一株适应于Vero细胞培养的赤羽病病毒疫苗株及其用途

摘要

本发明公开了一株适应于Vero细胞培养的赤羽病病毒疫苗株及其用途，所述疫苗株为分离得到的赤羽病病毒NM‑BS/01在Vero细胞上传代至第6代的病毒株，命名为NM‑BS/01‑F6株，其微生物保藏号是：CGMCC No.12343。该疫苗株可在Vero细胞上稳定培养，且毒力稳定。将该病毒株灭活后与适量佐剂混合制备得到赤羽病灭活疫苗，研究表明，该灭活疫苗可刺激小鼠产生较高水平的赤羽病病毒特异性中和抗体，并可维持较长时间，说明该灭活疫苗可作为赤羽病的候选疫苗，用于家畜赤羽病的防治。因此，本发明的提出为赤羽病的防治提供了一种新的，有效的技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一株赤羽病病毒疫苗株，特别涉及一株适应于Vero细胞培养的赤羽病病毒疫苗株，还涉及该疫苗株在制备赤羽病灭活疫苗中的用途，本发明属于兽医生物制品领域。

背景技术

赤羽病(Akabane disease)又名阿卡斑病，是由布尼安病毒科(Bunyaviridae)辛波病毒群(Simbu)的赤羽病病毒(Akabane disease virus，AKAV)引起的牛、羊的一种多型性传染病，以流产、早产、死胎和新生胎儿发生关节弯曲积水性无脑综合征(arthrogryposis-hydr aencephaly，AH综合征)为主要临床特征。该病毒最早由日本群马县赤羽村的金色库蚊和三带喙库蚊体内分离出，并将之命名为赤羽病病毒。目前除日本、澳大利亚以外，以色列(1969)、沙特阿拉伯、科威特、也门、巴林、土耳其、印度尼西亚(1979)、韩国(1982)和阿拉伯联合酋长国(1988)等国均有本病的报道记录。

该病是家畜疾病中传染率和发病率很高的一种疾病，主要通过带毒蚊、库蠓等吸血昆虫的叮咬进行传播，因此多发在蚊、蠓孳生猖獗的季节和地区，具有明显的季节性和地区性。带毒的蚊、蠓可凭借风力到达不同地区，再度叮咬易感动物引起更大规模的流行。研究表明，72％的雌蚊吸吮带毒动物血液后即可带毒，3-8d时病毒量达到最高值，通过叮咬家畜的黏膜和上皮组织传播病毒。此外，赤羽病毒还可通过母体垂直传播。

我国于上世纪90年代就已证实存在该病，并于陕西、内蒙古、湖南、河北、山东、上海等地区分布较广，且存在不同程度的流行。1994年，李昌琳等对我国陕西、内蒙古、湖南、河北、山东、上海等地进行了赤羽病病毒血清学调查，结果表明牛阳性率达39.18％，羊阳性率为12.66％。2002年，刘焕章等对我国某省8个牛场进行了赤羽病病毒血清学检测，其阳性率平均为35.3％，而爆发过该病的养牛场其抗体阳性率高达67.7％。由于我国幅员辽阔，地跨热带和温带，蚊和蠓等吸血昆虫的活动范围广、时间长，增加了我国防控赤羽病的难度。1996-1997年上海市曾暴发本病，发病牛场中流产、早产、产死胎和畸形胎约占20％-30％，给当地养牛业造成了巨大的经济损失。出于赤羽病对牛、羊养殖业的严重危害，我国现已将其列入二类动物传染病，是从国外进口牛、羊必须检测的七种疫病之一。

