CK-MB校准品稀释液及其在临床CK检测中的应用

摘要

本发明涉及医学检测试剂，特别是CK‑MB校准品稀释液及其在临床CK检测中的应用。用于CK‑MB校准品的稀释液，是在缓冲液中加入终浓度为0.01‑0.12g/ml的玉米蛋白、终浓度0.5‑4mM的谷胱甘肽、终浓度3‑20％V/V的胎牛血清和终浓度3‑20mM的EDTA配制而得。所述稀释液最大程度地提高了CK‑MB校准品的稳定性，解决了目前存在的CK‑MB校准品不稳定的问题，提高临床CK检测的准确性，为临床相关疾病的诊断提供更准确的依据。

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测试剂，特别是CK-MB校准品稀释液及其在临床CK检测中的应用。

技术背景

肌酸激酶(creatine kinase,CK)以二聚体的形式存在，在收缩组织高能磷酸键的产生和应用上具有重要作用。而且，在细胞浆内，线粒体产生的ATP通过磷酸肌酸传递到使用部位，肌酸激酶起到“穿梭运输”的作用。“穿梭假想”在一些组织得到证实，在肾脏远曲小管，尽管它并不收缩，但是需要大量ATP供给钠钾泵维持离子梯度。CK催化的化学反应为：肌酸(Creatine)+ATP在CK催化下生成磷酸肌酸(creatine phosphate,CP)和ADP。线粒体产生的ATP存储在CP中，经过转用到使用部位。

CK的分子量较大(>80kd)，不能通过肾脏排泄，一些研究表明CK是由网状内皮系统清除，如肝脏的网状内皮系统。总CK的升高可见于试验室分析的干扰、坏死组织的释放，总CK是骨骼肌、心肌损伤的非常敏感的指标，常见于各种骨骼肌损伤，一些临床药物如镇静药、抗抑郁药物可引起CK增高，蜜蜂叮咬等也可引起升高。杜氏肌营养不良患者早期轻度升高，在成人神经肌肉疾病也会升高。此时，心脏肌钙蛋白可作为不同来源损伤的鉴别指标。临床CK检查通过酶法检测，即检测CK催化磷酸肌酸转化的活性。

CK的同工酶，有四个基因编码CK亚基，M亚单位(19号染色体)，B亚单位(14号染色体)，另外2个线粒体亚单位。还有第5个B亚单位的假基因(16号染色体)。M和B亚单位结合形成三个同工酶CK-MM、CK-BB、CK-MB，分子量在86-89ku。尽管CK活性需要二聚体存在，各亚单位也存在催化活性。在不同组织，3种同工酶的分布是不一样的，骨骼肌组织(99％MM，1％MB)，心脏组织(77％MM，22％MB，1％BB)，脑组织(100％BB)，肠道、胃、膀胱等(0-6％MM、MB，92-96％BB)。由此可见，在不同的组织损伤产生的同工酶是不一样的。CK-MB同工酶问世后，一度成为AMI(Acute Myocardial Infarction，急性心肌梗死)诊断的“金指标”。同时，在血清中还存在CK的同工酶变异体，“巨大CK”1型、2型，尽管日常不检测它们，但是它们会影响CK-MB的检测，包括免疫抑制法和电泳法。

最早的检测CK-MB的方法是柱层析和电泳的方法，通过分离得到CK不同同工酶的条带。免疫抑制的方法最早开发于1975年，目前在全球广泛的使用。它是将M亚基的多克隆抗体抑制M亚基后，用传统的总CK方法检测剩余亚基的活性，由于BB亚基相对量少，可以忽略不计，CK-MM被完全抑制，CK-MB测定值为实际活性的一半，测定值乘以2就得到CK-MB的值。免疫抑制法的优点在于成本较低同时可以在生化分析仪上大量检测。缺点在于不特异，如果BB亚型增高会对结果产生较大影响，巨大CK也会对结果产生较大影响，甚 至造成CK-MB超出总CK活性的情况。另外腺苷激酶(Adenylate kinase,AK)也会影响检测，AK在红细胞中含量较大，在溶血的标本，检测时AK会影响CK-MB的值。

