一系列具有抗菌活性的螺内酯型对映贝壳杉烷衍生物

摘要

本发明涉及天然药物及药物化学领域，具体涉及一系列具有抗菌活性的螺内酯型对映贝壳杉烷衍生物及其制备方法和应用，所述的螺内酯型对映贝壳杉烷衍生物具有如下结构：其中，R

说明书

技术领域

本发明涉及天然药物及药物化学领域，具体涉及一系列螺内酯型对映贝壳杉烷衍生物。本发明公开了这些化合物的制备方法及在制备抗菌药物中应用。

背景技术

螺内酯型对映贝壳杉烷衍生物结构复杂而新颖，活性优良。但对其生物活性研究主要集中在抗肿瘤方向，其他相关领域几乎没有报道。

本发明以冬凌草甲素为先导化合物，设计并合成了螺内酯型对映贝壳杉烷衍生物，并测试了合成衍生物在抗菌方面的生物活性。

发明内容

发明要解决的技术问题是寻找抗菌活性好的螺内酯型对映贝壳杉烷衍生物及其药学上可接受的盐，并进一步提供一种药物组合物。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明所述的螺内酯型对映贝壳杉烷衍生物及其药学上可接受的盐具有如下的结构通式：

其中，R₁为氧代、含有1-8个碳原子的脂肪酰基、卤素取代含有1-8个碳原子的脂肪酰基、含有6-12个碳原子的芳香酰基或卤素取代芳香酰基；R₂为含有1-8个碳原子的烷基，3-8个碳原子的环烷基，含有5-12个碳原子的芳香环或卤代芳香环、5-12个碳原子芳杂环或卤代芳杂环，所述的芳杂环中包含1-3个N、O、或S的杂原子。

优选地，R₁为氧代、含有1-8个碳原子的脂肪酰基、卤素取代含有1-8个碳原子的脂肪酰基；R₂为含有1-8个碳原子的烷基，3-8个碳原子的环烷基，含有6个碳原子的芳香环或卤代芳香环、5-12个碳原子芳杂环或卤代芳杂环，所述的芳杂环中包含1-3个N原子。

更优选地，R₁为氧代或乙酰基；R₂为甲基、4-氟苯基、3-氟苯基、2-氟苯基、2,3,4,5-四氟苯基或4-三氟甲基苯基。

本发明还具体公开了结构如下所示的螺内酯型对映贝壳杉烷衍生物及其药学上可接受的盐：

所涉及的化合物名称为：

ent-1,6,7,15-四氧代-7,20-内酯-14β-O-乙酰基-6,7-开环-16-贝壳杉烯(4a)

ent-1,6,7,15-四氧代-7,20-内酯-14β-O-(4-氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(4b)

ent-1,6,7,15-四氧代-7,20-内酯-14β-O-(3-氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(4c)

ent-1,6,7,15-四氧代-7,20-内酯-14β-O-(2-氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(4d)

ent-1,6,7,15-四氧代-7,20-内酯-14β-O-(2,3,4,5-四氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(4e)

ent-1α-O-乙酰基-6,7,15-三氧代-7,20-内酯-14β-O-(4-三氟甲基苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(4f)

ent-1α-O-乙酰基-6,7,15-三氧代-7,20-内酯-14β-O-乙酰基-6,7-开环-16-贝壳杉烯(9a)

ent-1α-O-乙酰基-6,7,15-三氧代-7,20-内酯-14β-O-(4-氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(9b)

ent-1α-O-乙酰基-6,7,15-三氧代-7,20-内酯-14β-O-(3-氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(9c)

ent-1α-O-乙酰基-6,7,15-三氧代-7,20-内酯-14β-O-(2-氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(9d)

ent-1α-O-乙酰基-6,7,15-三氧代-7,20-内酯-14β-O-(2,3,4,5-四氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(9e)

ent-1α-O-乙酰基-6,7,15-三氧代-7,20-内酯-14β-O-(4-氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(9f)

