一种产乙醇基因工程蓝藻培养体系乙醇消耗菌的污染防治方法

摘要

本发明公开了一种产乙醇基因工程蓝藻培养体系乙醇消耗菌的污染防治方法，属于生物能源技术领域以及藻类养殖技术领域。本发明要解决基因工程蓝藻生产乙醇过程中针对乙醇消耗菌的生物污染控制的技术问题。本发明的方法是在产乙醇基因工程蓝藻培养过程中，通过碳酸氢钠碳源捕获培养体系，控制培养过程中pH值逐渐升高至11.0并维持在11.0±0.5的高pH策略，抑制培养过程中乙醇消耗菌的繁殖和乙醇消耗。本发明将对蓝藻规模化培养污染控制体系提供借鉴，对于基因工程蓝藻生产生物液体燃料具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物能源技术领域以及藻类养殖技术领域；具体涉及一种在产乙醇基因工程蓝藻培养体系中针对乙醇消耗菌的污染防治方法。

背景技术

全球范围内的环境污染以及潜在的能源危机使得研发可持续绿色能源补充或替代日益枯竭的石化能源变得更为迫切和重要。作为最早商业化的生物液体燃料，生物乙醇因其高辛烷值，高汽化热以及低蒸汽压的特性被广泛的接受并应用于汽油或石油的替代品或辅助品(Thangavelu,S.K.,A.Ahmed,and F.N.Ani,Review on bioethanol as alternative fuel forspark ignition engines.Renewable&Sustainable Energy Reviews,2016.56:p.820-835)。目前工业化生产的生物乙醇绝大多数是以粮食作物为原料的，从长远来看具有原料供应不足的局限，不可持续。以木质纤维素为原料的第二代生物乙醇，解决了原料供应量的问题，但是其经济型也受限于原料预处理以及纤维素酶水解过程的成本和能源消耗。

蓝藻是一种光合自养微生物，具有结构简单，光合效率高，生长速率快以及基因工程操作简便等特性(Gudmundsson,S.and J.Nogales,Cyanobacteria as photosyntheticbiocatalysts:a systems biology perspective.Molecular Biosystems,2015.11(1):p.60-70)。利用蓝藻转化光能和二氧化碳直接生产乙醇是一种潜在的高效可持续性的乙醇生产路线。通过基因工程改造，蓝藻乙醇产量从0.46g/L提高到5.5g/L，同时生产强度达到212mg/L/day(Gao ZX,Zhao H,Li ZM,Tan XM,Lu XF:Photosynthetic production of ethanol from carbondioxide in genetically engineered cyanobacteria.Energy&Environmental Science 2012,5(12):p.9857-9865)。目前有关蓝藻乙醇的研究都集中在基因工程菌株的构建以及实验室规模的培养条件优化，要实现蓝藻乙醇的工业化应用，其规模远远大于传统微生物发酵，其培养不可能采用与传统发酵一样的无菌体系，实现严格培养无菌化及污染控制非常困难，且藻类培养过程中污染的种类和种群数量会因藻种和培养环境的不同而不同，甚至还会随着培养阶段不同而发生变化。因此，敌害污染及其控制是决定大规模工程化培养成败的关键。

在产乙醇基因工程蓝藻的放大培养的研究过程中，生物污染严重影响了培养过程中的产物乙醇的积累，甚至导致乙醇完全被消耗。因此，要实现产乙醇基因工程蓝藻大规模培养体系下高效稳定的生产乙醇，建立严格的污染控制体系势在必行。

发明内容

本发明要解决产乙醇基因工程蓝藻培养生产乙醇的过程中消耗产物乙醇生物污染的技术问题；提供了一种产乙醇基因工程蓝藻培养体系中乙醇消耗菌的污染防治方法。

为解决上述技术问题，本发明的方法是在光反应器内，产乙醇基因工程蓝藻液体培养过程中，初期采用碳酸氢钠为主要碳源，当培养液pH值随着藻细胞的生长及碳源的消耗自然升高至11.0时，控制pH值维持在11.0±0.5，使藻细胞生长的同时乙醇逐渐积累。

