一种类风湿因子(IgM型)及其他抗原特异性IgM抗体联合检测的方法

摘要

本发明提供一种类风湿因子(IgM型)及其他抗原特异性IgM抗体联合检测试纸条，所述试纸条包括在聚氯乙烯胶板上依次贴附的样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上依次分别包被有第一检测线、吸附线、一条或多条检测线和质控线；所述第一检测线为变性兔/人IgG，所述吸附线为抗人IgG的抗体，所述质控线为人IgM，所述一条或多条检测线分别选自以下一种或多种特异性抗原：肺炎支原体特异性抗原、流感B型特异性抗原、弓形虫病原体特异性抗原、自身免疫性抗原和过敏原。本发明还提供了包括该试纸条的试剂盒，该试纸条的制备方法，使用该试纸条或试剂盒进行检测的方法，和该试纸条或试剂盒的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种试纸条。具体而言，本发明涉及一种类风湿因子(IgM型)及其他抗原特异性IgM抗体联合检测试纸条，以及包括该试纸条的试剂盒，该试纸条的制备方法，使用该试纸条或试剂盒进行检测的方法，和该试纸条或试剂盒的应用。

背景技术

类风湿因子(RF)是一种以变性免疫球蛋白G(IgG)为靶抗原的自身抗体，无种属特异性。类风湿性关节炎(RA)病人和约50％的健康人体内有产生RF的B细胞克隆，在某些病理因素如变性IgG或EB病毒直接作用下，可大量合成产生RF。RF与天然IgG结合能力较差，但易与免疫复合物中的IgG或聚合IgG反应。RF有IgG、IgA、IgM、IgD、IgE 5种类型，检测RF的方法主要是测定IgM类RF。检测RF对类风湿性关节炎(RA)的诊断、分型和疗效观察有重要意义。

免疫球蛋白M(IgM)是人类或者动物体内非常重要的一种抗体。当机体感染病原体或其他抗原后，在体内，最早出现的是病原体或其他抗原特异性的IgM抗体，之后再出现病原体或其他抗原特异性的IgG抗体。因此，通过检测机体内抗原特异性IgM的存在与否，可以诊断人或者动物近期感染病原体或其他抗原的免疫反应状态。血清内若检测出特异性的病原体IgM或其他类型抗原引起的特异性IgM，可以证明该机体有近期病原体感染或其他抗原引起的如自身性免疫疾病的发生，可以作为病原体感染及免疫疾病等的诊断及用药依据，能够尽早地给予病人更好的治疗。准确、快速的诊断方法可以避免抗生素或其他药物的不必要使用，并可以及时给出准确地治疗方案，因此病原体或其他抗原特异性IgM检测方法的建立具有非常重要的意义。

从检测免疫反应原理的角度分析，检测抗原特异性IgM通常使用捕获法和间接法。捕获法，一般会提高检测的特异性，但由于抗IgM抗体并不能识别特异性和非特异性IgM，常常会造成漏检现象，导致检测灵敏度偏低；而如果使用间接法原理检测，一般认为检测特异性IgM抗体前，若不去除患者样本中的IgG类抗体，很容易造成类风湿因子(IgM型)与特异性IgG及特异性抗原复合物反应导致IgM假阳性，也会造成特异性IgG与特异性IgM竞争抗原结合位点而导致IgM假阴性。

目前通过酶联免疫试剂盒检测样品中的类风湿因子或抗原特异性IgM已经是一种成熟的技术。检测产品基本分为三类：

一类是传统的微孔板产品，但它的检测过程所耗费时间较长(一般需要几个小时)，使用的试剂和样品量也较大，不能满足少量样品或临床及时检测的需求，检测原理是单纯的捕获法或间接法，均存在一定的不足。

一类是荧光标记检测玻片产品，该类产品试剂用量减少，但检测时间仍较长，并且大部分此类产品的结果还需要借助昂贵的荧光显微镜来观察判读，这种直观判断需要技术人员的丰富经验且耗费时间，因此不适合临场快速检测。