由于CK-MB免疫抑制法的非特异性，临床常用它进行筛选，对于升高患者需要用其他方法来验证，在总CK<100U/L时，可以不用检测CK-MB，因为往往它们是正常的。这也适应于急性心肌梗早期，酶水平还没有升高的时候。同时通过CK指数(CK同工酶活性/总CK)可以间接判断CK来源，如CK-MB超出上限，而CK-MB/总CK<4％，往往是由于骨骼肌释放出来的可能性比较大；如CK-MB/总CK>25％，要考虑到CK-BB和巨大CK(1型和2型)的存在，因为AMI患者很少超出这个范围，如果在4％-25％，应该连续监测样本活性，诊断AMI的准确性>90％。

自从1960年以来，CK-MB成为AMI的金标准，不同的检测方法应用于临床，包括层析法、电泳法、免疫抑制法。然而，为了提高反应的特异性，缩短检测时间，开发出质量法(CK-MBmass)，单位ug/L,最高灵敏度为1ng/ml，比CK-MB特异，最小检测时间为7分钟。它使用双位点免疫分析技术，用抗M亚单位抗体、抗B亚单位抗体、抗MB特异性抗体检测抗原。它检测是抗原的量而不是活性，所以和CK总活性及CK-MB活性不同，不会受酶活力衰减的影响。

CK-MB的临床运用在于ACS(Acute Coronary Syndromes，急性冠状动脉综合征)的判断，总CK斜率结合CK-MB浓度可以在4h准确判断AMI；CK-MB在入院8h(胸痛12-16h)的浓度是最为有效的检测之一，计算变化的斜率更有价值。CK-MB质量法可以在一定的时间内增加AMI的诊断率，并快速筛选出需要再通治疗的患者，结合肌钙蛋白可以提高敏感性。并且，在经静脉溶栓、介入治疗后再通时，CK-MB质量法时间曲线达峰时间提前，可以作为再灌注的指标。

CK-MB质量可作为预后和危险度分层的指标，5％-20％的不稳定型心绞痛患者在第一年进展为AMI或死亡。尸检显示患者存在频繁的小梗死。CK-MB质量法能敏感的检测小的梗死并对患者的预后具有重要价值。对于儿科患者CK-MB的检测意义不大，因为从出生后CK同工酶谱的改变，从CK-BB到CK-MB到CK-MM变化。

由于CK-MB是二聚体的形态存在的，极其不稳定，大多数公司试剂盒的校准品均是以冻干品的形式保存的，在临床应用的过程中，带来很多的不便。因此探索一种稳定的CK-MB校准品在临床中有很大的意义。

发明内容

本发明根据上述领域存在的需求和空白，提供稳定性高的CK-MB校准品稀释液，可用于CK-MB校准品的配制。以下概括本发明要求保护的技术方案：

用于CK-MB校准品的稀释液，其特征在于，是在缓冲液中加入终浓度为0.01-0.12g/ml 的玉米蛋白、终浓度0.5-4mM的谷胱甘肽、终浓度3-20％V/V的胎牛血清和终浓度3-20mM的EDTA配制而得，

所述缓冲液指以下任意一种：

100ml溶液中包含磷酸二氢钠0.0624g、磷酸氢二钠0.716g、氯化钠0.8g，pH值7.4的磷酸缓冲液；

100ml溶液中包含Tris碱1.21g,pH值8.0的Tris缓冲液；

100ml溶液中包含柠檬酸1.92g的柠檬酸缓冲液。

优选地，所述玉米蛋白的终浓度为0.025-0.1g/ml。

优选地，所述谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽,其终浓度为1-3mM mM。

优选地，所述胎牛血清的终浓度为5-15％V/V。

优选地，所述EDTA的终浓度为5-15mM。

一种肌酸激酶体外检测试剂盒，其特征在于，包含CK-MB校准品以及权利要求1-5任一所述的CK-MB校准品稀释液。

本发明提供一种CK-MB校准品稀释液，能够显著提高CK-MB校准品的稳定性，从而提高临床检测CK活性的准确性，有利于相关疾病的准确诊断。是在缓冲液中加入玉米蛋白、谷胱甘肽、胎牛血清、EDTA配制而得。

其中，玉米蛋白粉也称玉米麸质粉,主要由玉米蛋白组成，含有少量的淀粉和纤维。由于玉米蛋白氨基酸组成独特，其支链氨基酸和中性氨基酸含量相当高，系植物蛋白中少有。在一些实施例中，添加玉米蛋白优选终浓度为0.01-0.12g/ml，进一步优选0.025-0.1g/ml，稳定性会明显提高。在另一些实施例中，玉米蛋白在稀释液中的浓度0.05g/ml时，能够最大程度地提高CK-MB校准品的稳定性。

