一种全面下调棉花番茄红素环化酶基因的表达载体及应用

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种全面下调棉花番茄红素环化酶(Lyc)基因的表达载体及其应用。本发明的技术方案是分别从5对棉花Lyc基因中选取一段编码序列串联构建RNAi元件，通过转基因方法在棉花中转录该元件，最终达到同时下调5对Lyc基因和调控棉花体内类胡萝卜素合成的目的。本发明的RNAi元件及载体可用于调控棉花类胡萝卜素含量和种类。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种能全面下调棉花番茄红素环化酶基因，调节棉花类胡萝卜素合成的表达载体及其应用。

背景技术

类胡萝卜素是普遍存在于植物、动物和微生物中的一类含40个碳原子骨架的萜类物质。由于含有共轭双键，类胡萝卜素一般呈现黄色和红色，是植物重要的光合色素和光保护剂，同时也是植物果实、花等的主要成色因子。前人研究表明，利用基因工程技术在植物中调控类胡萝卜素合成酶基因的表达，可以改变类胡萝卜素途径的流向，有目的地改变植物体内类胡萝卜素的最终含量和成分，进而达到改良作物色彩和营养品质的目的。如在水稻胚乳、油菜种子和马铃薯块茎中上调类胡萝卜素合成酶基因，成功提高了这些农产品的β-胡萝卜素水平和营养品质^1～4。棉花是世界上需求量最大的天然纤维作物，同时也是重要的油料作物。利用基因工程技术改变棉花组织(如种子和纤维)中的类胡萝卜素合成，是棉花纤维色彩和棉籽营养品质改良重要手段，具有广阔的应用前景。

番茄红素是类胡萝卜素途径中合成的第一个红色色素，是成熟番茄、芒果等的主要色素。同时番茄红素是类胡萝卜素的重要中间产物，番茄红素在番茄红素环化酶(Lyc)的催化下分子末端发生环化，进而合成各种类胡萝卜素(如叶黄素、β-胡萝卜素等)。理论上，下调Lyc基因的表达可以抑制或阻断番茄红素转化为其他类胡萝卜素，从而在植物组织中降低下游类胡萝卜素的合成，促进番茄红素的积累。目前，尚未见下调Lyc基因的表达进而有效调控类胡萝卜素合成的报道。棉花全基因组测序表明，二倍体棉(雷蒙德氏棉，DD和亚洲棉，AA)基因组包含5个Lyc基因，而异源四倍体的陆地棉(AADD)保留了来源于不同亚基因组的5对共10个Lyc基因(表1)。根据种名+基因名+基因组的命名原则，将陆地棉的Lyc基因分别命名为GhLyc1A/D、GhLyc2A/D、GhLyc3A/D、GhLyc4A/D和GhLyc5A/D。序列比对表明，来源于不同亚基因组的同对基因(直系同源基因)序列高度相似(相同核苷酸>98％)，而不同的旁系同源基因间的序列相似度较低(35～78％)。存在多个且序列差异较大的Lyc基因增加了在棉花中抑制番茄红素转化为其他类胡萝卜素的难度。本发明针对棉花的Lyc基因设计了能够靶标多个棉花Lyc基因的RNAi元件(LycRNAi)。棉花转基因分析表明，该元件能全面下调陆地棉10个Lyc基因的表达，并抑制类胡萝卜素的合成。

表1不同种棉花的Lyc基因

发明内容

本发明的技术创新点是设计了能同时靶标10个棉花Lyc基因，并显著抑制番茄红素转化为其他类胡萝卜素的RNAi元件。

本发明的技术方案是同时下调5对棉花番茄红素环化酶(Lyc)基因的RNAi元件(LycRNAi)，所述的5对Lyc基因为GhLyc1A/D、GhLyc2A/D、GhLyc3A/D、GhLyc4A/D和GhLyc5A/D。

