肺炎链球菌及其中的荚膜多糖合成方法和SPD-0064基因编码产物及该编码产物的用途

摘要

本专利公开了医药生物技术领域中的肺炎链球菌，包括肺炎链球菌血清型菌株，所述肺炎链球菌血清型菌株中存在整体缺失、部分缺失、序列点突变或序列点缺失的一种或多种的荚膜多糖生成抑制基因。荚膜多糖生成抑制基因存在部分缺失、序列点突变或缺失的一种或多种改变会影响SPD‑0064基因或其编码产物功能和活性，来实现干扰或抑制SPD‑0064基因编码产物与荚膜多糖基因簇的启动子区的结合，从而干扰或破坏荚膜多糖基因簇转录功能，最终增加荚膜多糖产量。

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及肺炎链球菌及其中的荚膜多糖合成方法和肺炎链球菌的中间产物及该中间产物的运用。

背景技术

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pn），为革兰染色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜，并将该多糖称之为荚膜多糖（capsule，CPS），荚膜多糖是革兰阳性细菌表面普遍存在的一种多糖聚合物，通过共价结合的方式固定于细胞壁外层肽聚糖上，目前已经鉴定出的肺炎链球菌荚膜多糖有98种；再根据荚膜多糖抗原性的不同，可将肺炎链球菌分为84种血清型菌株。

肺炎链球菌血清型菌株通常寄居在人类鼻咽的粘膜表面，当机体免疫力低下时，可从鼻咽部粘膜的寄居处非侵袭地持续扩散至肺部引起肺炎、至血液引起败血症、至脑脊液引起脑膜炎或其他的部位引起疾病（中耳炎、鼻窦炎、气管炎）。其病理表现主要是最初肺泡内有大量纤维蛋白渗出液，继之是红细胞和白细胞向肺泡内渗出，最终导致病变部位肺组织实变。

肺炎链球菌感染是全球儿童和成人致病和致死的主要原因之一，全球每年因肺炎链球菌感染死亡的总人数大致与结核相仿，高达300至500万人，其中5岁以下儿童每年发病率高达100万，死亡率高达11%。

20世纪80年代中期，青霉素耐药肺炎链球菌已在全球广泛报道，尽管在不同国家、地区差异较大，但从总体来看，近年来由于抗生素的广泛应用，肺炎链球菌的耐药率呈迅速上升趋势。在我国，耐红霉素肺炎链球菌几乎为100%，肺炎链球菌对其一线药物青霉素的耐药率也超过40%，甚至还出现了耐万古霉素的肺炎链球菌，这些都使得肺炎链球菌引起的疾病在治疗上面临巨大问题。

接种肺炎链球菌疫苗预防感染是目前较为有效的防治措施，荚膜多糖可诱导宿主产生特异性的抗体，能有效抵御同型血清细菌感染；目前市售的23价荚膜多糖疫苗和13价多糖结合疫苗均以荚膜多糖为基础，现已广泛使用。

已知肺炎链球菌CPS的生物合成主要由荚膜多糖基因簇决定，基因簇各基因的表达受上游序列（约200bp）调控。

SPD-0064（亦称capsular polysaccharide repressor，cpsR）基因——见附图13，属于细菌GntR型转录因子家族成员；总体而言，GntR型转录因子包含一个N-末端的HTH（helix-turn-helix）DNA结合域和C-末端的效应结合域；整个GntR型转录因子其DNA结合域在结构上高度保守，其亚家族分类依赖于DNA结合域之外的多变区域；在大多数革兰阳性菌，GntR型转录因子参与糖代谢调控，为葡萄糖酸操纵子转录抑制因子；已知肺炎链球菌GntR型转录因子之一与纤维二糖代谢相关，具有负性调控作用。

目前常规的肺炎链球菌的制备方法中用于提供肺炎链球菌生长所需的碳源的葡萄糖的浓度均低于3mmol/L，造成碳源不足而引起肺炎链球菌的生长缓慢，导致荚膜多糖的产量少。而市售的肺炎链球菌疫苗在生产上均要用到荚膜多糖，荚膜多糖生产直接影响到疫苗的生产成本；因此，本领域迫切需要提高荚膜多糖产量，降低疫苗成本。