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。存在于几乎身体的每一个细胞，谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用。加入终浓度0.5-4mM谷胱甘肽可以防止缓冲液中成分的氧化作用，提高其稳定性，防止跳管现象的产生。在一些实施例中，还原型谷胱甘肽在稀释液中的浓度为0.5-3mM。在另一些实施例中，还原型谷胱甘肽的浓度为1mM时，CK-MB校准品的稳定性最高。

血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，为蛋白提供一种稳定的微环境。加入3-20％V/V胎牛血清的基质液，可以避免基质效应，同时也可以降低本底的发光值，从而间接起到增加稳定性的作用。在一些实施例中，胎牛血清在稀释液中的浓度为5-15％。在另一些实施例中，稀释液中加入10％的胎牛血清能够最大程度地提高CK-MB校准品的稳定性。

EDTA是一种优良的钙、镁离子螯合剂，用作乳液聚合所用水的螯合剂，除去Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+等金属离子。加入终浓度3-20mM的EDTA后，可以避免其他金属离子对蛋白的干扰，从而增加了蛋白的稳定性。在一些实施例中，EDTA在稀释液中的浓度为5-15mM。在另一些实施例中，EDTA的浓度为10mM时，CK-MB校准品的稳定性最高。

采用这些实施例所提供的稀释液配制的CK-MB校准品制作标准曲线，相关系数r＝0.96以上，校准品在0-300ng/ml之间线性良好。

在本发明的优选实施例中，所述玉米蛋白的浓度为每100ml稀释液中含有5g的玉米蛋白；所述谷胱甘肽的浓度为1mM；所述胎牛血清的浓度为10％V/V；所述EDTA的浓度为10mM；采用所述稀释液配制的校准品制作标准曲线，相关系数r＝0.99，校准品在0-300ng/ml之间线性良好。

综上所述，本发明CK-MB校准品稀释液中的玉米蛋白有很强的蛋白保护作用，还原型谷胱甘肽有抗氧化的作用，胎牛血清能够提供一个稳定的微环境，EDTA可以螯合缓冲液中的金属离子，从而最大程度地提高了CK-MB校准品的稳定性，解决了目前存在的CK-MB校准品不稳定的问题，提高临床CK检测的准确性，为临床相关疾病的诊断提供更准确的依据。

附图说明

图1各缓冲体系下校准品的稳定性比较；

其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第二天、第三天、第五天、第七天、第九天。

图2不同保护剂对校准品稳定性的影响；

其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第二天、第三天、第五天、第七天、第九天。

图3不同浓度EDTA对校准品稳定性的影响；

其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第二天、第三天、第五天、第七天、第九天。

图4不同浓度玉米蛋白对校准品稳定性影响；

其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第二天、第三天、第五天、第七天、第九天。

图5不同浓度胎牛血清对校准品稳定性影响；

其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第二天、第三天、第五天、第七天、第九天。

图6不同浓度还原型谷胱甘肽对校准品稳定性的影响；

其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第二天、 第三天、第五天、第七天、第九天。

图7采用本发明稀释液配制的校准品制作的标准曲线；

图8临床样本测定结果；

其中纵坐标是本发明实施例4所述检测方法测定结果，横坐标是贝克曼CK-MB试剂盒测定结果。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行详细说明，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何形式限制本发明的保护范围。

本实施例所用到的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制或商购获得，规格为实验室纯级即可。

实施例1.CK-MB校准品稀释液的pH值选择

1、不同缓冲体系的CK-MB校准品稀释液的配制

(1)100mlCK-MB校准品缓冲液(PBS)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(2)100mlCK-MB校准品缓冲液(Tris)

称取Tris碱(Amresco，ZA082601)1.21g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值8.0，定容至100ml。

(3)100mlCK-MB校准品缓冲液(柠檬酸)

称取柠檬酸(国药，10007192)1.92g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值6.0，定容至100ml。

2、CK-MB校准品的稳定性试验

用步骤1配制的三种稀释液分别制备300ng/ml的CK-MB(usbiological，货号#C7910-01D)抗原溶液，分别于37℃恒温培养箱中放置9天、7天、5天、3天、2天和1天，以2-8℃条件做对照，进行下列试验：