本发明的衍生物可用下列方法制备得到：

制备得到的螺内酯型对映贝壳杉烷衍生物及其药学上可接受的盐具有如下的结构通式：

其中，R₁为氧代、含有1-8个碳原子的脂肪酰基、卤素取代含有1-8个碳原子的脂肪酰基、含有1-12个碳原子的芳香酰基或卤素取代芳香酰基；R₂为含有1-8个碳原子的烷基，3-8个碳原子的环烷基，含有5-12个碳原子的芳香环或卤代芳香环、5-12个碳原子芳杂环或卤代芳杂环，所述的芳杂环中包含1-3个N、O、或S的杂原子。

优选地，R₁为氧代、含有1-8个碳原子的脂肪酰基、卤素取代含有1-8个碳原子的脂肪酰基；R₂为含有1-8个碳原子的烷基，3-8个碳原子的环烷基，含有6个碳原子的芳香环或卤代芳香环、5-12个碳原子芳杂环或卤代芳杂环，所述的芳杂环中包含1-3个N原子。

更优选地，R₁为氧代或乙酰基；R₂为甲基、4-氟苯基、3-氟苯基、2-氟苯基、2,3,4,5-四氟苯基或4-三氟甲基苯基。

冬凌草甲素(1)用琼斯试剂选择性地将1-位羟基氧化为酮羰基得到化合物(2)，将化合物2溶解于四氢呋喃中，加入碳酸钠和四乙酸铅，室温搅拌。TLC监测反应，约10min，反应完全，过滤，蒸除四氢呋喃，加入水并用二氯甲烷萃取三次，合并有机层，再用饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到1-位羰基螺内酯型6,7-开环冬凌草甲素(3)，粗产物不用经过柱层析可直接用于下一步衍生化反应。将螺内酯型化合物(3)与不同的酸(乙酸、4-氟苯甲酸、3-氟苯甲酸、2-氟苯甲酸、2,3,4,5-四氟苯甲酸或4-三氟甲基苯甲酸)在DMAP，EDCI作用下，反应生成1-位羰基螺内酯型6,7-开环冬凌草甲素14-位衍生物4a-f。由冬凌草甲素(1)出发，经过7,14-位丙酮叉保护(5)，1-位乙酰化(6)，再脱丙酮叉保护，得到1-O-乙酰基冬凌草甲素即毛栲利素(7)，将其溶解于四氢呋喃中，加入碳酸钠和四乙酸铅，室温搅拌，TLC监测反应。约10min，反应完全，过滤，蒸除四氢呋喃，加入水并用二氯甲烷萃取三次，合并有机层，再用饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥有机层，过滤，浓缩，得到1-位乙酰氧基螺内酯型6,7-开环冬凌草甲素(8)，粗产物不用经过柱层析可直接用于下一步衍生化反应。将螺内酯型化合物(8)与不同的酸在DMAP、EDCI作用下，反应生成1-位乙酰氧基螺内酯型6,7-开环冬凌草甲素14-位衍生物9a-f。

所述的酸为：乙酸、4-氟苯甲酸、3-氟苯甲酸、2-氟苯甲酸、2,3,4,5-四氟苯甲酸、4-三氟甲基苯甲酸。

药理试验证明，本发明的螺内酯型对映贝壳杉烷衍生物具有很好的抗菌作用，可以用于进一步制备抗菌药物。

具体实施方式：

实施例1

ent-1,6,7,15-四氧代-7,20-内酯-14β-O-乙酰基-6,7-开环-16-贝壳杉烯(4a)

