一种醛基葡聚糖的合成方法、基于所述醛基葡聚糖的包被方法和微球组合物的制备方法

摘要

本发明涉及一种醛基葡聚糖的合成方法、基于所述醛基葡聚糖的包被方法和微球组合物的制备方法。所述醛化葡聚糖是以卤代缩醛和葡聚糖为原料，经取代、水解反应而成，生成的醛基不易发生交联反应，活性基团醛基密度可控，重现性好，更有利于单抗、蛋白的连接。所述包被方法以环氧乙基微粒为起始原料，代替传统的羧基微粒。可以用有机小分子代替氨基化糖，整个包被过程显得简单、周期短，更适宜用于工业化生产。所述微球组合物的制备方法，将所述醛化葡聚糖包被在微球表面形成醛基葡聚糖微球用于生物分子的共价偶联，该方法工艺简单、操作简便、重复性好。

说明书

技术领域

本发明属于化学合成领域，具体涉及一种醛基葡聚糖的合成方法、基于所述醛基葡聚糖的包被方法和微球组合物的制备方法。

背景技术

聚苯乙烯微球已经大量应用于医疗诊断领域，其主要原理是蛋白质可通过多种方式共价交联到微球表面。微球表面可以修饰环氧基、氯甲基、醛基、羧基等功能化的基团，都可以和抗体的Fc端的氨基进行反应，形成共价键。当选择共价交联方式的时候，往往需要考虑交联的效期、工艺复杂程度和最后的电荷稳定状况。前三种基团可以直接与蛋白的氨基反应，形成共价键，使用起来较方便，但储存稳定性较之羧基微球稍差。而羧基微球则需经过EDC/NHS活化之后，才与蛋白的氨基反应，形成共价键，该方法相对比较稳定，而且是目前市场上主流的标记方法。

但该方法也存在缺陷：

1，以羧基微粒为原料，通过加入EDC/NHS活化形成氨基微粒，然后与蛋白中的氨基进行反应。该反应因为加入了必不可少的活化过程，相比醛基一步法反应更易发生微粒的并集现象，条件不易控制。

2，由于微球表面除了羧基外，其余的都是裸漏的疏水表面，而这些疏水表面在蛋白与微球的结合过程中容易发生非特异性的吸附，并且更容易受到溶剂，pH甚至盐浓度的影响，从而干扰检测结果。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种醛基葡聚糖的合成方法、基于所述醛基葡聚糖的包被方法和微球组合物的制备方法。本发明提出了一种全新的醛基葡聚糖的合成方法，并将其包被在微球表面形成醛基葡聚糖微球用于生物分子的共价偶联，该方法工艺简单、操作简便、重复性好。

本发明所采用的技术方案为：

一种醛基葡聚糖的合成方法，

醛基葡聚糖的新合成方法线路可表示如下：

包括以下步骤：

A、将葡聚糖溶解于水后，惰性气体保护下，加入EDTA、1，4-苯二酚、硼氢化钠、NaOH和甲苯，搅拌回流1-3小时；

B、向体系中滴加2-溴-1，1-二乙氧基乙烷溶液，滴加时间不少于1小时；滴加完成后，搅拌回流12-18小时；

C、将体系中的有机相用水洗涤，得到水溶液，所述水溶液加入甲醇中，得到醛化糖前体沉淀；

D、将所述醛化糖前体沉淀溶于水中，加入甲苯磺酸调pH至1-2，加热水解后，使用NaOH溶液调至中性，以沉淀的形式得到醛基葡聚糖。

通过上述步骤，能够合成出纯度好，收率高的醛基葡聚糖。

优选的，一种醛基葡聚糖的合成方法，包括以下步骤：

A、将20000-40000重量份的葡聚糖溶解于50-130体积份的水后，氮气保护下，加入5-15重量份的EDTA、5-15重量份的1，4-苯二酚、5-15重量份的硼氢化钠、4000-8000重量份的NaOH和40-80体积份的甲苯，搅拌回流1-3小时；