(1)包被：配制1μg/mL CK-MB抗体(Medix，货号#7501)10mM PB溶液，加入微孔发光 板中，100μL/孔，4℃孵育21h；

(2)封闭：将微孔板中包被液甩干，加入5％BSA 10mM PB溶液，200μL/孔，4℃孵育21h；

(3)加样：将微孔板中封闭液甩干，加入待测样本，50μL/孔，37℃孵育30min；

(4)酶标抗体：将微孔板用洗涤液(含有0.05％(V/V)Tween-20(sigma，44112)的10mM PBS溶液)洗涤5次并甩干，加入50μL/孔HRP标记的CK-MB抗体(Medix，7502)，37℃孵育15min；

(5)底物：将微孔板用洗涤液洗涤5次并甩干，加入底物A和底物B(Thermo，34080)，各50μL/孔，避光反应5min，测定发光值(厦门天众达ECLIA-IIS型化学发光免疫分析仪)，发光强度以相对光单位(RLU)表示。

3、CK-MB校准品在不同pH值条件下的稳定性分析

本试验配制了不同缓冲体系，由此对pH6.0～8.0条件下CK-MB项目的稳定性进行研究。用pH6.0的柠檬酸弱酸体系、pH7.4的磷酸盐弱碱体系、pH8.0的Tris碱性体系这三种缓冲液配制校准品，分别放在37℃恒温培养箱中，进行稳定性试验。如表1-3，P点为300ng/ml校准品，N点为校准品缓冲液。验证在不同缓冲体系之下P点相对光单位(RLU)变化，变化越小表明校准品越稳定。结果表明，在pH7.4的弱碱条件下，P点降幅最低，在15％以下，校准品稳定性较高。(见表1-3)。

表1磷酸盐缓冲液

表2Tris碱缓冲液

表3柠檬酸缓冲液

实施例2.CK-MB校准品稀释液的保护剂选择

1、含有不同保护剂的CK-MB校准品稀释液的配制

(1)100ml CK-MB校准品缓冲液(保护剂为玉米蛋白)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(2)100ml CK-MB校准品缓冲液(保护剂为BSA)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、BSA(Roche,RD1073832)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(3)100ml CK-MB校准品缓冲液(保护剂为casein)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、Casein(Sigam,SC589003)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(4)100ml CK-MB校准品缓冲液(保护剂为商品化蛋白保护剂)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、蛋白保护剂(国药，10758)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

2、CK-MB校准品的稳定性试验

用步骤1配制的四种稀释液分别制备300ng/ml的CK-MB抗原溶液，分别于37℃恒温培养箱中放置9天、7天、5天、3天2天、和1天，以2-8℃条件做对照，测试方法同实施例1。

3、CK-MB校准品在不同保护剂下的稳定性分析

本试验在pH7.4条件下采用了不同的蛋白保护剂，5％玉米蛋白，5％BSA，5％Casein，5％的蛋白保护剂分别配制成校准品稀释液，用这四种校准品稀释液配制校准品，进行稳定性试验。如表4-7，P点为300ng/ml校准品，N点为校准品稀释液。P点相对光单位(RLU)变化，变化越小表明校准品越稳定。结果表明，添加5％玉米蛋白的校准品缓冲液的P点降幅最低，稳定性最好(见表4-7)。

表4 5％玉米蛋白对校准品稳定性的影响

表5 5％BSA对校准品稳定性的影响

表6 5％Casein对校准品稳定性的影响

表7 5％蛋白稳保护剂对校准品稳定性的影响

实施例3.CK-MB校准品稀释液中各成分最适浓度的筛选

1、含不同浓度EDTA的CK-MB校准品稀释液的配制

(1)100ml CK-MB校准品缓冲液(未加EDTA)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(2)100ml CK-MB校准品缓冲液(5mM EDTA)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.146g、 还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(3)100ml CK-MB校准品缓冲液(10mM EDTA)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(4)100ml CK-MB校准品缓冲液(15mM EDTA)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.438g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

2、含不同浓度玉米蛋白的CK-MB校准品稀释液的配制

(1)100mlCK-MB校准品缓冲液(未加玉米蛋白)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(2)100mlCK-MB校准品缓冲液(2.5％玉米蛋白)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)2.5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(3)100mlCK-MB校准品缓冲液(5％玉米蛋白)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(4)100mlCK-MB校准品缓冲液(10％玉米蛋白)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋 白(国药，XW901066)10g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