将冬凌草甲素72mg(0.2mmol)溶解于丙酮中，加入琼斯试剂氧化，至不再产生新的斑点，过滤蒸干溶剂，得1-位氧化冬凌草甲素2。将100mg化合物2(0.28mmol)溶于约20ml四氢呋喃中，加入240mg的Na₂CO₃(2.26mmol)和425mg的四乙酸铅(1mmol)，室温搅拌反应约10min，TLC监测反应，待反应完全，过滤，收集滤液。减压蒸除四氢呋喃，加入约15ml水，用二氯甲烷萃取三次，每次10ml，合并有机相，再用饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇＝300:1)，得到淡黄色固体3。将72mg1-位氧化螺内酯型冬凌草甲素衍生物3(0.2mmol)溶于10ml无水二氯甲烷中，加入相应的酸(0.3mmol)、EDCI(93mg，0.6mmol)、催化量的DMAP，室温搅拌12h。TLC监测反应，待反应完全或不继续进行时，停止反应。水洗后分液，有机相用饱和食盐水洗，再用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝500:1至100:1)，得到目标化合物，产率69％:mp.96-97℃；IR(KBr)υ_max>–1；¹H>3,300MHz),δ(ppm):9.85(1H,s,-CHO),6.21(1H,s,17-CH₂),5.72(1H,s,14-CH),5.62(1H,s,17-CH₂),4.95,4.73(each>A＝J_B＝11.7Hz,20-CH₂),3.14(1H,d,J＝9.3Hz,13-CH)；ESI>4]⁺,403.1[M+H]⁺,437.5[M+Cl]^-；HR-MS(ESI,M+H)m/z:calcd>22H₂₇O₇:403.1751,found>

实施例2

ent-1,6,7,15-四氧代-7,20-内酯-14β-O-(4-氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(4b)

白色粉末状固体,产率12％:mp.244-246℃；IR(KBr)υ_max>–1；¹H>3,500MHz),δ(ppm):9.90(1H,s,-CHO),7.97(2H,m,Ar-H),7.07(2H,m,Ar-H),6.31(1H,s,17-CH₂),6.16(1H,s,14-CH),5.63(1H,s,17-CH₂),4.88,4.50(each>A＝J_B＝12.5Hz,20-CH₂),3.34(1H,d,J＝7.5Hz,13-CH)；¹³C>3,125MHz),δ(ppm):210.12,204.03,198.11,166.15,163.87,147.10,132.05,127.31,125.90,120.98,115.72,74.61,67.41,60.70,59.92,52.20,45.23,41.53,36.56,33.21,30.34,29.16,23.90,17.94；ESI>+,500.1[M+NH₄]⁺；HR-MS(ESI,M+H)m/z:calcd>27H₂₈FO₇:483.1814,found>

实施例3

ent-1,6,7,15-四氧代-7,20-内酯-14β-O-(3-氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(4c)

白色粉末状固体,产率14％:mp.118-120℃；IR(KBr)υ_max>–1；¹H>3,500MHz),δ(ppm):9.88(1H,s,-CHO),7.73(1H,m,Ar-H),7.61(1H,m,Ar-H),7.37(1H,m,Ar-H),7.23(1H,m,Ar-H),6.32(1H,s,17-CH₂),6.18(1H,s,14-CH),5.65(1H,s,17-CH₂),4.88,4.51(each>A＝J_B＝12.5Hz,20-CH₂),3.33(1H,d,J＝7.5Hz,13-CH),2.64(1H,m,12-CH₂),2.53(1H,m,12-CH₂),2.46(2H,m,11-CH₂),1.86(1H,m,9-CH),1.80(2H,m,2-CH₂),1.72(2H,m,3-CH₂),1.48(1H,m,5-CH₂),1.27(3H,s,18-CH₃),1.25(3H,s,19-CH₃)；MS>+,500.2[M+NH₄]⁺,505.2[M+Na]⁺,521.1[M+K]⁺；HR-MS(ESI,M+H)m/z:calcd>27H₂₈FO₇:483.1814,found483.1803。

实施例4

ent-1,6,7,15-四氧代-7,20-内酯-14β-O-(2-氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(4d)