发明内容

本发明意在提供肺炎链球菌，以解决现有技术中的荚膜多糖产量低的问题。

本方案中的肺炎链球菌，包括肺炎链球菌血清型菌株，所述肺炎链球菌血清型菌株中存在整体缺失、部分缺失、序列点突变或序列点缺失的一种或多种的荚膜多糖生成抑制基因。

所述荚膜多糖生成抑制基因是SPD-0064基因或SPD-0064基因的等位基因或同源基因。

所述SPD-0064基因的等位基因或同源基因与SPD-0064基因全长或功能结构域编码序列同源性大于30%。

所述荚膜多糖生成抑制基因为SPD-0064基因。

本方案的有益效果：荚膜多糖生成抑制基因存在部分缺失、序列点突变或缺失的一种或多种改变会影响SPD-0064基因或其编码产物的功能和活性，来实现干扰或抑制SPD-0064编码产物与荚膜多糖基因簇启动子区的结合，从而干扰或破坏荚膜多糖基因簇转录功能，最终增加荚膜多糖产量。

本发明另一个目的是提供合成产量高的荚膜多糖的合成方法。使用的培养基中添加有用于干扰或影响SPD-0064基因或其编码产物的功能或活性的发挥的葡萄糖、小分子抑制剂或单克隆抗体或干扰SPD-0064基因表达的RNA中的一种或多种。

使用的培养基为各类用于肺炎链球菌培养的培养基，在培养基中再次添加葡糖糖溶液形成增强型培养基，使得增强型培养基中的葡萄糖浓度大于等于5mmol/L。

目前常规的肺炎链球菌的制备方法中用于提供肺炎链球菌生长所需的碳源的葡萄糖的浓度均低于3mmol/L，使用的培养基为各类用于培养肺炎链球菌的培养基，在申请中使用的培养基为C+Y培养基，为一种市场售卖常用于真菌培养的培养基，主要含有葡萄糖、淀粉等营养物质，该葡萄糖含量浓度低于3mmol/L；在C+Y培养基中再次添加葡糖糖溶液形成增强型C+Y培养基，使得增强型C+Y培养基中的葡萄糖浓度大于等于5mmol/L。用于提供肺炎链球菌生长所需的碳源，及用于干扰GntR型转录因子SPD-0064基因编码产物与荚膜多糖基因簇起始密码子上游200 bp的DNA结合，从而促进肺炎链球菌荚膜多糖的转录与合成。

使用的培养基中添加有用于干扰或影响SPD-0064基因或其编码产物的功能或活性的发挥的葡萄糖、小分子抑制剂、单克隆抗体或干扰SPD-0064基因表达的RNA中的一种或多种；干扰或影响SPD-0064基因或其编码产物的功能或活性的发挥，以提高荚膜多糖的含量。

本发明再一个目的得到SPD-0064基因改变后的SPD-0064基因编码产物，在利用SPD-0064基因编码产物来增强肺炎链球菌感染的检测效果。

SPD-0064基因编码产物为存在部分缺失、序列点突变、序列点缺失其中一种情形的荚膜多糖生成抑制基因所表达生成的蛋白质。

SPD-0064基因编码产物，用于肺炎链球菌感染的检测应用。传统检测是通过对肺炎链球菌血清型菌株的数量来完成，而肺炎链球菌血清型菌株的数量庞大，并且其中部分肺炎链球菌血清型菌株不会引起病疫，导致检测受到干扰，造成检测效果不佳；本申请是通过加入SPD-0064基因或其编码产物，由SPD-0064基因或其编码产物与能引起病疫的肺炎链球菌血清型菌株反应，SPD-0064基因突变或其编码产物表达减少或SPD-0064基因编码产物与荚膜多糖基因簇启动子区结合位点结合能力减弱，直接检测SPD-0064基因或其编码产物则能得到精准的能引起病疫的肺炎链球菌血清型菌株数量或精准的判断肺炎链球菌感染性疾病的严重程度，使得检测更加精确。