其中，所述的蓝藻培养体系不经灭菌处理。

所述的碳酸氢钠初始值为(60-240)mmol/L。

所述的控制pH值维持在11.0±0.5，是通过CO₂气体通入培养体系调节。

本发明首次针对基因工程蓝藻胞外产物消耗污染菌提出控制策略，抑制污染水平，恢复胞外产物生产强度，实现不灭菌培养体系中蓝藻的培养并合成有用化学品。

本发明为控制污染开发的高pH控制策略所应用的碳酸氢钠碳源捕获体系是首次应用于pH 11.0的环境中，控制pH的同时，降低碳源捕获成本提高碳源捕获效率。

附图说明

图1是具体实施例一室内800ml玻璃柱式光反应器中对照组5％CO₂条件下基因工程蓝藻培养过程曲线包括OD₇₃₀值，pH值和乙醇浓度变化图；

图2是具体实施例一室内800ml玻璃柱式光反应器中高pH控制条件下基因工程蓝藻培养过程曲线包括OD₇₃₀值，pH值和乙醇浓度变化图；

图3是具体实施例二室外8L薄膜挂袋式光反应器中对照组5％CO₂条件下基因工程蓝藻培养过程曲线包括OD₇₃₀值，pH值和乙醇浓度变化图；

图4是具体实施例二室外8L薄膜挂袋式光反应器中高pH控制条件下基因工程蓝藻培养过程曲线包括OD₇₃₀值，pH值和乙醇浓度(高pH控制以及5％CO₂条件)变化图。

具体实施方式

实施例一：本实施方式中产乙醇基因工程蓝藻培养体系乙醇消耗菌的污染防治方法是在室内玻璃柱式光反应器中应用。

具体方法为在800ml玻璃柱式光反应器中，加入600ml初始碳酸氢钠浓度180mmol/L的BG11培养基，不经高温灭菌直接接入基因工程集胞藻，在光强100μE>-2s^-1，温度30℃条件下进行培养，培养液中pH值随着藻细胞利用碳酸氢钠生长逐渐升高至11.0时，通入CO₂气体调节pH值维持在11.0±0.5，藻细胞生长的同时产物乙醇逐渐积累。

基因工程蓝藻为集胞藻PCC 6803产乙醇突变株，所述突变株为高政绪等在2012年5月在Energy&Environmental Science杂志上发表公开的(Gao ZX,Zhao H,Li ZM,Tan XM,Lu XF:Photosynthetic production ofethanolfrom carbon dioxide in genetically engineeredcyanobacteria.Energy&Environmental Science 2012,5(12):9857-9865)。

以5％CO₂条件为对照实验，培养条件为光强100μE>-2s^-1，温度30℃，5％CO₂通气量为0.1vvm。由图1可知，对照组5％CO₂条件下，培养过程pH值在中性范围内(6.5-7.5)变化，藻细胞生长正常，但产物乙醇从培养第1天开始，逐渐下降，第4天就降至0g/L。

由图2可知，实验组初始添加180mmol/L碳酸氢钠，环境pH值逐渐升高至11.0并通过通入CO₂维持在11.0±0.5。高pH环境下的生长速率低于中性pH，但产物乙醇的积累未受影响，培养终了未发现被消耗降低的情况，乙醇产量逐渐积累至0.6g/L。这一结果证明在光强100μE>-2s^-1，温度30℃的室内培养环境下，本实施例记载的方法能够有效控制蓝藻液体培养体系中乙醇消耗菌的生长，使整个培养过程中乙醇产量逐渐积累。

实施例二：本实施方式中产乙醇基因工程蓝藻培养体系乙醇消耗菌的污染防治方法是在室外薄膜挂袋式光反应器中应用。

在8L薄膜挂袋式光反应器中，加入6L自来水配制不经高温灭菌的初始碳酸氢钠浓度为180mmol/L的BG11培养基，接入基因工程蓝藻，在室外自然光强和温度条件下进行培养，培养液中pH值随着藻细胞利用碳酸氢钠作为碳源生长逐渐升高至11.0时，通入CO₂气体调节pH值维持在11.0±0.5，藻细胞生长的同时产物乙醇逐渐积累。

基因工程蓝藻和具体实施例一中相同。

以5％CO₂条件为对照实验。培养条件为自然光强和温度，通气量为0.1vvm。

图3可知，对照组5％CO₂条件下，培养过程pH值在中性范围内(7-8)变化，藻细胞生长正常，但产物乙醇从培养第5天开始，逐渐下降，最终降至0.07g/L，其中培养液中乙醇为0g/L，乙醇冷凝瓶中0.07g/L。

图4可知，实验组初始添加180mmol/L碳酸氢钠，培养液环境pH值随着藻细胞利用碳源生长逐渐升高至11.0，通过CO₂调节维持在11.0±0.5，高pH环境下的生长速率低于中性pH，但产物乙醇的积累未受影响，培养终了未发现被消耗降低的情况，乙醇产量逐渐积累至0.95g/L。这一结果证明在自然光强和自然温度的室外培养环境下，本实施例记载的方法能够有效控制培养体系中乙醇消耗菌的生长，使整个培养过程中乙醇产量逐渐积累。