白色粉末状固体,产率13％:mp.206-208℃；IR(KBr)υ_max>–1；¹H>3,500MHz),δ(ppm):9.87(1H,s,-CHO),7.85(1H,m,Ar-H),7.50(1H,m,Ar-H),7.15(1H,m,Ar-H),7.07(1H,m,Ar-H),6.29(1H,s,17-CH₂),6.19(1H,s,14-CH),5.62(1H,s,17-CH₂),4.90,4.50(each>A＝J_B＝12.3Hz,20-CH₂),3.33(1H,d,J＝7.5Hz,13-CH),2.64(1H,m,12-CH₂),2.53(1H,m,12-CH₂),2.46(2H,m,11-CH₂),1.89(1H,m,9-CH),1.86(2H,m,2-CH₂),1.68(2H,m,3-CH₂),1.48(1H,m,5-CH₂),1.26(3H,s,18-CH₃),1.25(3H,s,19-CH₃)；¹³C>3,125MHz),δ(ppm):210.16,204.13,198.13,166.07,163.66,162.76,160.81,147.08,131.68,125.35,121.23,120.61,115.64,74.90,67.44,60.58,59.93,52.23,45.26,41.49,36.46,33.26,30.14,29.19,23.93,17.94；ESI>+,500.3[M+NH₄]⁺；HR-MS(ESI,M+H)m/z:calcd>27H₂₈FO₇:483.1814,found>

实施例5

ent-1,6,7,15-四氧代-7,20-内酯-14β-O-(2,3,4,5-四氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(4e)

白色粉末状固体,产率31％:mp.82-84℃；IR(KBr)υ_max>–1；¹H>3,300MHz),δ(ppm):9.87(1H,s,-CHO),7.52(1H,m,Ar-H),6.30(1H,s,17-CH₂),5.65(1H,s,17-CH₂),4.90,4.58(each>A＝J_B＝12.0Hz,20-CH₂),3.28(1H,d,J＝6.9Hz,13-CH),2.64(1H,m,12-CH₂),2.53(1H,m,12-CH₂),2.46(2H,m,11-CH₂),1.87(1H,m,9-CH),1.77(2H,m,2-CH₂),1.53(2H,m,3-CH₂),1.29(1H,m,5-CH₂),1.26(3H,s,18-CH₃),1.22(3H,s,19-CH₃)；MS>+；HR-MS(ESI,M+H)m/z:calcd>27H₂₅F₄O₇:537.1531,found537.1520。

实施例6

ent-1α-O-乙酰基-6,7,15-三氧代-7,20-内酯-14β-O-(4-三氟甲基苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(4f)

将100mg冬凌草甲素1(0.27mmol)溶于3ml无水丙酮中，加入0.4ml的2,2-二甲氧基丙烷和催化量的对甲基苯磺酸，在氮气保护条件下，回流反应约1h，反应液冷却至室温后，加入10ml饱和NaHCO₃溶液，用二氯甲烷萃取三次，每次10ml，合并有机相，用饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，硅胶柱层析(石油醚﹕丙酮＝3﹕1)，得5白色固体94mg。将80mg化合物5(0.20mmol)溶于约10ml无水二氯甲烷中，加入0.3ml乙酸酐和催化量的DMAP，室温条件下搅拌反应1h，TLC监测反应，待反应完全，停止反应。用饱和食盐水洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，粗品6直接用于下一步反应。将80mg化合物6(0.2mmol)溶解于15ml四氢呋喃中，加入15ml的10％盐酸水溶液，室温搅拌1h。蒸除四氢呋喃，用二氯甲烷萃取三次，每次约10ml，合并有机相，饱和食盐水洗有机相两次，无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，硅胶柱层析(石油醚∶丙酮＝2﹕1)，得白色固体7。将100mg的1-位乙酰化冬凌草甲素(0.28mmol)溶于约20ml四氢呋喃中，加入240mg的Na₂CO₃(2.26mmol)和425mg四乙酸铅(1mmol)，室温搅拌10min，TLC监测反应，待反应完全，过滤，收集滤液。减压蒸除四氢呋喃，加入约15ml水，二氯甲烷萃取三次，每次10ml，合并有机相。再用饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇＝300:1)，得到96mg淡黄色粉末8。将80mg>max>–1；¹H>3,500MHz),δ(ppm):9.85(1H,s,-CHO),8.04(1H,d,J＝8.1Hz,Ar-H),7.80(1H,d,J＝8.1Hz,Ar-H),7.65(1H,d,J＝8.1Hz,Ar-H),7.17(1H,d,J＝8.1Hz,Ar-H),6.29(1H,s,17-CH₂),6.22(1H,s,14-CH),5.61(1H,s,17-CH₂),4.88,4.50(each>A＝J_B＝12.5Hz,20-CH₂),3.32(1H,d,J＝7.5Hz,13-CH),2.62(1H,m,12-CH₂),2.10(1H,m,12-CH₂),1.91(2H,m,11-CH₂),1.72(1H,m,9-CH),1.69(2H,m,2-CH₂),1.57(2H,m,3-CH₂),1.27(1H,m,5-CH₂),1.25(3H,s,18-CH₃),1.24(3H,s,19-CH₃)；¹³C>3,125MHz),δ(ppm):210.14,204.16,198.08,166.10,163.78,133.12,132.76,130.14,129.95,125.81,121.32,75.00,67.45,60.49,59.97,52.29,45.32,41.49,36.52,33.27,30.36,29.27,23.85,17.94；ESI>+,550.3[M+NH₄]⁺；HR-MS(ESI,M+H)m/z:calcd>28H₂₈F₃O₇:533.1782,found>