附图说明

图1：荚膜多糖启动子上游临近区域DNA序列图；

图2：SPD-0064基因编码产物结合位点DNA序列图；

图3：SPD-0064 up-erm-SPD-0064 down连接PCR(聚合酶链式反应）结果图；

图4：肺炎链球菌D39野生菌血平板生长菌落形态图；

图5：肺炎链球菌D39ΔSPD-0064缺陷菌血平板生长菌落形态图；

图6：肺炎链球菌D39野生菌、肺炎链球菌D39ΔSPD-0064缺陷菌和肺炎链球菌过表达菌cps基因mRNA转录水平（qRT-PCR检测）比较图；

图7：肺炎链球菌D39野生菌、肺炎链球菌D39ΔSPD-0064缺陷菌和肺炎链球菌过表达菌CPS表达水平（斑点杂交法检测）实验结果图；

图8：肺炎链球菌D39野生菌、肺炎链球菌D39ΔSPD-0064缺陷菌和肺炎链球菌过表达菌CPS表达水平（ELISA法检测）实验结果图；

图9：肺炎链球菌D39野生菌、肺炎链球菌D39ΔSPD-0064缺陷菌和肺炎链球菌过表达菌培养上清中CPS表达差异图（ELISA检测）；

图10：葡萄糖浓度对肺炎链球菌D39野生菌CPS表达水平的影响图；

图11：葡萄糖竞争SPD-0064蛋白与肺炎链球菌D39 cps启动子区结合图；

图12：肺炎链球菌19F野生菌、肺炎链球菌缺陷菌CPS表达水平图；

图13：肺炎链球菌中的SPD-0064基因序列图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作优选的详细的说明：

肺炎链球菌，包括肺炎链球菌血清型菌株，该肺炎链球菌血清型菌株中存在整体缺失、部分缺失、序列点突变或序列点缺失的一种或多种的荚膜多糖生成抑制基因；同时荚膜多糖生成抑制基因是SPD-0064基因或SPD-0064基因的等位基因（位于一对同源染色体的相同位置上控制某一性状的不同形式的基因）或同源基因（如果两条基因序列相似性达80%，就可以把它们称为"同源基因"），该SPD-0064基因的等位基因与SPD-0064基因全长或功能结构域编码序列同源性大于30%。

在本实施例中，选用的荚膜多糖生成抑制基因为SPD-0064基因，制得肺炎链球菌的SPD-0064基因编码产物，该SPD-0064基因编码产物为存在部分缺失、序列点突变、序列点缺失其中一种情形的荚膜多糖生成抑制基因所表达生成的蛋白质，用于肺炎链球菌感染的检测应用。

肺炎链球菌的合成，以肺炎链球菌D39菌株示例，包括以下几个步骤：

步骤一：材料：包括肺炎链球菌D39，肺炎链球菌D39野生菌株，细菌DNA提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司，PCR(聚合酶链式反应）用Prime Star高保真酶、dNTPs、Buffer、MgCl2购自宝生物工程（大连）有限公司，PCR(聚合酶链式反应）产物纯化试剂盒及胶回收试剂盒盒购于罗氏诊断产品（上海）有限公司，感受态刺激肽（CSP1）由上海强耀生物科技有限公司合成，PCR仪为美国Bio-Rad公司T100。

步骤二：引物的设计合成：

以肺炎链球菌D39基因组DNA为模板，参照其全序列，使用primer premier5设计引物，该引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

步骤三：步骤二中的引物包括三种，分别为up片段扩增所用引物、down片段扩增所用引物和erm片段扩增引物：

up片段扩增所用引物，

P1：正5’-TGGATGGTCGGTTGGTTTTCT-3’；

P2：反5’-ATCAAACAAATTTTGGGCCCGGGAAGAAAGCCTGAGCCTAAT-3’；

down片段扩增所用引物，

P3：正5’-ATTCTATGAGTCGCTGCCGACTAGAAAATTTTACCATAAAAGCGA-3’；

P4：反5’-AGCCTTCAAGTTATAGAGCGAAT-3’；

erm片段扩增引物：

P5：正5’-CCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT-3’；

P6：反5’-AGTCGGCAGCGACTCATAGAAT-3’。

步骤四：步骤三中的三种引物分别放入相应的扩增液中，并将扩增液放入至PCR(聚合酶链式反应）仪中进行扩增：

up片段所用扩增液内的各物质的体积为：ddH2O=31.5μl，5×buffer（Mg²⁺）=10μl，dNTP=4μl，P1=1μl，P2=1μl，DNA模板=2μl，prime>