具体的，所述RNAi元件包含由1个内含子序列隔开的2个反向重复序列，每一重复序列包含分别来源于5对棉花Lyc基因的编码序列。

具体的，所述的RNAi元件具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

SEQ ID No.6靶向5对棉花Lyc基因的LycRNAi元件(其中下划线所示为间隔序列)：

agtgattctcgagtcttgatacaacctggtctggtgctgttgtgtatattgatgatggaaaaaagaaagatcttgatagaccttatggaagggttaataggatctctgtatccacttcccttttcctccgattcatgggaaccttggttgggccagttttatcagctttgacaaccagcaagtatcgaccactcttcccttctcccactgcttctcttccttcttcaaaaccccatttaacaacatcaaggatctgtcggagctcggaaattcgcggccgtggccgtttctaagtccgccacttggaggtctcggaggagaaaagatccggtgagtacgaaaatggcggtttcgaataatcaacggttgatttcattggatctcggttgcattgaaagaaacaatatacatgccttttattctatgtgtttattagtttcgaaggtgataacaatggagtgtgtcggagctcggaacttcgcggcaatggcggttcctacacgtgccttttggatctccagtcttctacatgctttctggaaccacgatgatggtctcgctgagaccctttaatggggtctctccgtatccatcaaaacatccattggttcatagaaacaggcagacagctctaaggggtaccatttacatgagtgctcaaacacaagcagttccttccagaacccaggtcagtttacttttctatttcattttctagttgttccccaagaaaatggcactctctcattaaaggaagttcgggatatatgtatattatgagagctatggttgttttatgtttttgtatagccaattgtttgttactgtcttgaacccacgctttacttgaatgatttagctgtttgtataaacaaaattgatacgttggttcaaaggaataatgtgtagttaaataatgttgtagtgcttcttttgtaccataaatattggtgtaatatcaacatactgtagtttgtttgatagagtgctggatagtttatgtacttgtacctgattcgaagcaattttactcaaaactctagcccctatagggtcaagtggaaatccgactggttcgggtcattttgccaactctatagggagtgccaaggagtattattatattctttgcatgcgagttgtttctgaatcatttcatttcaatcttgcagaggataatgggttctggaaggaactgcttgtgtttgagcactcatgtaaatggtaccccttagagctgtctgcctgtttctatgaaccaatggatgttttgatggatacggagagaccccattaaagggtctcagcgagaccatcatcgtggttccagaaagcatgtagaagactggagatccaaaaggcacgtgtaggaaccgccattgccgcgaagttccgagctccgacacactccattgttatcaccttcgaaactaataaacacatagaataaaaggcatgtatattgtttctttcaatgcaaccgagatccaatgaaatcaaccgttgattattcgaaaccgccattttcgtactcaccggatcttttctcctccgagacctccaagtggcggacttagaaacggccacggccgcgaatttccgagctccgacagatccttgatgttgttaaatggggttttgaagaaggaagagaagcagtgggagaagggaagagtggtcgatacttgctggttgtcaaagctgataaaactggcccaaccaaggttcccatgaatcggaggaaaagggaagtggatacagagatcctattaacccttccataaggtctatcaagatctttcttttttccatcatcaatatacacaacagcaccagaccaggttgtatcaagactcgagaatcgaa

本发明还提供了同时下调5对棉花Lyc基因的植物表达载体，包含所述的RNAi元件，该RNAi元件在植物体内转录。

具体的，调控所述RNAi元件的启动子为组成型启动子。

具体的，所述的启动子为CaMV35S启动子，具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。

具体的，所述的植物表达载体具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。

本发明还提供了含有所述载体的宿主细胞。

优选的，所述的宿主细胞为根癌农杆菌。

本发明还提供了调控棉花类胡萝卜素的物质，其特征在于：其主要活性成分为所述载体，或者所述的宿主细胞。

本发明还提供了所述的RNAi元件，所述的植物表达载体，或所述的宿主细胞在调控棉花类胡萝卜素含量和/或种类中的用途。

本发明的有益效果：本发明通过研究和分析，确定在棉花中表达所述RNAi元件可以有效抑制棉花10个Lyc基因的表达水平并降低类胡萝卜素的合成。该RNAi元件及相关载体可用于调控棉花类胡萝卜素含量和种类，并在棉籽营养品质或纤维色彩的转基因改良方面有着广阔的应用前景。