另一类是免疫层析类产品，多为胶体金试纸条，比较快速和简便，但已有产品的应用有一定局限性，例如多数产品仅使用捕获法原理检测IgM抗体，致使漏检率较高，而且不能满足多指标、多样本同时检测。另外，有较少产品使用间接法原理联合检测，但如果该产品没有对特异性IgG及类风湿因子的干扰进行处理和消除，容易出现假阳性和假阴性，导致结果不准确。

免疫层析技术是一种快速现场检测技术，操作简便，如胶体金试纸条产品一般15分钟内即可肉眼读出结果，其基本构造为所述层析试纸条在聚氯乙烯(PVC)背板上一端顺次相互搭接地贴附有样品垫、复合物垫、硝基纤维素膜，另一端贴附有吸收垫。所述复合物垫为涂覆有抗体一胶体金复合物(或其他微粒复合物)的玻璃纤维素膜。已有多篇文献报道采用胶体金试纸条检测IgM抗体，有的没有对IgG和类风湿因子的干扰进行处理，容易造成结果不准确；有的只简单增加了能够吸附人IgG和类风湿因子的一条吸附线或吸附处理步骤，没有增加类风湿因子的检测线，不能实现类风湿因子的检测。

但随着市场需求的增长，医院和病人急需能够联合、快速检测的产品，这也成为当今检测产品发展的趋势。因此，基于类风湿因子对抗原特异性IgM抗体检测时的干扰和原理上分析，进行二者的联合、快速检测产品的研发非常有意义。

发明内容

因此，基于上述已有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种类风湿因子(IgM型)及其他抗原特异性IgM抗体联合检测试纸条，以及包括该试纸条的试剂盒，该试纸条的制备方法，使用该试纸条或试剂盒进行检测的方法，和该试纸条或试剂盒的应用。

针对上述发明目的，本发明是通过下述技术方案实现的：

本发明提供一种类风湿因子(IgM型)及其他抗原特异性IgM抗体联合检测试纸条，其中，所述试纸条包括在聚氯乙烯胶板上依次贴附的样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上包被有第一检测线(下文中可简称为T1线)、吸附线(下文中可简称为A线)、一条或多条检测线(下文中可分别简称为T2线、T3线、……)和质控线(下文中可简称为C线)；所述第一检测线为变性兔/人IgG，所述吸附线为抗人IgG的抗体，所述质控线为人IgM，所述检测线分别选自以下一种或多种特异性抗原：肺炎支原体特异性抗原、流感B型特异性抗原、弓形虫等病原体特异性抗原、自身免疫性抗原和过敏原等。优选地，所述特异性抗原为培养病原体经裂解和/或灭活后并经过纯化后得到的多表位抗原。其中，涉及病原体抗原包被所述检测线时，所述病原体抗原可以为提取天然纯化后多表位病原体抗原，所述多表位病原体抗原比重组抗原具有更高灵敏度。

优选地，根据前述的试纸条，其中，所述样品垫为玻璃纤维膜。和/或所述吸水垫为吸水纸。

更优选地，根据前述的试纸条，其中，所述结合物垫为覆有抗人IgM抗体-胶体金结合物的玻璃纤维膜。所述抗人IgM抗体的免疫原优选为人IgM的Fc5μ片段；和/或所述抗人IgM抗体优选为羊抗人IgM的IgG抗体，更优选为所述羊源的IgG抗体的F(ab')2片段。其中，所述结合物垫也可以为覆有抗人IgM抗体-其他有色或微粒结合物的玻璃纤维膜。其中，所述抗人IgM抗体-胶体金结合物具有高度特异性，不会与所述吸附线吸附的IgG抗体进行交叉反应而显色。所述抗人IgM抗体-胶体金结合物的高度特异性也可以表现为：所述抗人IgM抗体可以为IgG抗体去除Fc片段后的F(ab')2片段，该抗人IgM抗体在结合血清样本特异性IgM形成复合物后，不会被类风湿因子(结合变性IgG的Fc段)结合反应而造成类风湿因子检测线的假阴性，从而提高了本发明中类风湿因子检测线的特异性。