B、向体系中滴加2-溴-1，1-二乙氧基乙烷的甲苯溶液，滴加时间不少于1小时，2-溴-1，1-二乙氧基乙烷与甲苯的体积比为1:4-5；滴加完成后，搅拌回流12-18小时；

C、冷却至室温后，将体系中的有机相用水洗涤三次，每次所用水的体积为120-180体积份，合并水相得到水溶液，所述水溶液加入1500-2500体积份的甲醇中，抽滤后用乙醇洗涤三次，每次所用乙醇的体积为200-280体积份，并将洗涤过的沉淀真空干燥，得到醛化糖前体沉淀；

D、将5000-15000重量份的所述醛化糖前体沉淀溶于30-70体积份的水中，加入甲苯磺酸调pH至1-2，加热至70-90℃进行水解，水解1-3小时后，使用质量分数为30-50％的NaOH溶液调至中性，过滤、除杂后，以沉淀的形式得到醛基葡聚糖。

本发明还提供了一种基于所述醛基葡聚糖合成方法的包被方法，

醛基葡聚糖的包被线路示意可以表示如下，其中微球用圆球表示：

包括以下步骤：

A、将微球加入1，6-己二胺溶液中，反应8-16小时，得到氨化微球；

B、将所述醛基葡聚糖溶解于磷酸盐缓冲液中，加入所述氨化微球，混合均匀后滴加三氢硼氰化钠溶液，反应8-16小时；

C、离心清洗，得到包被有醛基葡聚糖的微球。

优选的，一种基于所述醛基葡聚糖合成方法的包被方法，包括以下步骤：

A、70℃下，将500-1500重量份的环氧乙基微球加入10-30体积份的质量分数为10％的1，6-己二胺溶液中，90℃下搅拌反应8-16小时后，经透析或中空纤维管清洗除去未反应的小分子，得到氨化微球；

B、将2000-3000重量份的所述醛基葡聚糖溶解于40-60体积份的磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH＝6.0，加入所述氨化微球，混合均匀后滴加三氢硼氰化钠溶液，所述三氢硼氰化钠溶液为400重量份的三氢硼氰化钠溶于2.5体积份的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中得到，37℃下反应8-16小时；

C、离心清洗除去未反应的小分子，得到包被有醛基葡聚糖的微球。

所述醛基葡聚糖的合成方法和包被方法具有下列优点：

1、所述醛化葡聚糖是以卤代缩醛和葡聚糖为原料，经取代、水解反应而成，生成的醛基不易发生交联反应，活性基团醛基密度可控，重现性好，更有利于单抗、蛋白的连接。

2、所述包被方法以环氧乙基微粒为起始原料，代替传统的羧基微粒。可以用有机小分子代替氨基化糖，整个包被过程显得简单、周期短，更适宜用于工业化生产。

本发明还提供了一种基于所述包被方法的微球组合物的制备方法，包括以下步骤：

A、受氧微球的制备：将二甲基噻吩、β-二丁酮和稀土配合物放入微球中，形成受氧微球；

B、供氧微球的制备：将光敏剂放入微球中，形成供氧微球；

C、醛基葡聚糖包被微球：将受氧微球或供氧微球加入1，6-己二胺溶液中， 反应8-16小时，得到氨化微球；将所述醛基葡聚糖溶解于磷酸盐缓冲液中，加入所述氨化微球，混合均匀后滴加三氢硼氰化钠溶液，反应8-16小时；离心清洗，得到包被有醛基葡聚糖的受氧微球或供氧微球；