附图说明

图1：LycRNAi的表达载体T-DNA区的基因结构图

2×35S，增强型花椰菜花叶病毒35S启动子；D1-D5，棉花Lyc基因序列，两个反向重复的D1-D5串联序列及间隔序列构成LycRNAi元件；LycRNAi，番茄红素环化酶Lyc基因的沉默元件；GUS:NPTII，葡萄糖酸苷酶和新霉素磷酸转移酶融合基因；T-Border(right)，T-DNA右边界；T-Border(left)，T-DNA左边界。Nos，农杆菌胭脂碱基因终止子；35S，花椰菜花叶病毒35S启动子。

图2：pLGN-35S-LycRNAi表达载体构建流程

具体实验方法见操作过程实施例2。2×35S，增强型花椰菜花叶病毒35S启动子；D1-D5，棉花Lyc基因序列；LycRNAi，番茄红素环化酶Lyc基因的沉默元件；GUS:NPTII，葡萄糖酸苷酶和新霉素磷酸转移酶融合基因；T-Border(right)，T-DNA右边界；T-Border(left)，T-DNA左边界。Nos，农杆菌胭脂碱基因终止子；Kanamycin(R)，卡那霉素抗性基因；35S，花椰菜花叶病毒35S启动子。相关酶切位点及位置在各个载体上标出。

图3：陆地棉A/D基因组中Lyc基因RT-PCR引物的扩增验证及表达分析

A，10个棉花Lyc基因的特异引物在陆地棉(Gh)、雷蒙德氏棉(Gr)和亚洲棉(Ga)中的扩增验证。B，LycRNAi转基因棉花不同转化子叶片中Lyc基因(GhLyc1A/D、GhLyc2A/D、GhLyc3A/D、GhLyc4A/D和GhLyc5A/D)的表达水平；WT代表非转基因棉花，数字显示不同的转化子。

图4：野生型(WT)棉花及LycRNAi转基因植株叶片类胡萝卜素含量(mg/g)的变化。WT为野生型叶片，数字显示不同转化子。

具体实施方式

下述为实验操作中所用到的常规操作：

1.DNA的提取

基因组DNA采用植物基因组DNA快速提取试剂盒(Aidlab)提取，详细步骤见说明书。

2.RNA的提取

RNA采用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab)提取，详细步骤见说明书。

3.DNA片段的PCR扩增

扩增体系如下：10×Ex PCR buffer(Mg²⁺free)2.5μL，2.5mmol/L>2>2O至25μL。

扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。

4.DNA片段的回收、连接和克隆

使用BioFlux胶回收试剂盒回收DNA片段。使用T4 DNA ligase进行DNA片段连接。回收的片段与pUCm-T(上海生工)载体建立如下连接体系：10×T4 DNA连接缓冲液1μL，载体DNA片段1μL，外源连接产物DNA片段1μL，T4 DNA连接酶1μL，用双蒸水补足体积至10μL。载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1︰3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5α。获得的抗性克隆经液体培养过夜，用BioFlux质粒提取试剂盒提取质粒，酶切验证后，在Invitrogen公司测序。

5.GUS组织化学染色

由于实验室采用的表达载体具有GUS报告基因，一般用GUS组织化学染色检测跟踪转基因。具体方法：取少量转基因棉花叶片(有伤口)置于96孔板中，加入GUS染液[0.1mol/LK₃Fe(CN)₆，0.1mol/L>4Fe(CN)₆，0.01mol/L>2EDTA，500mg/L>