再优选地，根据前述的试纸条，其中，所述试纸条的宽度为适宜宽度。优选为3～5mm。更优选为4mm。

还优选地，根据前述的试纸条，其中，所述第一检测线、吸附线、检测线和质控线的各相邻线的间隔为适宜宽度。优选为3～8mm。更优选为3mm。所述样品垫与结合物垫之间重叠1～2mm，优选为1mm。所述结合物垫与硝酸纤维素膜之间重叠1～2mm，优选为1mm。和/或所述硝酸纤维素膜与吸水垫之间重叠1～2mm，优选为1mm。

本发明还提供了上述的试纸条的制备方法，其中，所述制备方法包括：

(1)采用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金溶液：向烧杯中加入1000mL三蒸水，然后加入10mL的1质量％的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后，再加入10mL的1质量％的氯金酸溶液，煮沸15min后至冷却，得到所述的胶体金溶液；

(2)制备结合垫：取20mL步骤(1)制备的胶体金溶液置于烧杯中，加入150μL 0.1M的K₂CO₃溶液调节溶液的pH至7.6，搅拌均匀，然后加入离心好的抗人IgM抗体，搅拌20min，然后加入2mL>

(3)组装试纸条：将样品垫、步骤(2)制备的结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫顺次相互搭接地贴附在聚氯乙烯底板上，得到组装试纸条；

(4)包被硝酸纤维素膜：通过划膜仪将变性兔/人IgG、抗人IgG的抗体、抗原特异性IgM抗体的抗原和人IgM依次分别包被在步骤(3)的组装试纸条的硝酸纤维素膜上，即为所述试纸条。该试纸条还可进一步进行剪切、包装、密封保存等操作以按需制备相应产品，例如将所述试纸条的PVC胶板及贴附材料切成宽度为4mm的试纸条；

优选地，步骤(2)中所述抗人IgM抗体事先通过以下方法处理：使用胃蛋白酶消化抗人IgM的IgG抗体，亲和纯化处理获得所述抗人IgM抗体F(ab')2片段。

其中，所用的玻璃仪器可以事先用洗液过夜浸泡，然后冲洗干净。

优选地，根据前述的试纸条的制备方法，其中，步骤(4)中所述变性兔/人IgG、抗人IgG的抗体、抗原特异性IgM抗体的抗原和人IgM的浓度分别独立为0.3mg/mL。

本发明还提供一种类风湿因子(IgM型)及其他抗原特异性IgM抗体联合检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述的试纸条或采用上述的方法制备的试纸条。优选地，所述试剂盒进一步包括铝箔袋以及密封在所述铝箔袋中干燥剂。和/或滴管。

本发明还提供了一种类风湿因子(IgM型)和其他抗原特异性IgM的检测方法，所述检测方法基于上述的试纸条、采用上述的方法制备的试纸条或上述的试剂盒，其中，所述检测方法包括：

(1)将所述试纸条平放在检测台面上，向样品垫滴加100μl样品，所述样品为全血或血清，10～15分钟后观察第一检测线、检测线和质控线的显色结果，30分钟后的显色结果视为无效；