D、所述受氧微球和供氧微球组合为微球组合物。

优选的，一种微球组合物的制备方法，包括以下步骤：

A、受氧微球的制备：将二甲基噻吩、β-二丁酮和稀土配合物放入微球中，形成受氧微球；

B、供氧微球的制备：将光敏剂放入微球中，形成供氧微球；

C、醛基葡聚糖包被微球：70℃下，将500-1500重量份的受氧微球或供氧微球加入10-30体积份的质量分数为10％的1，6-己二胺溶液中，90℃下搅拌反应8-16小时后，经透析或中空纤维管清洗除去未反应的小分子，得到氨化微球；将2000-3000重量份的所述醛基葡聚糖溶解于40-60体积份的磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH＝6.0，加入所述氨化微球，混合均匀后滴加三氢硼氰化钠溶液，所述三氢硼氰化钠溶液为400重量份的三氢硼氰化钠溶于2.5体积份的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中得到，37℃下反应8-16小时；离心清洗除去未反应的小分子，得到包被有醛基葡聚糖的受氧微球或供氧微球；

D、所述受氧微球和供氧微球组合为微球组合物。

优选的，所述稀土配合物为铕配合物或铽配合物；所述光敏剂为光氧染料物质亚甲基蓝，玫瑰红，酞菁化合物和叶绿素A中的一种或组合。因为所述铕配合物和铽配合物的性质相近，均能满足本发明的需要。

优选的，所述铕配合物的合成方法，包括以下步骤：

A、邻苯基联苯溶解于二氯甲烷中，加入氯化铝，冷却至0℃；滴加乙酰氯，滴加完毕后室温反应1-2小时，干燥得到固体物Ⅰ；

B、将所述固体物Ⅰ溶解于无水乙醚中，加入甲醇钠和三氟乙酸乙酯，室温反应2-3小时，干燥得到固体物Ⅱ；

C、将六水合三氯化铕与所述固体物Ⅱ混合均匀，加入无水乙醇溶解，搅拌加入氨水至pH至7-9，室温反应1-2小时后，向体系中加入水，过滤，干燥得到固体物Ⅲ；

D、取4，7-二苯基-1，10-菲咯啉加热溶解于乙醇，冷却后收集重结晶晶体；取所述重结晶晶体与4，7-二苯基-1，10-菲咯啉加入甲苯中，搅拌1-2小时，冷却至室温，除甲苯，得到铕配合物。

进一步的，所述铕配合物的合成方法，包括以下步骤

A、将4500-5000重量份的邻苯基联苯溶解于30-50体积份的无水二氯甲烷中，加入5500-6000重量份的氯化铝，冷却至0℃；滴加3500-4500重量份的乙酰氯，滴加完毕后室温反应1-2小时，将体系中的有机相用水洗涤三次后，用无水硫酸钠干燥得到5000-6000重量份固体物Ⅰ；

B、取3000-3500重量份的所述固体物Ⅰ溶解于30-50体积份的无水乙醚中，加入1500-2500重量份的甲醇钠和3000-5000重量份的三氟乙酸乙酯，室温反应2-3小时，将体系中的有机相用水洗涤三次后，用无水硫酸钠干燥得到1000-2000重量份的固体物Ⅱ；

C、将2800-3200重量份的六水合三氯化铕与6000-6800重量份的所述固体物Ⅱ混合均匀，加入30-50体积份的无水乙醇溶解，搅拌加入1500-2500体积份的氨水至pH至7-9，室温反应1小时后，向体系中加入600-1000体积份的水，过滤收集沉淀，并将沉淀干燥得到固体物Ⅲ；

D、取3000-5000重量份的4，7-二苯基-1，10-菲咯啉加热溶解于100-150体积份的乙醇，冷却后收集重结晶晶体；取2500-3500重量份的所述重结晶晶体与800-1200重量份的4，7-二苯基-1，10-菲咯啉加入200-400体积份的甲苯中，62℃下搅拌1-2小时，冷却至室温，除甲苯，得到铕配合物。