该扩增条件为：首先在98ºC下扩增10s，随后在50ºC下扩增15s，接着在72ºC下扩增90s，在该扩增条件下循环扩增30次后，再在72ºC下扩增10min后完成up片段扩增；

down片段所用扩增液内的各物质的体积为：ddH₂O=31.5μl，5×buffer（Mg²⁺）=10μl，dNTP=4μl，P3=1μl，P4=1μl，DNA模板=2μl，Prime>

该扩增条件为：首先在98ºC下扩增10s，随后在50ºC下扩增15s，接着在72ºC下扩增60s，在该扩增条件下循环扩增30次后，再在72ºC下扩增10min后完成down片段扩增；

erm片段所用扩增液内的各物质的体积为：ddH₂O=31.5μl，5×buffer（Mg²⁺）=10μl，dNTP=4μl，P5=1μl，P6=1μl，DNA模板=2μl，prime>

该扩增条件为：首先在98ºC下扩增10s，随后在55ºC下扩增15s，接着在72ºC下扩增60s，在该扩增条件下循环扩增30次后，再在72ºC下扩增10min后完成erm片段扩增。

步骤五：将步骤四中的up片段、down片段和erm片段，分别采用罗氏PCR(聚合酶链式反应）产物纯化试剂盒进行纯化。

步骤六：针对步骤五中的up片段、down片段和erm片段，进行SPD-0064up–erm–SPD-0064down连接片段PCR(聚合酶链式反应）扩增；

其各物质的的摩尔比为：引物：DNA模板=1：40，up片段：erm片段：down片段=1：1：1；而该扩增的各物质的体积为：ddH₂O=30.5μl,5×buffer（Mg²⁺）=10μl,dNTP=4μl,P1=1μl,P4=1μl,up=1μl,down=1μl,erm=1μl,prime>

扩增的条件：首先在98ºC下扩增10s，随后在58ºC下扩增15s,接着在72ºC下扩增3min,在该扩增条件下循环扩增33次后，再在72ºC下扩增10min后完成扩增，得到SPD-0064up–erm–SPD-0064down。

步骤七：步骤六中所述的SPD-0064up–erm–SPD-0064down连接PCR(聚合酶链式反应）片段，经扩增后，得到编码产物，该编码产物不能与荚膜多糖基因簇转录起始位点为荚膜多糖基因中的DNA序列的上游88-122bp——见附图1~2，随后使用胶回收试剂盒对编码产物回收。

步骤八：将肺炎链球菌D39野生菌株培养于含1×BSA+CaCl₂的培养基中，本实施选用C+Y培养基，在C+Y培养基中添加葡萄糖、小分子抑制剂、单克隆抗体或干扰SPD-0064基因表达的RNA中的一种，使用的培养基为C+Y培养基，在C+Y培养基中再次添加葡糖糖溶液形成增强型C+Y培养基，使得增强型C+Y培养基中的葡萄糖浓度大于等于5mmol/L；当菌株密度达到A₆₀₀=0.1左右时，在90μl的C+Y培养基加入10μl的感受态刺激因子（CSP1），并于37ºC水浴箱内孵育10min后，加入10μl的SPD-0064up–erm–SPD-0064down连接PCR(聚合酶链式反应）片段胶回收产物，并将产物置于冰块上30min；再于37℃水浴箱孵育90min，然后铺于含有0.25mg/L的红霉素的TSA血平板上，于37℃的孵箱内培养24～48h，而成功整合了erm片段的肺炎链球菌会在含有红霉素的TSA血平板上生长，形成菌落。