实施例1 沉默元件的获得

如前所述陆地棉含有5对Lyc基因，直系同源基因之间相似性极高(＞98％)，而旁系同源基因的核苷酸序列相似性较低，为完全抑制棉花中Lyc基因，我们从5个Lyc基因上各选取一段序列(SEQ ID No.1～5)，通过不对称PCR方法将5个序列串联，并最终形成含有间隔序列的反向重复序列，即LycRNAi元件(SEQ ID No.6)。该沉默元件可靶定5对10个Lyc序列从而通过RNAi机制下调番茄红素环化酶Lyc基因的表达水平。

首先，用陆地棉基因组DNA为模板分别扩增出5个Lyc1～5编码序列及间隔序列(Lyc2序列包含一段编码序列及临接的内含子序列)，引物为Lyc1F/R、Lyc2F/R、Lyc3F/R、Lyc4F/R、Lyc5F/R(表2)，方法同上述常规试验操作的DNA片段扩增。进一步用上述DNA片段回收方法回收扩增的Lyc1～5片段。

表2 LycRNAi元件扩增引物序列

引物碱基序列(5'---3')用途Lyc1FCTCGAGAAAGATCTGTCGGAGCTCGGAAATTCLyc1片段扩增上游引物Lyc1RAAGACCATCTACCAACATCALyc1片段扩增下游引物Lyc2FCTACATGCTTTCTGGAACCALyc2片段扩增上游引物Lyc2RAGTTCCTTCCAGAACCCATTATCCTCTGCAAGATTGLyc2片段扩增下游引物Lyc3FCTCGAGAAAGATCTCTGTATCCACTTCCCTTTTCLyc3片段扩增上游引物Lyc3RGGATCCTTGATGTTGTTAAATGGGLyc3片段扩增下游引物Lyc4FGAGAAAGATCTCGGTTGCATTGAAAGAAACLyc4片段扩增上游引物Lyc4RGGATCCAAAAGGCACGTGTAGGALyc4片段扩增下游引物Lyc5FCTCGAGTCTTGATACAACCTGGTCTGLyc5片段扩增上游引物Lyc5RGGATCCTATTAACCCTTCCATAAGLyc5片段扩增下游引物

第二，利用不对称重叠PCR方法将回收的5个Lyc片段串联。

首先将Lyc1和Lyc4、Lyc5和Lyc3串联。构建4个扩增体系如下：

(1)回收的Lyc1片段约5ng，2μL引物Lyc1F，1μL引物Lyc1R；

(2)回收的Lyc3片段约5ng，1μL引物Lyc3F，2μL引物Lyc3R；

(3)回收的Lyc4片段约5ng，1μL引物Lyc4F，2μL引物Lyc4R；

(4)回收的Lyc5片段约5ng，2μL引物Lyc5F，1μL引物Lyc5R；

扩增体系其余成分同常规扩增体系。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，30sec，30个循环；72℃延伸3min。分别将体系1和体系3混合、体系2和体系4混合，56℃，1min，72℃，3min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，目的条带Lyc1+Lyc4和Lyc5+Lyc3分别回收。

然后以Lyc1+Lyc4和Lyc2为模板，进行Lyc1+Lyc4与Lyc2的串联。构建2个扩增体系如下：

(5)回收的Lyc1+Lyc4片段约5ng，2μL引物Lyc1F，1μL引物Lyc4R。

(6)回收的Lyc2片段约5ng，1μL引物Lyc2F，2μL引物Lyc2R。

扩增体系其余成分同常规扩增体系。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，30sec，30个循环；72℃延伸3min。将体系5和体系6混合，56℃，1min，72℃，3min。扩增产物经琼脂糖电泳后，回收目的条带Lyc1+Lyc4+Lyc2。