优选的，所述二甲基噻吩和β-二丁酮的合成方法，包括以下步骤：

A、将溴代苯胺溶解在DMF中，加入溴代十四烷和二异丙基乙胺，100℃反应10-14小时后，向反应液中加入二氯甲烷，重结晶得N，N-二取代的对溴苯胺；

B、将所述N，N-二取代的对溴苯胺、镁条和碘溶解于THF中配成溶液，保持回流条件下，将溶液滴加到THF中，加液完毕后回流反应1小时，冷却至0℃，向体系中加入过氧苯甲酸和THF，室温下反应2-3小时；向体系中加入盐酸以水解生成的盐后，向体系中加入二氯甲烷，干燥层析分离得到中间体；

C、将所述中间体溶解于甲苯溶液中，加入氯化锌和2-巯基乙醇，回流反应3-5小时，除甲苯层析得到二甲基噻吩和β-二丁酮。

进一步的，所述二甲基噻吩和β-二丁酮的合成方法，包括以下步骤：

A、将30000-40000重量份的溴代苯胺溶解在100-150体积份的DMF中，加入120000-200000重量份的溴代十四烷和50000-100000重量份的二异丙基乙胺，100℃反应12小时后，向反应液中加入200-400体积份的二氯甲烷，将体系用水洗涤三次后，加入乙醇重结晶，得N，N-二取代的对溴苯胺；

B、将所述N，N-二取代的对溴苯胺、2500-3500重量份的镁条和碘溶解于40-60体积份的THF中配成溶液，并将溶液滴加到80-120体积份的THF中保持回流，加液完毕后回流反应反应1小时，冷却至0℃，向体系中加入10000-15000重量份的过氧苯甲酸和40-60体积份的THF，室温下反应2-3小时；向体系中加入摩尔浓度为0.1mol/L盐酸以水解生成的盐后，向体系中加入150-250体积份的二氯甲烷，将体系中的有机相用水洗涤三次后，用无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到中间体；

C、将所述中间体溶解于80-120体积份的甲苯溶液中，加入氯化锌和7000-10000重量份的2-巯基乙醇，回流反应3-5小时，除甲苯，柱层析得到二甲基噻吩和β-二丁酮。

关于本发明中出现的英文缩写及其他物质的名称解释：

DMF：富马酸二甲酯，CAS号：68-12-2；

THF；四氢呋喃，CAS号：109-99-9；

DPP：4，7-二苯基-1，10-菲咯啉，CAS号：1662-01-7；

EDTA：乙二胺四乙酸，CAS号：60-00-4；

1，4-苯二酚，CAS号：123-31-9；

硼氢化钠，CAS号：16940-66-2；

2-溴-1，1-二乙氧基乙烷，化学式：C₆H₁₃BrO₂，CAS号：2032-35-1；

甲苯磺酸，CAS号：98-11-3；

1，6-己二胺，CAS号：124-09-4；

三氢硼氰化钠，又名氰基硼氢化钠，CAS号：25895-60-7；

2，5二甲基噻吩，CAS号：638-02-8；

邻苯基联苯，C₁₂H₁₀，CAS号：92-52-4；

乙酰氯，CAS号：75-36-5；

三氟乙酸乙酯；CAS号：383-63-1；

对氨基溴化苯，CAS号：106-40-1；

溴代十四烷，CAS号：112-71-0；

二异丙基乙胺，CAS号：7087-68-5；

本发明中，所用水为去离子水。

需要说明的是，本发明中的重量份和体积份，只是为了表明各物料的比例关系，并不具体表示某个数量值，在本发明中，所述重量份和体积份有如下对应关系：当1重量份为1g时，1体积份为1L。

本发明的有益效果为：

1、所述醛化葡聚糖是以卤代缩醛和葡聚糖为原料，经取代、水解反应而成，生成的醛基不易发生交联反应，活性基团醛基密度可控，重现性好，更有利于单抗、蛋白的连接。

2、所述包被方法以环氧乙基微粒为起始原料，代替传统的羧基微粒。可以用有机小分子代替氨基化糖，整个包被过程显得简单、周期短，更适宜用于工业化生产。

3、所述微球组合物的制备方法，将所述醛化葡聚糖包被在微球表面形成醛基葡聚糖微球用于生物分子的共价偶联，该方法工艺简单、操作简便、重复性好。

具体实施方式

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明提供了一种一种醛基葡聚糖的合成方法、基于所述醛基葡聚糖的包被方法和微球组合物的制备方法。