实施例7

ent-1α-O-乙酰基-6,7,15-三氧代-7,20-内酯-14β-O-乙酰基-6,7-开环-16-贝壳杉烯(9a)

白色粉末状固体,产率69％:mp.128-130℃；IR(KBr)υ_max>–1；¹H>3,300MHz),δ(ppm):9.79(1H,d,J＝4.2Hz,-CHO),6.25(1H,s,17-CH₂),5.90(1H,s,14-CH),5.63(1H,s,17-CH₂),5.22,5.12(each>A＝J_B＝12.3Hz,20-CH₂),4.66(1H,m,1-CH),3.09(1H,d,J＝9.0Hz,13-CH),2.04(3H,s,-CH₃),1.17(3H,s,-CH₃),1.09(3H,s,-CH₃),1.03(3H,s,-CH₃)；ESI>4]⁺,447.2[M+H]⁺；HR-MS(ESI,M+H)m/z:calcd>34H₃₂O₈:447.2013,found>

实施例8

ent-1α-O-乙酰基-6,7,15-三氧代-7,20-内酯-14β-O-(4-氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(9b)

白色粉末状固体,产率18％:mp.221-223℃；¹H>3,500MHz),δ(ppm):9.81(1H,s,-CHO),7.95(2H,m,Ar-H),7.06(2H,m,Ar-H),6.30(1H,s,17-CH₂),6.15(1H,s,14-CH),5.63(1H,s,17-CH₂),5.09,4.86(each>A＝J_B＝12.0Hz,20-CH₂),3.26(1H,d,J＝8.0Hz,13-CH)；ESI>+；HR-MS(ESI,M+H)m/z:calcd>29H₃₂FO₈:527.2076,found>

实施例9

ent-1α-O-乙酰基-6,7,15-三氧代-7,20-内酯-14β-O-(3-氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(9c)

白色粉末状固体,产率19％:mp.116-117℃；¹H>3,500MHz),δ(ppm):9.78(1H,s,-CHO),7.70(1H,m,Ar-H),7.64(1H,m,Ar-H),7.33(1H,m,Ar-H),7.25(1H,m,Ar-H),6.33(1H,s,17-CH₂),6.17(1H,s,14-CH),5.62(1H,s,17-CH₂),5.07,4.87(each>A＝J_B＝12.5Hz,20-CH₂),3.23(1H,d,J＝7.0Hz,13-CH)；MS>+；HR-MS(ESI,M+H)m/z:calcd>29H₃₂FO₈:527.2076,found>