赤羽病病毒感染动物一般不出现明显临床症状，不易在感染早期发现，因此一旦暴发流行将给我国畜牧养殖业造成严重的经济损失。由于缺乏特效的治疗方法，疫苗接种仍是预防该病的最佳手段。目前，国外已开发出赤羽病活苗和灭活苗两种疫苗，而国内未见有成品疫苗销售，因此开发安全、有效、适合我国赤羽病流行现状的疫苗是行业和市场的迫切需求，具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株可用于制备赤羽病灭活疫苗的赤羽病病毒疫苗株及由该疫苗株制备得到的灭活疫苗。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明发明人从送检的感染赤羽病病毒的病料中分离出一株可在Vero细胞上稳定培养、毒力稳定的赤羽病病毒，命名为NM-BS/01，并对该分离株进行了理化特性、血清学、分子生物学鉴定。

NM-BS/01经过Vero细胞连续传代15次，取F3、F4、F6、F8、F10、F12、F15代病毒培养物测定病毒含量，分别为(单位：TCID₅₀/ml)：10⁴_.¹²、10⁵_.⁵⁷、10⁶_.⁷⁷、10⁷_.⁰、10⁶_.⁸⁰、10⁶_.⁴³、10⁷_.¹，表明该赤羽病病毒分离株可在Vero细胞上稳定传代，且可获得高滴度的病毒液。将-80℃保存的F6、F10和F15代病毒培养液以脑内接种的方式接种3-4日龄乳鼠，接种后第4天起出现不同程度神经症状，主要表现为离乳、肢体麻痹、四肢抽搐，接种后14天乳鼠全部死亡，表明该分离株具有较强的毒力，并且经过Vero细胞连续15次传代，其毒力变化较小，因此NM-BS/01可作为赤羽病疫苗检验性强毒的候选毒株。

在上述研究的基础上本发明提出了一株适应于Vero细胞培养的赤羽病病毒疫苗株，其为分离得到的赤羽病病毒NM-BS/01在Vero细胞上传代至第6代的病毒株，命名为NM-BS/01-F6，分类命名为赤羽病病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏日期为2016年05月31日，其微生物保藏号是：CGMCC No.12343。

利用NM-BS/01-F6代毒种(CGMCC No.12343)制备病毒悬液(病毒滴度不低于10⁵_.⁰个TCID₅₀/ml)，甲醛灭活后，与20％氢氧化铝胶佐剂按7～9∶1比例充分混匀，定量分装后即为赤羽病灭活疫苗。连续两次后肢皮下接种4～6周龄Balc/c小鼠，每只0.1ml，测定第二次接种后14、21、30、60、90日小鼠血清中赤羽病病毒中和抗体效价，分别为1：32、1：85、1：91、1：64、1：45。结果表明，灭活疫苗可刺激小鼠产生较高水平的赤羽病病毒特异性中和抗体，并可维持较长时间。第二次免疫后14日，脑内接种NM-BS/01-F6>50)，试验组小鼠攻毒保护率为100％，对照组小鼠全部死亡。

因此，进一步的，本发明还提出了所述的赤羽病病毒疫苗株(NM-BS/01-F6)在制备赤羽病灭活疫苗中的用途。

一种赤羽病灭活疫苗，其特征在于含有灭活后的所述的赤羽病病毒疫苗株(NM-BS/01-F6)及佐剂。

其中，优选的，灭活前，所含有的赤羽病病毒疫苗株的病毒滴度≥10⁵_.⁰TCID₅₀/ml。

更进一步的，本发明还提出了一种制备所述赤羽病灭活疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)取-80℃保存的本发明所述的赤羽病病毒疫苗株NM-BS/01-F6，并加入等体积量的无血清MEM培养基，接种到已长成Vero单层细胞的方瓶中，35℃，5％CO₂培养箱培养3～5日；

(2)待出现80％细胞病变时，以反复冻融的方式收获病毒液，过滤除去细胞碎片，检测病毒液中病毒滴度≥10⁵_.⁰TCID₅₀/ml；

(3)无菌条件下，向步骤(2)的病毒液中加入甲醛溶液，灭活；

(4)将灭活后的病毒液与佐剂充分混匀后，定量分装，密封，即得。

在所述的方法，优选的，步骤(3)中甲醛的加入量为病毒液总体积量0.2～0.4％，边加边摇，振摇20min，所述的灭活是指在37℃下灭活24小时，期间振摇2～3次，每次10min。