进一步以Lyc5+Lyc3和Lyc1+Lyc4+Lyc2为模板完成5个Lyc基因片段的串联。构建如下两个扩增体系：

(7)回收的Lyc5+Lyc3片段约5ng，2μL引物Lyc5F，1μL引物Lyc3R；

(8)回收的Lyc1+Lyc4+Lyc2片段约5ng，1μL引物Lyc1F，2μL引物Lyc2R。

扩增体系其余成分同常规扩增体系。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，30sec，30个循环；72℃延伸3min。将体系5和体系6混合，56℃，1min，72℃，3min。扩增产物经琼脂糖电泳后，回收目的条带Lyc5+Lyc3+Lyc1+Lyc4+Lyc2。

在设计引物时，Lyc2引物的扩增片段包含了Lyc2的编码序列以及临近的内含子序列。该内含子用作间隔序列，有利于两个反向重复序列形成双链RNA。

SEQ ID NO.1：Lyc1编码序列：

tctgtcggagctcggaaattcgcggccgtggccgtttctaagtccgccacttggaggtctcggaggagaaaagatccggtgagtacgaaaatggcggtttcgaataatcaacggttgatttcattggatc

SEQ ID NO.2：Lyc2编码序列及临接内含子序列，下划线部分即为内含子序列：

ttctacatgctttctggaaccacgatgatggtctcgctgagaccctttaatggggtctctccgtatccatcaaaacatccattggttcatagaaacaggcagacagctctaaggggtaccatttacatgagtgctcaaacacaagcagttccttccagaacccaggtcagtttacttttctatttcattttctagttgttccccaagaaaatggcactctctcattaaaggaagttcgggatatatgtatattatgagagctatggttgttttatgtttttgtatagccaattgtttgttactgtcttgaacccacgctttacttgaatgatttagctgtttgtataaacaaaattgatacgttggttcaaaggaataatgtgtagttaaataatgttgtagtgcttcttttgtaccataaatattggtgtaatatcaacatactgtagtttgtttgatagagtgctggatagtttatgtacttgtacctgattcgaagcaattttactcaaaactctagcccctatagggtcaagtggaaatccgactggttcgggtcattttgccaactctatagggagtgccaaggagtattattatattctttgcatgcgagttgtttctgaatcatttcatttcaatcttgcagaggataa

SEQ ID NO.3：Lyc3编码序列：

tctctgtatccacttcccttttcctccgattcatgggaaccttggttgggccagttttatcagctttgacaaccagcaagtatcgaccactcttcccttctcccactgcttctcttccttcttcaaaaccccatttaacaacatcaagga

SEQ ID NO.4：Lyc4编码序列：

tcggttgcattgaaagaaacaatatacatgccttttattctatgtgtttattagtttcgaaggtgataacaatggagtgtgtcggagctcggaacttcgcggcaatggcggttcctacacgtgccttttggatctccagtc

SEQ ID NO.5：Lyc5编码序列：

gattctcgagtcttgatacaacctggtctggtgctgttgtgtatattgatgatggaaaaaagaaagatcttgatagaccttatggaagggttaatagga

最后用直接扩增发夹RNA的方法⁵以片段Lyc5+Lyc3+Lyc1+Lyc4+Lyc2为模板扩增获得含间隔序列的5个Lyc片段的反向重复序列。反应体系中含回收的Lyc5+Lyc3+Lyc1+Lyc4+Lyc2约5ng，2μL引物Lyc5F，1μL引物Lyc2R，其余成分同常规扩增体系。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1min，35个循环；72℃延伸3min。扩增产物经琼脂糖电泳后，回收约1873bp的目的条带，按常规方法回收、克隆和测序验证，最终获得LycRNAi元件(图1)。LycRNAi元件依次包括Lyc5+Lyc3+Lyc1+Lyc4+Lyc2(编码序列及相邻的部分内含子序列)+Lyc2反向重复序列+Lyc4反向重复序列+Lyc1反向重复序列+Lyc3反向重复序列+Lyc5反向重复序列。