步骤九：挑取步骤八中的单个菌落，放置于C+Y培养基中培养，当菌落的菌密度达到A₆₀₀=0.5左右时，冻于箱内温度为-80℃的冰箱保存，即得到疑似SPD-0064基因被红霉素基因（erm）替代的肺炎链球菌D39ΔSPD-0064缺陷菌株。

步骤十：将步骤九中得到的肺炎链球菌D39ΔSPD-0064缺陷菌培养于C+Y培养基中，当缺陷菌的密度A₆₀₀=0.5左右，用DNA提取试剂盒提取其DNA，并以P1、P4为引物在PCR(聚合酶链式反应）仪内扩增SPD-0064up–erm-SPD-0064down片段——见附图3，用胶回收试剂盒进行回收，进行基因测序，测序结果证实目的基因正确转化入肺炎链球菌D39，无碱基突变，得到肺炎链球菌D39ΔSPD-0064。

培养肺炎链球菌D39野生菌株和肺炎链球菌D39ΔSPD-0064在血平板上生长的菌落，包括以下几个步骤：

步骤一：材料：血平板购自重庆庞通公司。

步骤二：将存储于-80ºC的肺炎链球菌D39野生菌株和肺炎链球菌D39ΔSPD-0064培养至C+Y培养基中复苏，得到复苏细菌。

步骤三：将步骤二中的复苏细菌按1：50转接种至1x10⁴μl的C+Y培养基中进行扩大培养，得到复苏细菌的菌落。

步骤四：培养至A₆₀₀=0.4时，利用C+Y培养基进行10倍的倍比稀释，将步骤三中的菌落数调整为10²菌落/10μl。

步骤五：将步骤四中的菌落均匀涂布在血平板上，在37ºC的温度条件下向血平板通入浓度为5%的CO₂，通入时间为12-18小时。

步骤六：将血平板取出，观察步骤五中的菌落外观——见附图4~5。

肺炎链球菌D39野生菌株和肺炎链球菌D39ΔSPD-0064 cps2A-C基因mRNA转录水平检测，包括以下几个步骤：

步骤一：材料：RNA提取采用Thermo scientific KingFisher Duo RNA提取仪及相应配套耗材和试剂，逆转录PCR(聚合酶链式反应）试剂盒、实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应）试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司。

步骤二：引物的设计合成：以肺炎链球菌D39基因组DNA为模板，参照其全序列，使用primer premier5设计引物；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成：

16sup：5’-GTAGTCCACGCTGAAACGATGATG-3’；

16sdown：5’-CTGTCCCGAAGGAAAACTCTATCT-3’；

cps2Aup：5’-CGTCAACCGAAGCACTG-3’；

cps2Adown：5’-GATCCATCCGACCTGTCC-3’；

cps2Bup：5’-TCGTTATGCCTTGATAGAAT-3’；

cps2Bdown：5’-ATTTACTTGCGTGTAACAGC-3’；

cps2Cup：5’-TTTGCAGGCAGGATCTTATC-3’；

cps2Cdown：5’-GGCTTCCTCTGGCTGTTTAT-3’。

步骤三：步骤二中的肺炎链球菌D39总RNA提取：

1）预处理：在4ºC下，选用的离心率为13000rpm，离心5分钟，收集1.5x10³μl处于对数生长期的肺炎链球菌D39野生菌株和肺炎链球菌D39ΔSPD-0064，倒弃C+Y培养基并彻底吸弃残液；加入50µl的Buffer>

2）用Thermo scientific King Fisher Duo RNA提取仪提取肺炎链球菌D39野生菌株和肺炎链球菌D39ΔSPD-0064；

a)按下表准备各种试剂至96孔板中；

b)打开Thermo scientific King Fisher Duo RNA 提取仪，并导入MagPureBacterial RNA Duo；

c)把装好样品和试剂的DW Plate放到Thermo scientific King Fisher Duo RNA 提取仪中；

d)执行程序，约39分钟后暂停Thermo scientific King Fisher Duo RNA 提取仪；

e)取出深孔板，加入600µl的Buffer VHB至脱氧核糖核酸酶孔（E孔）中；

f)继续执行程序，约29分钟后程序结束；

g)取出洗脱条，把RNA转移至1.5x10³μl离心管中，样品保存于-80ºC。

步骤四：逆转录PCR(聚合酶链式反应）体系内的各物质的体积为：Rnase freeddH₂O=9μl，5×PrimeScript>

该逆转录条件为：在37ºC下逆转录15min，在85ºC下逆转录5s后完成逆转录。

步骤五：荧光定量PCR(聚合酶链式反应）体系内的各物质的体积为：SYBRII=12.5μl，up=0.5μl，down=0.5μl，cDNA=2μl，ddH₂O=9.5μl；