(2)根据标准判断所述样品中类风湿因子(IgM型)和其他抗原特异性IgM抗体的情况：

当第一检测线、检测线和质控线均显示红色条带，结果判定为；类风湿因子(IgM型)阳性和其他抗原特异性IgM抗体阳性，

当第一检测线未显示红色条带，检测线和质控线均显示红色条带，结果判定为；类风湿因子(IgM型)阴性和其他抗原特异性IgM抗体阳性，

当第一检测线和质控线均显示红色条带，检测线未显示红色条带，结果判定为；类风湿因子(IgM型)阳性和其他抗原特异性IgM抗体阴性，

当第一检测线和检测线未显示红色条带，质控线显示红色条带，结果判定为；类风湿因子(IgM型)阴性和其他抗原特异性IgM抗体阴性，

当质控线未显示红色条带，结果判定为；检测无效。

具体地，也可用下表判断所述样品中类风湿因子(IgM型)和其他抗原特异性IgM抗体的情况：

其中“+”表示显示红色条带，“-”表示未显示红色条带，“/”表示显示或未显示红色条带：

本发明还提供了上述的试纸条、采用上述的方法制备的试纸条或上述的试剂盒在制备用于检测和/或诊断以下一种或多种的产品中的应用：类风湿免疫疾病，优选地，所述类风湿免疫疾病为类风湿性关节炎；病原体近期感染，优选地，所述病原体为肺炎支原体和/或B型流感病毒等多种病原体；优生优育，优选地，所述优生优育为检测弓形虫；自身免疫系统疾病，优选地，所述自身免疫系统疾病为系统性红斑狼疮(SLE)和/或干燥症(SS)等。

具体地，本发明涉及一种能够联合检测类风湿因子(IgM)及其他抗原特异性IgM抗体的方法。在该方法中，样本依次通过类风湿因子(IgM)检测区(即T1线)、IgG吸附区(即A线)、其他抗原特异性IgM检测区(即T2线、T3线、……)。并提供了所述方法应用在基于免疫层析快速检测胶体金试纸条中的制备方法。

具体内容如下：

在聚氯乙烯(PVC)胶板上一端顺次相互搭接地贴上样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，然后将PVC胶板及贴附的材料切成适合(4mm)宽度的试纸条。

其中，所述样品垫为玻璃纤维膜，所述结合物垫为覆有抗人IgM抗体-胶体金结合物或其他有色或微粒结合物的玻璃纤维膜，优选胶体金结合物；所述硝酸纤维素膜上包被至少三条线，分别为：T1线即变性兔/人IgG,用于检测人类风湿因子(IgM)；A线即抗人IgG的抗体，用于吸附样本中的IgG抗体；T2(T3、T4……)线即不同病原体或其他类引起抗体反应的特异性抗原；C线即人IgM(如图1所示)。

其中，T1线即人类风湿因子(IgM)检测线，T2(T3、T4……)线即优化的不同病原特异性抗原或其他类疾病可引起人体IgM抗体反应的经纯化的天然多表位特异性抗原，如感染病原体引起肺炎的肺炎支原体抗原、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮检测的dsDNA抗原等、优生优育如弓形虫抗原等或其他用于IgM抗体检测用途的任意一种特异性或多种特异性抗原。根据检测项目需求，可实现多种抗原的特异性IgM抗体的检测，并提高灵敏度。

本发明还涉及一种能够联合检测类风湿因子(IgM)及其他特异性IgM抗体的分析方法，包括胶体金试纸条技术在类风湿免疫疾病、病原体近期感染和自身免疫系统疾病或其他检测用途的特异性IgM抗体检测中的应用，具体内容如下：

在加样区(即样品垫)加入被检测样品后，通过层析/毛细作用，样品中IgM类抗体和抗人IgM-胶体金的结合物向吸水纸一端的方向移动。如果被检测样品中含有类风湿因子(IgM型)，当样品移动到T1线即变性的IgG的包被线时，类风湿因子(IgM型)和抗人IgM-胶体金的结合物被捕获，在T1线显示一条紫红色条带，并且类风湿因子(IgM型)不再向后移动造成对特异性IgM检测区的干扰。样品继续流动，样品中的IgG抗体则与A线即抗人IgG的抗体结合，用于吸附样本中的IgG抗体，将特异性IgG抗体捕获在A线上，不再与针对的同一抗原反应的特异性IgM竞争反应位点，增强特异性IgM检测的灵敏度与特异性。样品继续流动，含有针对某种或多种一次包被的特异性抗原的IgM抗体，当样品通过T2(T3、T4……)线即不同病原体或其他类引起抗体反应的特异性抗原包被线时，样品中的特异性IgM抗体和抗人IgM抗体-胶体金的结合物被捕获，通过间接法的原理在T2(T3、T4……)线显示一条或多条紫红色条带，本检测区特异性IgM的检测不再受样本中可能存在的类风湿因子及IgG造成的假阳性或假阴性的干扰。样品继续移动至C线时，样品携带的抗人IgM抗体-胶体金结合物则与C线处的人IgM抗体结合，在C线显示一条紫红色条带。