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

实施例1

一种醛基葡聚糖的合成方法，包括以下步骤：

A、将30g葡聚糖溶解于90ml的水后，氮气保护下，加入10mg EDTA、10mg1，4-苯二酚、10mg硼氢化钠、6g NaOH和60ml甲苯，搅拌回流2小时；

B、向体系中缓慢滴加2-溴-1，1-二乙氧基乙烷的甲苯溶液，滴加时间不少于1小时，2-溴-1，1-二乙氧基乙烷的甲苯溶液为50ml2-溴-1，1-二乙氧基乙烷溶解于200ml甲苯溶液中制成；滴加完成后，搅拌回流15小时；

C、冷却至室温后，将体系中的有机相用水洗涤三次，每次所用水的体积为150ml，合并水相得到水溶液，所述水溶液加入2000ml的甲醇中，抽滤后用乙醇洗涤三次，每次所用乙醇的体积为240ml，并将洗涤过的沉淀真空干燥，得到33g醛化糖前体沉淀；

D、将10g所述醛化糖前体沉淀溶于50ml水中，加入甲苯磺酸调pH至1-2，加热至80℃进行水解，水解2小时后，使用质量分数为40％的NaOH溶液调至中性，过滤、透析或离心清洗除去小分子杂质，冻干得醛基葡聚糖冻干粉9g。

实施例2

一种醛基葡聚糖的合成方法，包括以下步骤：

A、将20g葡聚糖溶解于130ml的水后，氮气保护下，加入5mg EDTA、15mg1，4-苯二酚、5mg硼氢化钠、8g NaOH和40ml甲苯，搅拌回流3小时；

B、向体系中缓慢滴加2-溴-1，1-二乙氧基乙烷的甲苯溶液，滴加时间不少于1小时，2-溴-1，1-二乙氧基乙烷的甲苯溶液为40ml2-溴-1，1-二乙氧基乙烷溶解于200ml甲苯溶液中制成；滴加完成后，搅拌回流12小时；

C、冷却至室温后，将体系中的有机相用水洗涤三次，每次所用水的体积为180ml，合并水相得到水溶液，所述水溶液加入1500ml的甲醇中，抽滤后用乙 醇洗涤三次，每次所用乙醇的体积为280ml，并将洗涤过的沉淀真空干燥，得到22g醛化糖前体沉淀；

D、将5g所述醛化糖前体沉淀溶于70ml水中，加入甲苯磺酸调pH至1-2，加热至70℃进行水解，水解3小时后，使用质量分数为30％的NaOH溶液调至中性，过滤、透析或离心清洗除去小分子杂质，冻干得醛基葡聚糖冻干粉4.5g。

实施例3

一种醛基葡聚糖的合成方法，包括以下步骤：

A、将40g葡聚糖溶解于50ml的水后，氮气保护下，加入15mg EDTA、5mg1，4-苯二酚、15mg硼氢化钠、4g NaOH和80ml甲苯，搅拌回流1小时；

B、向体系中缓慢滴加2-溴-1，1-二乙氧基乙烷的甲苯溶液，滴加时间不少于1小时，2-溴-1，1-二乙氧基乙烷的甲苯溶液为45ml2-溴-1，1-二乙氧基乙烷溶解于200ml甲苯溶液中制成；滴加完成后，搅拌回流18小时；

C、冷却至室温后，将体系中的有机相用水洗涤三次，每次所用水的体积为120ml，合并水相得到水溶液，所述水溶液加入2500ml的甲醇中，抽滤后用乙醇洗涤三次，每次所用乙醇的体积为200ml，并将洗涤过的沉淀真空干燥，得到44g醛化糖前体沉淀；