该条件为：在95ºC下反应30s，随后在95ºC下反应10s，接着在50ºC下反应15s，然后在72ºC下反应20s，在该条件下循环40次后完成反应——见附图6。

肺炎链球菌D39野生菌株、肺炎链球菌D39ΔSPD-0064和肺炎链球菌D39ΔSPD-0064过表达菌荚膜多糖含量检测，包括以下几个步骤：

步骤一：材料：BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，脱盐胆酸钠盐购于生工生物有限公司，PVDF膜购于美国Milipore公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购于北京中杉金桥，ECL显色液购于美国Milipore公司，抗CPS抗血清购于丹麦StatensSerum Institut。

步骤二：BCA法蛋白定量：实验步骤按照试剂盒附带的说明书操作，具体步骤如下：

a）将蛋白标准品用PBS稀释至5x10^-4mg/μl，BCA蛋白定量试剂包括试剂A和试剂B，按50体积试剂A加1体积试剂B（50：1）配置BCA工作液，充分混匀；

b）将蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板，体积不足20μl的加PBS补足20μl；

c）将以上标本5μl加入96孔板，同样PBS补足20μl；

d）加入200μl的BCA工作液，在37ºC下放置30min；

e）检测A₅₆₂。

步骤三：斑点杂交检测CPS表达量实验：

a）将肺炎链球菌D39野生菌株、肺炎链球菌D39ΔSPD-0064和肺炎链球菌D39ΔSPD-0064过表达菌于C+Y培养基中培养至A₆₀₀=0.5；集菌1.5x10³μl，在4ºC下离心5min，离心率为12000rpm；

b） PBS洗一遍，加入250μl浓度为0.5%的脱盐胆酸钠盐，并在37ºC水浴箱孵育10min，后冰上放置；

c）剪合适大小的PVDF膜，甲醇活化1min后，立即放PBS中；

d） 样品准备：根据以上BCA法蛋白定量结果，将三个标本的蛋白浓度调至一致，再分别按1：10，1：20，1：40进行稀释；

e）点样：将稀释好的三个标本，每个标本5μl点在活化后的PVDF膜上，室温晾干；

f）封闭：用0.1%的TBST配置5%的脱脂奶粉，室温封闭2h；

g） 一抗：5%的脱脂奶粉按1：1000稀释D39型CPS抗血清，室温孵育2h；

h） 洗膜：0.1%的TBST洗膜3洗，每次5min；

i）二抗：5%的脱脂奶粉按1：5000稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗，室温1h；

j）洗膜：0.1%的TBST洗膜4洗，每次5min；

k）显色：在PVDF膜上加入现配的ECL反应液（Millipore）反应1min，采用Bio-RadChemiDocXRS+成像仪成像——见附图7。

步骤四：ELISA法检测CPS表达量实验：

a）包被：同样采用以上按1：10，1：20，1：40稀释的标本进行包被，每孔20μl，加抗原包被液80μl，在4ºC的条件下保存8~12个小时；

b）洗板：0.05%的PBST，洗板4次，拍板；

c）封闭：PBS配置2%的BSA，每孔200μl，37℃，孵育2h；

d）一抗：2%的BSA按1：2000稀释D39型CPS抗血清，每孔100μl，37ºC，孵育1h；

e）洗板：0.05%的PBST，洗板4次，拍板；

f）二抗：2%的BSA按1：5000稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗，37℃，孵育1h；