优选的，被检测样品为全血或血清。

若T1，T2(T3、T4……)线都显示红色条带，说明样品中同时含有类风湿因子(IgM)和对应的某种特异性的IgM；若T1线未显示红色条带，而T2(T3、T4……)线显示红色条带，则说明含有对应某种特异性的IgM；若T1线显示红色条带，而T2(T3、T4……)线未显示红色条带，则含有类风湿因子(IgM)；若T1和T2(T3、T4……)线未显色，则表示类风湿因子(IgM)和某种特异性IgM均为阴性；无论T1，T2(T3、T4……)线情况如何，只要C线处未显示红色条带，则该试纸条判定为无效。

如果特异性IgM是阳性，表明该机体有近期感染某种病原体，或有自身免疫抗体异常反应；如果RF(IgM型)是阳性，表明该机体可能有导致类风湿类子产生的异常因素,提示存在类风湿免疫性疾病的风险；如果RF(IgM型)和特异性IgM都是阳性，表明该机体近期感染某种病原体，并存在可能有导致类分湿类子产生的异常因素；如果RF(IgM型)和特异性IgM都是阴性，表明未曾感染某种病原体，类分湿类子产生的异常因素风险较低；无论T1，和T2(T3、T4……)处情况如何，如果C线不显色，该检测试纸条被视为无效。

本发明提供的试纸条基于这种样本依次通过类风湿因子(IgM)检测区、IgG吸附区、其他抗原特异性IgM检测区的分析方法，改变传统的单独检测特异性IgM抗体或类风湿因子(IgM型)的方法，克服在常规检测中类风湿因子易于对特异性IgM抗体检测造成干扰的不足，并且联合检测通过同一个样本中是否存在类风湿因子(IgM型)的检测结果来排除是否有类风湿因子会对后面的特异性IgM抗体检测造成假阳性干扰的影响，例如若一个样本检测类风湿因子(IgM型)的检测结果为阴性，则首先可排除该样本不存在类风湿因子(IgM型)对后面的特异性IgM抗体检测的干扰；若一个样本检测类风湿因子(IgM型)的检测结果为阳性，则表明我们的检测方法先明确了这是一例会存在类风湿因子(IgM型)对特异性IgM抗体检测造成干扰的样本，但由于我们的设计增加了该项检测已经捕获了样本中的类风湿因子(IgM型)，因此避免了对后面的特异性IgM抗体检测的干扰该试纸条在特异性抗原IgM抗体检测线前，增加类风湿因子

(IgM)检测线及吸附IgG线，不仅可以在一次检测中同时检测多种特异性IgM抗体并去除IgG的干扰，还实现了类风湿因子(IgM型)的同时检测，并减去了样本中类风湿因子和IgG抗体对利用间接法检测特异性IgM抗体造成的假阳性干扰，充分体现了本检测方案中间接法原理检测特异性IgM的灵敏度和特异性的优势。

基于免疫层析技术，该试纸条更加突出了多指标的胶体金免疫层析技术快速检测、价格低廉、读取结果快捷而直观等特点，不需要特殊仪器设备，也不需要专业人员的操作，检测结果的总体符合率较高，可以大大缩短检测时间和降低检测费用，达到现场检测的目的。

除此之外，该试纸条改进了以往免疫层析技术中常用捕获法原理检测特异性IgM抗体的不足，因为使用捕获法原理的检测区不能识别特异性IgM和非特异性IgM,而可能造成只捕获非特异性IgM，而特异性IgM漏检的情况，使得灵敏度降低；其次改进了以往免疫层析技术使用间接法原理多包被重组抗原，而导致抗原表位单一而使灵敏度降低的情况，本方法包被优化的天然培养的病原体经后续处理和纯化后的多表位抗原，提高了灵敏度；也改进了以往免疫层析技术使用间接法原理，但没有去除IgG和类风湿因子影响的检测方法，而造成检测特异性IgM抗体出现假阳性和假阴性的情况，或有的间接法中虽有IgG吸附处理，但没有实现类风湿因子

