增大，而加酶量超过一定值时，与底物接触的酶已达饱和，所以酶活力几乎不再提高。因此采用125～150U/ml作为后续的实验用酶量。

实施例9：酰基供体对N-羟甲基文斯内酯酶促拆分的影响

脂肪酶催化动力学拆分过程中，乙烯酯类酰化试剂具有重要的作用，它通常在脂肪酶催化的手性醇的转酯反应中作为酰基供体，先与酶形成酰基复合体，而后酰基酶复合体优先与手性醇中的某一对映体结合，将其酯化，从而达到拆分手性醇的目的。酰基供体的链长不同造成的位阻差异会引起脂肪酶的立体选择性发生改变。本实验选择了5种不同链长的酰基供体，对N-羟甲基文斯内酯的转酯反应的影响进行了研究。本实验中底物N-羟甲基文斯内酯的浓度为100mM，酰基供体的浓度为400mM，选取甲基叔丁基醚作为反应溶剂，在35℃条件下反应12h来催化拆分N-羟甲基文斯内酯，脂肪酶YCJ01的用量为150U/ml。不同链长的酰基供体对N-羟甲基文斯内酯拆分的影响关系为：

表4：不同链长的酰基供体对N-羟甲基文斯内酯拆分的影响

由此可见，中等长度链长的酰基供体对脂肪酶YCJ01拆分N-羟甲基文斯内酯的效果比较好，当丁酸乙烯酯作为酰基供体时，脂肪酶YCJ01的催化拆分效果最好。但随着链长的增加，其催化效果明显降低。因此，中等长度链长的酰基供体是脂肪酶YCJ01的最佳作用底物。由于乙酸乙烯酯，丙酸乙烯酯及丁酸乙烯酯对脂肪酶YCJ01的催化活性及立体选择性的影响相差不大，而乙酸乙烯酯价格相对低廉。从经济层面考虑，选择乙酸乙烯酯作为脂肪酶YCJ01催化N-羟甲基文斯内酯反应的酰基供体。

实施例10：双组分混合有机溶剂对N-羟甲基文斯内酯酶促拆分的影响

有机溶剂耐受性是衡量脂肪酶催化活性的重要特征之一。非水相体系中的酶催化不仅取决于酶的性质，同时与所选有机溶剂也密切相关。相关研究表明，使用双组分有机溶剂作为反应介质对底物热力学活度和反应活化能有重要影响。因此固定双组分中的其中一个组分为甲基叔丁基醚。双组分有机溶剂选自甲基叔丁基醚和环己烷，甲基叔丁基醚和甲苯，甲基叔丁基醚和异丙醇，甲基叔丁基醚和正己烷，甲基叔丁基醚和丙酮中的一种。本实验对不同的双组分溶剂对酶促拆分的影响进行了研究，为了保证实验的可行性，其中甲基叔丁基醚的含量设定为90％，另一有机溶剂含量为10％，底物N-羟甲基文斯内酯的浓度为100mM，乙酸乙烯酯的浓度为400mM，在35℃条件下反应12h来催化拆分N-羟甲基文斯内酯，脂肪酶YCJ01的用量为150U/ml。不同的双有机溶剂组分对N-羟甲基文斯内酯拆分的影响关系为：

表5：不同双有机溶剂组分对N-羟甲基文斯内酯拆分的影响

由此可见，当双有机溶剂组分选择甲基叔丁基醚和正己烷时，反应效果最好。为了更进一步的提高反应效率，在其他条件不变的情况下，对不同含量的正己烷进行了研究，具体结果如下：

表6：不同含量正己烷对N-羟甲基文斯内酯拆分的影响

由此可见，当往反应体系中添加10％正己烷时，脂肪酶YCJ01催化拆分N-羟甲基文斯内酯效果最佳。同时可以看出，采用双有机溶剂体系确实提高了催化效率。原因可能是脂肪酶YCJ01在正己烷中具有非常好的耐受性，脂肪酶的稳定性比较好。有研究表明在疏水性较强溶剂中酶的催化活力和对映体选择性较高。与此同时，双组分有机溶剂中进行酶促酯化反应，对反应的活化能有一定的影响，同时也会影响脂肪酶的催化活性。

实施例11：反应温度对N-羟甲基文斯内酯酶促拆分的影响

酶的生物本质为蛋白质，因此温度对酶催化的反应必然有很大的影响。相关研究表明，温度不仅可以影响酶的活性，有时还可能会影响酶的立体选择性。本实验研究了不同的温度对N-羟甲基文斯内酯酶促拆分的影响。本实验中底物N-羟甲基文斯内酯的浓度为100mM，酰基供体的浓度为400mM，选取甲基叔丁基醚和正己烷(9:1v/v)双组分有机溶剂作为反应溶剂，在不同的温度条件下反应12h来催化拆分N-羟甲基文斯内酯，脂肪酶YCJ01的用量为150U/ml。不同温度对N-羟甲基文斯内酯拆分的影响关系为：

表7：不同反应温度对N-羟甲基文斯内酯拆分的影响

由此可见，随着反应温度的升高，脂肪酶YCJ01的催化效率随之升高，但当温度到达35℃之后，随着温度的升高，脂肪酶的催化效率趋于不变。从该反应中酶的催化活力与立体选择性以及经济节能方面考虑，选择32～40℃作为有机相中脂肪酶YCJ01催化N-羟甲基文斯内酯酶促拆分的反应温度。

实施例12：底物N-羟甲基文斯内酯浓度对酶促拆分的影响

由于过多的底物对于酶具有抑制作用，所以N-羟甲基文斯内酯的浓度对于脂肪酶YCJ01的拆分效率具有很大的影响。本实验中两种底物浓度摩尔比(N-羟甲基文斯内酯与乙酸乙烯酯摩尔浓度比)为1:4，N-羟甲基文斯内酯的浓度分别为100mM，200mM，300mM，400mM，500mM，600mM在35℃条件下反应12h来催化拆分N-羟甲基文斯内酯，脂肪酶YCJ01的用量为150U/ml。不同浓度的N-羟甲基文斯内酯对拆分的影响关系为：

表8：不同浓度N-羟甲基文斯内酯对拆分的影响

由此可见，当N-羟甲基文斯内酯浓度小于300mM时，脂肪酶YCJ01催化拆分的效率很高且相差不大。但当N-羟甲基文斯内酯的浓度超过300mM时，脂肪酶YCJ01催化拆分的效率逐渐下降，因此选取300～350mM作为最优的底物浓度，提高底物浓度，有利于扩大化生产。

基于以上原因，脂肪酶YCJ01能够在较高底物浓度下实现高效拆分N-羟甲基文斯内酯。拆分反应结束后，产物为(1R，4S)-N-羟甲基文斯内酰胺酯，ee_p值≥99.0％，底物为(1S，4R)-N-羟甲基文斯内酯，ee_s值≥99.2％，达到了很好的拆分效果。并且为以后使用脂肪酶YCJ01催化拆分手性物质提供了一种方法。最后，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。