g）洗板：0.05%的PBST，洗板4次，拍板；

h）显色：加入DAB显色试剂A=50μl，再加DAB显色试剂B=50μl，避光，37ºC，孵育15min；

i）终止：加入2M的H₂SO₄=100μl；

j）检测：A₄₅₀——见附图8~9。

肺炎链球菌D39野生菌株、肺炎链球菌D39ΔSPD-0064在不同葡萄糖浓度培养下，SPD-0064及CPS表达量检测，包括以下几个步骤：

步骤一：材料：自制小鼠来源抗SPD-0064蛋白抗血清，抗CPS抗血清购于丹麦StatensSerum Institut，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠/兔IgG抗体购于北京中杉金桥。

步骤二：Western Blot检测SPD-0064蛋白表达：

a）分别在葡萄糖浓度为相对正常C+Y培养基中的葡萄糖浓度为0.25、0.5、1倍条件下培养肺炎链球菌D39野生菌株；

b）待肺炎链球菌D39野生菌株生长至OD₆₀₀=0.5，收集5000μl的菌液；

c）在4°C下离心10min，离心率为6000rpm，弃上清并彻底吸弃残液；

d）加入1×SDS loading buffer=200μl，煮沸10min，在室温下离心5min，离心率为1000rpm；

e）配置10%的聚丙烯酰胺凝胶；

f）上样：每孔10μl；

g）电泳：在施加电压为80V下电泳45min；随后再在施加电压为120V下电泳70min；

h）转膜：在施加电流为210mA下转膜45min；

i）封闭：0.1%的TBST配置5%的脱脂奶粉，并在37°C摇床上轻微摇动封闭2h；

j）一抗：自制小鼠来源抗SPD-0064蛋白抗血清，5%脱脂奶粉，按照1：1000倍的比例稀释，在37°C下，放置在摇床上轻微摇动孵育120 min；

k）洗膜：用0.1%的TBST洗膜三次，每次15min；

o）二抗：辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体，5%的脱脂奶粉，按照1：5000倍的比例稀释，在37°C下，放置在摇床上轻微摇动孵育60min；

p）洗膜：0.1%的TBST洗膜4洗，每次15min；

q）显色：在PVDF膜上加入现配的ECL反应液（Millipore）反应1min，并采用Bio-RadChemiDocXRS+成像仪成像——见附图10。

步骤三：BCA法蛋白定量：实验步骤按照试剂盒附带的说明书操作，具体步骤如下：

a）将蛋白标准品用PBS稀释至5x10^-4mg/μl，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配置BCA工作液，充分混匀；

b）将a）中的蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板，当蛋白标准品加入体积不足20μl的加PBS补足20μl；

c）将以上5μl的标本加入96孔板，同样PBS补足20μl；

d）加入200μl的BCA工作液，37ºC放置30min；

e）检测A₅₆₂。

步骤四：Dot blot检测CPS表达量：

a）剪合适大小的PVDF膜，甲醇活化1min后，立即放PBS中；

b）样品准备：根据以上BCA法蛋白定量结果，将三个标本的蛋白浓度调至一致，再分别按1：10，1：20，1：40进行稀释；

c）点样：将稀释好的三个标本，每个标本5μl点在活化后的PVDF膜上，室温晾干；

d）封闭：用0.1%的TBST配置5%的脱脂奶粉，室温封闭120min；

e）一抗：5%的脱脂奶粉按1：1000稀释D39型CPS抗血清，室温孵育120min；

f）洗膜：0.1%的TBST洗膜3洗，每次5min；

g）二抗：5%的脱脂奶粉按1：5000倍的比例稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗，室温60min；

h）洗膜：用0.1%的TBST洗膜4洗，每次5min；

i）显色：在PVDF膜上加入现配的ECL反应液（Millipore）反应1min，采用Bio-RadChemiDocXRS+成像仪成像——见附图10。

葡萄糖干扰或竞争SPD-0064基因结合cps操纵子启动子序列，包括以下几个步骤：

步骤一：凝胶迁移实验（electrophoretic mobility-shif assays，EMSA）检测试剂盒购于Thermo Scientific，葡萄糖（Glucose）购于上海生工生物有限公司，尼龙膜购于美国Milipore公司，生物素标记的序列由大连宝生物公司合成。