(IgM)的同时检测，不能明确和排除某样本是否真的存在类风湿因子造成IgM检测干扰的判读。换言之，本发明提供的试纸条在一次检测中既能够避免样本中IgG抗体及类风湿因子对检测的干扰，又能够利用间接法提高灵敏度，并实现同时检测并清除区分特异性IgM和类风湿因子(IgM)的阴性和阳性结果，从而获取更多的相关信息，具有重要的临床意义。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了一种类风湿因子(IgM型)及其他抗原特异性IgM抗体的检测方法的示意图；

图2示出了类风湿因子(IgM型)及其他抗原特异性IgM抗体联合检测试纸条示意图；

图3示出了图3～5所用标记以及所述试纸条结构；

图4示出了所述试纸条有效的检测结果；

图5示出了所述试纸条无效的检测结果；

附图标记说明：

1、加样区；2、抗人IgM抗体-微粒结合物区；3、硝酸纤维素膜；4、RF(IgM型)检测区；5、吸附IgG抗体区；6、特异性IgM抗体检测区；7、质检区；8、吸收垫；

9、样品垫；10、结合物垫(可以是覆有抗人IgM抗体-胶体金结合物的结合物垫)；11、T1线(即检测类风湿因子(IgM型)区)；12、A线(即吸附IgG抗体区)；13、T2线(即特异性IgM抗体检测区)；14、C线(即质控区)；15、吸水垫(可以是吸水纸)；

16、变性IgG(可以是变性兔/人IgG)；17、抗人IgG的抗体；18、类风湿因子(可以是类风湿因子(IgM型))；19、特异性IgM；20、人IgM；21、特异性IgM的抗原；22、金标抗体结合物(可以是抗人IgM抗体-胶体金结合物)；23、纳米颗粒(可以是胶体金)；24、抗人IgM抗体；25、人IgG；

26、检测结果为RF(IgM)阳性和特异性抗体IgM阳性；27、检测结果为RF(IgM)阴性和特异性抗体IgM阳性；28、检测结果为RF(IgM)阳性和特异性抗体IgM阴性；29、检测结果为RF(IgM)阴性和特异性抗体IgM阴性；

30～33、分别为检测结果无效的四种情况。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

以下实施例中，除具体指明的试验材料、条件以及操作方法外，实施例中所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的。因此，本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

以下实施例中使用的试剂和仪器如下：

试剂：

变性兔/人IgG：菲鹏生物股份有限公司；

抗人IgM的抗体、抗人IgG的抗体：北京博奥森生物技术有限公司；

人IgM：sigma；

硝酸纤维素膜：默克密理博；

PVC胶板、吸水纸、玻璃纤维膜：上海金标生物科技有限公司；

肺炎支原体IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)：深圳市安群生物工程有限公司；

类风湿因子IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)：潍坊市康华生物技术有限公司。

仪器：

三维平面划膜仪：上海金标生物科技有限公司；

冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；

切条机：上海金标生物科技有限公司。

实施例1

本实施例用于说明本发明选用的高度特异性抗人IgM抗体的验证方法和结果。

方法1包括：纯化的人IgG，浓度为1ug/ml，100ul/孔在聚苯乙烯微孔板4度过夜包被；使用3％牛血清白蛋白(BSA)，200ul/孔，37度2小时进行封闭；然后加入抗人IgM-HRP，100ul/孔，37度30分钟，洗涤后，加入TMB显色液，避光10分钟后进行酶标仪检测OD_450nm-630nm；并做包被人IgM的阳性对照孔和空白对照孔；均为多孔平行，求均值。检测结果如表1。

方法2包括：试纸条包括在聚氯乙烯胶板上依次贴附的样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述样品垫为玻璃纤维膜；所述结合物垫为具有抗人IgM抗体-胶体金结合物的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜上依次分别包被有检测线和质控线；所述检测线为人IgG，所述质控线为人IgM；所述吸水垫为吸水纸。向样品垫滴加100μl pbs缓冲液，10～15分钟后观察检测线和质控线的显色结果，30分钟后的显色结果视为无效。检测结果如表2。