实施例2 LycRNAi表达载体的构建

LycRNAi元件构建入植物表达载体pLGN-nos的流程见图2。pLGN-nos载体是由传统的植物表达载体pBI121改造而来的一个双元植物表达载体。其T-DNA区段(T-DNA左右边界之间区域，图2)替换为组成型的35S启动子控制报告基因GUS和标记基因NptII的融合基因表达盒，以及另外的一个由35S启动子控制的表达盒。

LycRNAi载体构建过程为：用HindⅢ和BamHⅠ将35S启动子从克隆载体上切下，连接到用HindⅢ和BamHⅠ酶切的pLGN-nos载体上构建pLGN-35S载体。进一步用EcoRⅠ和BamHⅠ将LycRNAi元件从克隆载体上切下，插入到pLGN-35S载体的相应位点上，即获得最终的表达载体pLGN-35S-LycRNAi。所有限制性内切酶均购自Roche公司，按照使用说明书操作。DNA片段的回收、连接和大肠杆菌转化按前述常规操作方法进行。参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书,将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。

实施例3 棉花的遗传转化

通过根癌农杆菌介导的方法进行上述表达载体的棉花遗传转化，所用培养基配方见表3。具体方法如下：对野生型陆地棉冀棉14号饱满棉花种子进行脱壳，将少量(约20～40颗)去壳后的种子置于灭菌后的100mL三角瓶中，先用75％酒精清洗种子1min，轻轻倒出酒精再加入0.1％升汞灭菌约12min(不断摇动三角瓶进行灭菌)，轻轻倒出升汞，加入无菌水充分漂洗，约漂洗10次，最后一次三角瓶中留有适量无菌水。置于摇床(30℃、100rpm)上，每隔8小时更换一次无菌水，待胚根长出1cm左右(约36～48h)，将胚根轻轻插进萌发培养基中，30℃暗培养至下胚轴伸长到3cm左右(约48h)。在进行种子的伸长培养期间活化农杆菌，以备浸染所用。浸染前约20h，将携带遗传转化载体的农杆菌单菌落接种于含有50mg/L卡那霉素(Km)和125mg/L链霉素(Sm)的液体YEB培养基中，置于28℃摇床(200rpm)，培养约20h后测量菌液的OD值(OD₆₀₀)，OD₆₀₀在0.8～1.0适宜转化。收集活化后的农杆菌液，8000rpm离1min，弃上清后用含有共培养液体培养基(含100μmo1/L乙酰丁香酮)的按1︰1体积比重悬菌体后收集重悬液于100mL三角瓶，置于摇床(30℃、100rpm)培养约20min。将下胚轴切成长约1cm的小段，置于重悬液中并在摇床(30℃、100rpm)上浸染50min，弃液体再取出下胚段轻轻放入固体共培养基表面，暗培养48h左右。暗培养后将下胚段转入固体筛选培养基中培养(30℃、16h光照/8h黑暗，下同)15天后再转入固体下胚段生长培养基，每隔15d左右继代一次至愈伤组织明显形成，将愈伤组织转到固体愈伤培养基上培养。将状态良好的胚性愈伤转入液体悬浮培养基中并置于摇床(30℃、100rpm)上悬浮培养10d左右，通过筛网过滤将细小体胚铺于体胚伸长培养基中至绿色体胚长出，将绿色体胚挑至体胚伸长培养基中继续培养至长约1cm左右，插入生根培养基中直至幼苗长出。以上操作需在严格的无菌条件下完成。

将筛选出的GUS阳性转基因小苗种植于腐质土中温室炼苗2周后转种至大钵培养。在温室中常规管理,并对植株生理性状及叶片中Lyc基因表达量以及类胡萝卜素含量进行分析。

表3根癌农杆菌介导的棉花遗传转化用培养基

MS：Murashige&Skoog，1962；B5：Gamborg，1986；Gelrite：Sigma，货号：G1910；SH：Schenk&Hildebrandt，1972。