在所述的方法，优选的，步骤(4)中所述的佐剂为20％氢氧化铝胶佐剂，灭活后的病毒液与20％氢氧化铝胶佐剂的体积比为7～9∶1。

综上，本发明提供了一种可用于制备赤羽病灭活疫苗的赤羽病病毒疫苗株及由该疫苗株制备得到的灭活疫苗。使用本发明的灭活疫苗可刺激小鼠产生较高水平的赤羽病病毒特异性中和抗体，并可维持较长时间；二次免疫14日后，攻毒保护率为100％，说明该灭活疫苗可作为预防赤羽病的候选疫苗，用于家畜赤羽病的防治。本发明的提出为赤羽病的防治提供了一种新的，有效的技术手段。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1赤羽病病毒的分离和鉴定

1、赤羽病病毒的分离

取少量送检的感染赤羽病病毒的病料，加入适量的MEM(含青霉素、链霉素各1000U/mL)，在低温条件下研磨至糊状，按照1:10比例加入MEM制成悬液，再经过反复冻融3次后，于4℃、5000rpm离心10min，收集上层清液并以0.22μm的一次性滤器除菌，-80℃保存备用。

复苏冻存的Vero细胞，并传代培养，待细胞长成单层后，按培养体积10％的量接入-80℃保存上清液，置于35℃、5％CO₂培养箱中培养，观察细胞病变(CPE)的情况。如无CPE出现，则于培养的第5天以反复冻融的方式收取培养液(标记为：F1)后，以同样方式接入新培养的单层Vero细胞中进行盲传(标记为：F2)。细胞病变出现在盲传的第三代(F3)，主要表现为：细胞圆缩、破碎、脱落及颗粒增多等，将该病毒分离株命名为：NM-BS/01。

2、赤羽病病毒的理化特性鉴定

将该病毒分离株进行如下处理：60℃水浴作用30min；pH 3环境中4℃作用2h；480mL/L氯仿4℃作用10min；200mL/L乙醚4℃作用过夜；5％(终浓度)胰蛋白酶37℃作用l h；50μg/mL(终浓度)5-溴脱氧尿核苷(5’-BRDU)培养3-5d。结果表明，该分离株对乙醚、氯仿等有机溶剂和胰蛋白酶极为敏感，而对5-溴脱氧尿核苷、酸性环境和温度敏感度较低，说明该病毒为有包膜的RNA病毒。

3、赤羽病病毒的分子生物鉴定

利用总RNA提取试剂盒提取F3代细胞培养物中总RNA，而后反转录获得cDNA，并保存于-20℃。设计赤羽病病毒的鉴定引物，以保存的cDNA为模板进行基因扩增，凝胶电泳后可见明显的约524bp的目的条带，测序后进行序列比对证明该病毒分离株为赤羽病病毒。

4、赤羽病病毒的遗传进化分析

根据GenBank公布的赤羽病病毒衣壳蛋白(N蛋白)基因序列的保守区域设计引物(上游：5’-ATG GCA AAT CAA TTT ATT TTCA-3’；下游：5’-TTA GAT CTGAAT ACC AAA TTGA-3’)，由保存的cDNA中扩增该分离株病毒的衣壳蛋白基因，连pMD18-T载体后测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示，对应的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，并利用DNAStar软件对测序结果进行分析。结果表明，分离株N蛋白与已知赤羽病病毒的N蛋白的编码核苷酸序列同源性在92.7％-97.6％之间，氨基酸同源性在97.4％-99.1％之间，进一步证明该病毒分离株为赤羽病病毒。