从本实施例中方法1和方法2的检测结果可知，本发明使用的抗人IgM抗体具有高度特异性，不与人IgG交叉反应。

表1

表2

实施例2

本实施例用于说明本发明的类风湿因子(IgM型)及其他抗原特异性IgM抗体联合检测试纸条和试剂盒及其制备方法。

如图2所示，本实施例的试纸条包括在聚氯乙烯胶板上依次贴附的样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述样品垫为玻璃纤维膜；所述结合物垫为具有抗人IgM抗体-胶体金结合物的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜上依次分别包被有第一检测线、吸附线、一条检测线和质控线；所述第一检测线为变性兔/人IgG，所述吸附线为抗人IgG的抗体，所述质控线为人IgM，所述检测线为经过纯化后的肺炎支原体特异性天然多表位抗原；所述吸水垫为吸水纸。

其中，第一检测线、吸附线、检测线和质控线的各相邻线的间隔为3～8mm。所述样品垫与结合物垫之间重叠1～2mm，所述结合物垫与硝酸纤维素膜之间重叠1～2mm，所述硝酸纤维素膜与吸水垫之间重叠1～2mm。所述试纸条的宽度为适宜宽度。在本实施例中，第一检测线、吸附线、检测线和质控线的各相邻线的间隔为3mm。所述样品垫与结合物垫之间重叠1mm，所述结合物垫与硝酸纤维素膜之间重叠1mm，所述硝酸纤维素膜与吸水垫之间重叠1mm，所述试纸条的宽度为4mm。

上述试纸条的制备方法如下：

(1)采用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金溶液：向烧杯中加入1000mL三蒸水，然后加入10mL的1质量％的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后，再加入10mL的1质量％的氯金酸溶液，煮沸15min后至冷却，得到所述的胶体金溶液；

(2)制备结合垫：取20mL步骤(1)制备的胶体金溶液置于烧杯中，加入150μL 0.1M的K₂CO₃溶液调节溶液的pH至7.6，搅拌均匀，然后加入离心好的抗人IgM抗体，搅拌20min，然后加入2mL>

(3)组装试纸条：将样品垫、步骤(2)制备的结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫顺次相互搭接地贴附在聚氯乙烯底板上，相邻部分重叠1mm，得到组装试纸条；

(4)包被硝酸纤维素膜：采用三维平面划膜仪将变性兔/人IgG、抗人IgG的抗体、肺炎支原体特异性抗原和人IgM依次分别包被在步骤(3)的组装试纸条的硝酸纤维素膜上，其中划膜仪的设定参数为：划线间隔均为3mm，划线浓度为0.3mg/mL；

(5)将步骤(4)处理后的组装试纸切割为宽度4mm的试纸条。本实施例还可进一步提供试剂盒，其包括铝箔袋和密封在所述铝箔袋中的干燥剂、滴管以及上述制备的试纸条。

该试剂盒的制备方法为：将上述制备的试纸条装在铝箔袋中，再装入一个干燥剂和滴管，进行密封并在室温下保存。

实施例3

本实施例用于说明使用实施例2制备的试纸条或试剂盒在RF(IgM型)和肺炎支原体样本检测中的应用。

所述试纸条的使用方法步骤如下：

(1)收集血清样品；

(2)将试纸条平放在检测台面上，向样品垫滴加100μl步骤(1)的血清样品，10～15分钟后观察第一检测线、检测线和质控线的显色结果，30分钟后的显色结果视为无效；

(3)结果判断：根据表3判定结果，其中“+”表示显示红色条带，“-”表示未显示红色条带，“/”表示显示或未显示红色条带：

表3

采用实施例2制备的测试纸条对临床已经确诊的阳性血清和阴性血清进行检测，结果见表4。

表4实施例2检测结果

实施例4

本实施例用于说明本发明的类风湿因子(IgM型)及其他抗原特异性IgM抗体联合检测试纸条和试剂盒及其制备方法。

如图2所示，本实施例的试纸条包括包括在聚氯乙烯胶板上依次贴附的样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述样品垫为玻璃纤维膜；所述结合物垫为具有抗人IgM抗体-胶体金结合物的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜上依次分别包被有第一检测线、吸附线、两条检测线和质控线；所述第一检测线为变性兔/人IgG，所述吸附线为抗人IgG的抗体，所述质控线为人IgM，所述检测线分别为经过纯化后的肺炎支原体特异性天然多表位抗原和经过纯化后的流感B型特异性天然多表位抗原；所述吸水垫为吸水纸。