步骤二：0.25μM的生物素标记的序列DNA双链片段与3μM的SPD-0064基因在EMSA标准体系中（20μl），室温下孵育15min后，分别加入1μl葡萄糖至终浓度为05，0.5，5，50mM，孵育20min。

步骤三：电泳：施加100V的电压，电泳至蓝色条带跑至整块胶板的2/3-3/4部分，电泳时间60-80min。

步骤四：转膜：

a)剪与胶同样大小的尼龙膜（两块）放入0.5×TBE中10min；

b)同样大小的滤纸6张；

c)转膜板的放置顺序同Western Blot；

d)在0.5×TBE中进行转膜，380mA，45min。

步骤五：交联：将膜距离紫外灯10cm照射10min。

步骤六：检测体系（参考Thermo Scientific EMSA试剂盒说明书）：

a)将4×wash buffer和Blocking Buffer预先放入37℃水浴箱中，使其充分溶解及预热；

b)加入2x10⁴μl的Blocking>

c)将66.7μl的Stabilized Stneptalidin Horseradish peroxidase conjugate加入2x10⁴μl的Blocking>

d)配制1×Wash Buffer，洗膜4次，每次清洗时间为5min；

e)加入20μl的substrate equilibration buffer，轻摇时间为5min；

f)避光条件下配制working solution（500μl的luminol/enhancer solution+500μl的Stable peroxide solution)；

g)成像——见附图11。

肺炎链球菌19F野生菌株、肺炎链球菌19FΔSPD-0064菌荚膜多糖含量检测，包括以下几个步骤：

步骤一：材料：BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，脱盐胆酸钠盐购于上海生工生物有限公司，PVDF膜购于美国Milipore公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购于北京中杉金桥，ECL显色液购于美国Milipore公司，抗CPS抗血清购于丹麦Statens Serum Institut。

步骤二：肺炎链球菌19FΔSPD-0064的构建参照肺炎链球菌D39ΔSPD-0064的构建。

步骤三：斑点杂交实验：

a）将肺炎链球菌19F野生菌株、肺炎链球菌19FΔSPD-0064和肺炎链球菌19FΔSPD-0064过表达菌于C+Y培养基中培养至A₆₀₀=0.5；

b）集菌1.5x10³μl，在4ºC下，选择离心率为12000rpm，离心5min；

c）PBS洗一遍，加入250μl的0.5%脱盐胆酸钠盐，并在温度为37ºC的水浴箱内孵育10min，在冰上放置保存。

步骤四：BCA法蛋白定量：实验步骤按照试剂盒附带的说明书操作，具体步骤如下：

a）将蛋白标准品用PBS稀释至5x10^-4mg/μl，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配置BCA工作液，充分混匀；

b）将蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板，体积不足20μl的加PBS补足20μl；

c）将以上5μl的标本加入96孔板，同样PBS补足20μl；

d）加入200μl的BCA工作液，在37ºC下放置30min；

e）检测A₅₆₂。

步骤五：斑点杂交检测CPS表达量实验：

a）剪合适大小的PVDF膜，甲醇活化1min后，立即放PBS中；

b）样品准备：根据以上BCA法蛋白定量结果，将三个标本的蛋白浓度调至一致，再分别按1：10，1：20，1：40进行稀释；

c）点样：将稀释好的三个标本，每个5μl的标本点在活化后的PVDF膜上，室温晾干；

d）封闭：用0.1%的TBST配置5%的脱脂奶粉，室温封闭2h；

e）一抗：5%脱脂奶粉按1：1000稀释肺炎链球菌19F型CPS抗血清，室温孵育2h；

f）洗膜：0.1%的TBST洗膜3洗，每次5min；

g）二抗：5%的脱脂奶粉按1：5000稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗，室温1h；

h）洗膜：0.1%的TBST洗膜4洗，每次5min；

i）显色：在PVDF膜上加入现配的ECL反应液（Millipore）反应1min，采用Bio-RadChemiDocXRS+成像仪成像——见附图12。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。