5、赤羽病病毒的传代培养

待传代培养的Vero长成单层后，按培养体积5％的量接入-80℃保存的F3代病毒培养物，置于35℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞病变(CPE)达到80％左右时，以反复冻融的方式收取培养液，保存于-80℃(标记为：F4)。以同样的方法连续传代到F15代。分别取F3、F4、F6、F8、F10、F12、F15代病毒培养物，作10倍比稀释至10^-7，加入到已长成单层的96孔细胞培养板中，每孔100ul，每个稀释度8个重复，培养3～5d，每天观察CPE情况，以Reed-Muench法计算病毒TCID₅₀。各代病毒滴度分别为(单位：TCID₅₀/ml)：10⁴_.¹²、10⁵_.⁵⁷、10⁶_.⁷⁷、10⁷_.⁰、10⁶_.⁸⁰、10⁶_.⁴³、10⁷_.¹。表明该赤羽病病毒分离株可在Vero细胞上稳定传代，且可获得高滴度的病毒液，可作为赤羽病疫苗的候选毒株。

6、赤羽病病毒的乳鼠攻毒实验

将-80℃保存的F6、F10和F15代病毒培养液以8000×g离心30min去除细胞碎片，以脑内接种的方式接种3-4日龄乳鼠，每只10μL(10⁶TCID₅₀/ml)，同时设Vero细胞培养物为阴性对照，观察乳鼠死亡情况(接种后24小时内死亡乳鼠不计入死亡率)。结果显示，不同代次病毒培养物接种乳鼠后死亡率均为100％，接种乳鼠于第4天起出现不同程度神经症状，主要表现为离乳、肢体麻痹、四肢抽搐，接种后14天乳鼠全部死亡。

在无菌条件下，取不同代次病毒接种后死亡乳鼠的脑组织，参照本实施例1—3的方法进行病毒分离、鉴定。结果显示，在死亡的乳鼠脑组织中均可分离到赤羽病病毒，说明该分离株具有较强的毒力，并且经过Vero细胞连续15次传代，其毒力变化较小，可作为赤羽病疫苗检验性强毒的候选毒株。

获得的F6代赤羽病病毒，命名为NM-BS/01-F6，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期为2016年05月31日，其微生物保藏号是：CGMCC No.12343。

实施例2赤羽病灭活疫苗的制备及免疫效力实验

1、赤羽病灭活疫苗的制备

取-80℃保存的F6代赤羽病病毒毒种(CGMCC No.12343)，并加入等量的无血清MEM培养基，以吸附接毒的方式接种到已长成Vero单层细胞的方瓶中，每个方瓶接种1ml，35℃，5％CO₂培养箱培养3～5日，待出现80％细胞病变时，以反复冻融的方式收获病毒液，过滤除去细胞碎片，并将病毒滴度≥10⁵_.⁰TCID₅₀/ml的若干方瓶混合组成一批。无菌条件下加入病毒液总体积量0.2％的甲醛溶液，边加边摇，振摇20min，置37℃下灭活24小时，期间振摇2～3次，每次10min。将灭活病毒液与20％氢氧化铝胶佐剂按9∶1比例充分混匀后，定量分装，密封瓶口。

2、灭活疫苗的动物免疫试验

将制备好的赤羽病灭活疫苗后肢皮下接种4～6周龄Balc/c小鼠，每只0.1ml，间隔2周后再加强接种一次，第二次接种后14、21、30、60、90日尾静脉采血，测定血清中赤羽病病毒中和抗体效价。经测定，血清中和抗体效价平均值分别为1：32、1：85、1：91、1：64、1：45。结果表明，灭活疫苗可刺激小鼠产生较高水平的赤羽病病毒特异性中和抗体，并可维持较长时间。

3、攻毒保护试验

第二次接种后14日，随机选取免疫组和对照组小鼠各10只，脑内接种NM-BS/01-F6>50)，连续观察14日。结果表明，免疫组小鼠无明显临床症状，攻毒保护率为100％；而对照组小鼠于攻毒后第4日起出现精神萎靡、食欲不振或废绝等症状，身体逐步消瘦，14日全部死亡。

综上所述，说明该灭活疫苗可作为赤羽病候选疫苗，赤羽病病毒NM-BS/01-F6可作为赤羽病候选疫苗株。