其中，第一检测线、吸附线、检测线和质控线的各相邻线的间隔为3mm。所述样品垫与结合物垫之间重叠1mm，所述结合物垫与硝酸纤维素膜之间重叠1mm，所述硝酸纤维素膜与吸水垫之间重叠1mm。所述试纸条的宽度为4mm。

上述试纸条的制备方法如下：

(1)采用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金溶液：向烧杯中加入1000mL三蒸水，然后加入10mL的1质量％的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后，再加入10mL的1质量％的氯金酸溶液，煮沸15min后至冷却，得到所述的胶体金溶液；

(2)制备结合垫：取20mL步骤(1)制备的胶体金溶液置于烧杯中，加入150μL 0.1M的K₂CO₃溶液调节溶液的pH至7.6，搅拌均匀，然后加入离心好的抗人IgM抗体，搅拌20min，然后加入2mL>

(3)组装试纸条：将样品垫、步骤(2)制备的结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫顺次相互搭接地贴附在聚氯乙烯底板上，相邻部分重叠1mm，得到组装试纸条；

(4)包被硝酸纤维素膜：采用三维平面划膜仪将变性兔/人IgG、抗人IgG的抗体、肺炎支原体特异性抗原、流感B型特异性抗原和人IgM依次分别包被在步骤(3)的组装试纸条的硝酸纤维素膜上，其中划膜仪的设定参数为：划线间隔均为3mm，划线浓度为0.3mg/mL；

(5)将步骤(4)处理后的组装试纸切割为宽度4mm的试纸条。本实施例还可进一步提供试剂盒，其包括铝箔袋和密封在所述铝箔袋中的干燥剂、滴管以及上述制备的试纸条。

该试剂盒的制备方法为：将上述制备的试纸条装在铝箔袋中，再装入一个干燥剂和滴管，进行密封并在室温下保存。

实施例5

本实施例用于说明使用实施例4制备的试纸条或试剂盒在RF(IgM型)和肺炎支原体、流感B型样本检测中的应用。

所述试纸条的使用方法步骤如下：

(1)收集血清样品；

(2)将试纸条平放在检测台面上，向样品垫滴加100μl步骤(1)的血清样品，10～15分钟后观察第一检测线、检测线和质控线的显色结果，30分钟后的显色结果视为无效；

(3)结果判断：根据表3判定结果。

采用实施例4制备的测试纸条对临床已经确诊的阳性血清和阴性血清进行检测，其中，RF(IgM型)和肺炎支原体IgM抗体阳性样本与实施案例2中相同，新增加流感B型特异性IgM阳性样本100例和三指标IgM共同阴性样本150例进行检测。

结果见表5。

表5 实施例5检测结果

试验例1

本试验例用于说明实施例2制备的试纸条和商购检测产品的检测对比试验。

受试样品为100例临床已经确诊的类风湿因子(IgM型)阳性样品、100例临床已经确诊的肺炎支原体阳性样品以及150例共阴性样品。

实施例2制备的试纸条采用实施例3的方法进行检测。

肺炎支原体IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)和类风湿因子IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)采用其说明书中使用方法进行检测。

检测结果见表6。从检测结果可知，与肺炎支原体IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)相比，实施例2制备的试纸条对受试样品具有更高的符合率；而与类风湿因子IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)相比，实施例2制备的试纸条对类风湿因子的检测结果稳定且更加准确。

表6

尽管在此，已对本发明进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，所属领域技术人员可进行各个条件的适当变化。可以理解的是，本发明不限于所述实施方案概括和具体实例，其权利归于权利要求的范围，并包括所述每个因素的等同替换。