实施例10

ent-1α-O-乙酰基-6,7,15-三氧代-7,20-内酯-14β-O-(2-氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(9d)

白色粉末状固体,产率17％:mp.203-204℃；¹H>3,500MHz),δ(ppm):9.82(1H,s,-CHO),7.79(1H,m,Ar-H),7.53(1H,m,Ar-H),7.12(1H,m,Ar-H),7.11(1H,m,Ar-H),6.29(1H,s,17-CH₂),6.19(1H,s,14-CH),5.64(1H,s,17-CH₂),4.98,4.85(each>A＝J_B＝12.0Hz,20-CH₂),3.26(1H,d,J＝7.5Hz,13-CH)；ESI>+；HR-MS(ESI,M+H)m/z:calcd>29H₃₂FO₈:527.2076,found>

实施例11

ent-1α-O-乙酰基-6,7,15-三氧代-7,20-内酯-14β-O-(2,3,4,5-四氟苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(9e)

白色粉末状固体,产率27％:mp.108-110℃；¹H>3,500MHz),δ(ppm):9.80(1H,s,-CHO),7.49(1H,m,Ar-H),6.31(1H,s,17-CH₂),5.64(1H,s,17-CH₂),5.17,4.98(each>A＝J_B＝12.5Hz,20-CH₂),3.25(1H,d,J＝7.0Hz,13-CH)；MS>+；HR-MS(ESI,M+H)m/z:calcd>29H₂₉F₄O₈:581.1793,found>

实施例12

ent-1α-O-乙酰基-6,7,15-三氧代-7,20-内酯-14β-O-(4-三氟甲基苯甲酰基)-6,7-开环-16-贝壳杉烯(9f)

淡黄色粉末状固体,产率28％:mp.226-228℃；IR(KBr)υ_max>–1；¹H>3,300MHz),δ(ppm):9.79(1H,s,-CHO),8.06(2H,m,Ar-H),7.67(2H,m,Ar-H),6.32(1H,s,17-CH₂),5.98(1H,s,14-CH),5.66(1H,s,17-CH₂),5.14,4.76(each>A＝J_B＝12.0Hz,20-CH₂),3.13(1H,d,J＝8.4Hz,13-CH),1.26(3H,s,18-CH₃),1.22(3H,s,19-CH₃)；¹³C>3,75MHz),δ(ppm):202.36,170.44,131.35,128.71,121,78,74.55,73.29,66.39,62.59,45.78,42.29,39.45,32.90,29.68,21.43,17.46；MS>+；HR-MS(ESI,M+NH₄)m/z:calcd>30H₃₅F₃NO₈:577.2044,found>

实施例13：

下面是本发明部分化合物的药理实验结果：

实验设备与试剂

仪器 超净工作台(苏净集团安泰公司)

灭菌锅(日本株式会社平山制作所)

恒温培养箱(Thermo electron Corporation)

恒温培养震荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)

磁力搅拌器(北京欣维尔)

试剂 均购置于禹王和莱博试剂公司

菌株 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(CMCC 63501)，金黄色

葡萄球菌Staphylococcus aureus(ATCC 29213)

实验方法

体外抑菌活性实验方法

分别配制枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的菌悬液，首先菌种活化传代培养至F2代，用灭菌蒸馏水和培养基稀释菌悬液分别至1×10⁷CFU/mL，备用。氯霉素用作阳性对照药，将待测化合物和阳性对照药均配置成1mg/mL浓度，无菌条件下，将不同浓度药物及菌悬液依次加入96孔板中，同时设立阳性对照组和溶媒空白对照组，之后置37℃培养箱中培养18-24h，观察有无菌落生长，以未见细菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。

实验结果

表1 实施例对2种菌株抑制活性的MIC值(μg/ml)

样品B.subtilisS.aureus实施例11664实施例228实施例324实施例444实施例53232实施例63264实施例71632实施例844实施例928实施例1048实施例113264实施例121632氯霉素84