实施例4 转基因棉花叶片中Lyc基因转录水平的检测

首先设计针对10个棉花Lyc基因的基因特异定量PCR引物，并用常规PCR方法检测引物特异性。如前所述，同对直系同源基因序列差异小，因此重点检查基因特异引物能否区分同对直系同源基因(GhLyc1A和D、GhLyc2A和D、GhLyc3A和D、GhLyc4A和D，以及GhLyc5A和D)。用常规方法提取陆地棉冀棉14(AADD)、雷蒙德氏棉(DD)和亚洲棉(AA)的基因组DNA。用2×Taq Mix(Aidlab)扩增基因组DNA以检查引物特异性。扩增体系2×Taq Mix 12.5μL，上下游引物(5nmol/L)各1μL，基因组DNA约100ng，加入ddH₂O至25μL。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1.5min，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物在含溴乙锭的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察照相。所有定量PCR引物序列见表4。

表4定量PCR引物序列

提取WT及转基因棉花叶片的RNA，逆转录合成cDNA，然后进行荧光定量PCR。具体操作步骤为：用反转录试剂盒(MBI公司)合成cDNA，操作与按试剂盒说明书一致。定量PCR在CFX96定量PCR检测系统(Bio-Rad)上进行，在25μL的反应体系包括12.5μL 2×Super Mix(Bio-Rad)，上下游引物各1μL(5μmol/mL)和1μL一链cDNA。温度循环参数为95℃预变性2min；95℃，10sec，57℃，20sec，扩增40循环。用棉花Actin4基因作内标。用定量PCR仪自带的分析软件Bio-Rad CFX Manager 3.0计算各个基因的相对表达量。

检测结果如附图3A，所有定量PCR引物均能明显区分不同(亚)基因组来源的直系同源基因，即A-特异引物只能从含有A(亚)基因组的DNA(陆地棉和亚洲棉)中扩增出相应片段，而D-特异引物只能从含有D(亚)基因组的DNA(陆地棉和雷蒙德氏棉)中扩增出相应片段。这显示所有定量PCR引物均有很好的特异性。

进一步用这些引物检测野生型和LycRNAi转基因棉花叶片中的10个Lyc基因的表达水平。结果显示(附图3B)，LycRNAi转基因棉花叶片中，所有Lyc基因的表达水平均较野生型对照明显下降。这显示本发明提供的LycRNAi元件及其表达载体可以全面地下调棉花Lyc基因的表达。

实施例5 转基因棉花叶片类胡萝卜素含量测定

参考萧浪涛的方法⁶测定转基因棉花及野生型叶片的类胡萝卜素含量。首先选取植株同一生长位置的叶片(一般为倒四叶)，直径为0.6cm的打孔器于叶片各部位打孔取样，称取0.1g左右(m)，加入10mL95％乙醇进行避光萃取12～24h；取200μL于酶标板中，分别测定665nm、649nm和470nm处的吸光值(A₆₆₅、A₆₄₉和A₄₇₀)。

色素含量按如下公式计算：

叶绿素a(C_a)＝13.95A₆₆₅-6.88A₆₄₉；叶绿素b(C_b)＝24.96A₆₄₉-7.32A₆₆₅；

类胡萝卜素(C_x)＝(1000A₄₇₀-2.05C_a-114.8C_b)/245；

类胡萝卜素含量＝C_x×10^-2/m(mg/g)。

如附图4，LycRNAi转基因棉花叶片中的类胡萝卜素含量均较野生型明显降低，显示LycRNAi元件在棉花中的表达可以最终影响转基因棉花体内类胡萝卜素的合成。

参考文献

1.Diretto,G.,Al-Babili,S.,Tavazza,R.,Papacchioli,V.,Beyer,P.,andGiuliano,G.(2007).Metabolic engineering of potato carotenoid content throughtuber-specific overexpression of a bacterial mini-pathway.Plos One 2(4),e350.

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