3、含不同浓度胎牛血清的CK-MB校准品稀释液的配制

(1)100ml CK-MB校准品缓冲液(未加胎牛血清)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(2)100ml CK-MB校准品缓冲液(5％胎牛血清)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)5ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(3)100ml CK-MB校准品缓冲液(10％胎牛血清)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(4)100ml CK-MB校准品缓冲液(15％胎牛血清)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽((Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)15ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

4、含不同浓度还原型谷胱甘肽的CK-MB校准品稀释液的配制

(1)100ml CK-MB校准品缓冲液(未加还原型谷胱甘肽)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(2)100mlCK-MB校准品缓冲液(1mM还原型谷胱甘肽)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、 还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0307g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(3)100mlCK-MB校准品缓冲液(2mM还原型谷胱甘肽)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(4)100mlCK-MB校准品缓冲液(3mM还原型谷胱甘肽)

称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0921g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

5、CK-MB校准品的稳定性试验

用步骤1-4配制的16种稀释液分别制备300ng/ml的CK-MB抗原溶液，分别于37℃恒温培养箱中放置9天、7天、5天、3天2天、和1天，以2-8℃条件做对照进行测试，测试方法同实施例1。

6、不同浓度的稀释液成分对CK-MB校准品稳定性的影响

(1)通过比较不同浓度EDTA(0mM、5mM、10mM、15mM)条件下校准品的稳定性，结果表明，在校准品缓冲液中加入10mM EDTA，校准品的稳定性最好(见表8)。

表8 EDTA浓度筛选

(2)通过比较不同浓度玉米蛋白(0％、2.5％、5％、10％)条件下校准品的稳定性，结果表明，在校准品缓冲液中加入5％玉米蛋白，校准品的稳定性最好(见表9)。

表9玉米蛋白浓度筛选

(3)通过比较不同浓度胎牛血清(0％、5％、10％、20％)条件下校准品的稳定性，结果表明，在校准品缓冲液中加入10％胎牛血清，校准品的稳定性最好(见表10)。

表10胎牛血清浓度筛选

(4)通过比较同浓度还原型谷胱甘肽(0mM、1mM、2mM、3mM)条件下校准品的稳定性，结果表明，在校准品缓冲液中加入1mM还原型谷胱甘肽，校准品的稳定性最好(见表11)。

表11还原型谷胱甘肽浓度筛选

实施例4.CK-MB校准品临床检测应用

收集84例临床样本，选用贝克曼CK-MB体外诊断试剂盒(化学发光法)(注册号国食药监械(进)字2005第3400485号)进行方法学比较。

测定步骤：

(1)按照下列配方配制最佳稀释液：

称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0307g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

(2)用上述步骤(1)得到的稀释液配制300ng/ml、100ng/ml、30ng/ml、10ng/ml、3ng/ml的合成校准品(CK-MB抗原(usbiological，货号#C7910-01D)，作标准曲线；

(3)测定方法：

a.包被：配制1μg/mL CK-MB抗体10mM PB溶液，加入微孔发光板中，100μL/孔，4℃孵育21h；

b.封闭：将微孔板中包被液甩干，加入5％BSA 10mM PB溶液，200μL/孔，4℃孵育21h；

c.抗原：将微孔板中封闭液甩干，加入待测样本，50μL/孔，37℃孵育30min；

d.酶标抗体：将微孔板用洗涤液(含有0.05％(V/V)Tween-20(sigma，44112)的10mM PBS溶液)洗涤3次并甩干，加入50μL/孔HRP标记的CK-MB抗体，37℃孵育15min；

e.底物：将微孔板用洗涤液洗涤3次并甩干，加入底物A和底物B(Thermo，34080)，各50μL/孔，避光反应5min，测定发光值(厦门天众达ECLIA-IIS型化学发光免疫分析仪)，发光强度以相对光单位(RLU)表示。

1.测定结果

采用本发明稀释液配制的校准品制作的标准曲线(logX-logY)如图7所示，相关系数r＝0.99，表明校准品在0-300ng/ml之间线性良好。

将本发明稀释液配制的校准品的测定结果与贝克曼CK-MB体外诊断试剂盒(磁颗粒化学发光法)进行方法学比较，结果如图8所示，相关系数r＝0.96，表明本发明稀释液配制的校准品的测定结果与贝克曼CK-MB试剂盒测定结果高度相关，一致性较高。