D、将15g所述醛化糖前体沉淀溶于30ml水中，加入甲苯磺酸调pH至1-2，加热至90℃进行水解，水解1小时后，使用质量分数为50％的NaOH溶液调至中性，过滤、透析或离心清洗除去小分子杂质，冻干得醛基葡聚糖冻干粉13.5g。

实施例4

一种基于实施例1所述醛基葡聚糖的包被方法，包括以下步骤：

A、70℃下，将1g环氧乙基微球(购自美国Bangs Laboratories，INC)加入20ml质量分数为10％的1，6-己二胺溶液中，90℃下搅拌反应12小时后，经透析或中空纤维管清洗除去未反应的小分子，得到氨化微球；

B、取2.5g实施例1中的所述醛基葡聚糖冻干粉溶解于50ml磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH＝6.0，加入所述氨化微球，混合均匀后缓慢滴加三氢硼氰化钠溶液，所述三氢硼氰化钠溶液为0.4g三氢硼氰化钠溶于2.5ml的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中得到，37℃下反应12小时；

C、离心清洗除去未反应的小分子并定容成50ml，得到0.9g包被有醛基葡聚糖的微球。

实施例5

一种基于实施例2所述醛基葡聚糖的包被方法，包括以下步骤：

A、70℃下，将15g环氧乙基微球(购自美国Bangs Laboratories，INC)加入10ml质量分数为10％的1，6-己二胺溶液中，90℃下搅拌反应16小时后，经透析或中空纤维管清洗除去未反应的小分子，得到氨化微球；

B、取2g实施例2中的所述醛基葡聚糖冻干粉溶解于60ml磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH＝6.0，加入所述氨化微球，混合均匀后缓慢滴加三氢硼氰化钠溶液，所述三氢硼氰化钠溶液为0.4g三氢硼氰化钠溶于2.5ml的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中得到，37℃下反应8小时；

C、离心清洗除去未反应的小分子并定容成50ml，得到1.35g包被有醛基葡聚糖的微球。

实施例6

一种基于实施例3所述醛基葡聚糖的包被方法，包括以下步骤：

A、70℃下，将0.5g环氧乙基微球(购自美国Bangs Laboratories，INC)加入30ml质量分数为10％的1，6-己二胺溶液中，90℃下搅拌反应8小时后，经透析或中空纤维管清洗除去未反应的小分子，得到氨化微球；

B、取3g实施例3中的所述醛基葡聚糖冻干粉溶解于40ml磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH＝6.0，加入所述氨化微球，混合均匀后缓慢滴加三氢硼氰化钠溶液，所述三氢硼氰化钠溶液为0.4g三氢硼氰化钠溶于2.5ml的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中得到，37℃下反应16小时；

C、离心清洗除去未反应的小分子并定容成50ml，得到0.45g包被有醛基葡聚糖的微球。

实施例7

一种微球组合物的制备方法，包括以下步骤：

A、受氧微球的制备：用专利号为US 5780646的实施方式中的方法将200mg二甲基噻吩、β-二丁酮和100mg稀土配合物放入微球(购自美国Bangs Laboratories，INC)中，形成受氧微球；所述稀土配合物为铕配合物；

B、供氧微球的制备：用专利号为US 5780646的实施方式中的方法，将200mg光敏剂放入微球中，形成供氧微球；所述光敏剂为根据美国专利US 5709994公开的可释放单线态氧的叶绿素A；

C、醛基葡聚糖包被微球：70℃下，将1g的受氧微球或供氧微球加入20ml的质量分数为10％的1，6-己二胺溶液中，90℃下搅拌反应12小时后，经透析或中空纤维管清洗除去未反应的小分子，得到氨化微球；将2.5g实施例1中的醛基葡聚糖溶解于50ml的磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH＝6.0，加入所述氨化微球，混合均匀后滴加三氢硼氰化钠溶液，所述三氢硼氰化钠溶液为0.4g的三氢硼氰化钠溶于2.5ml的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中得到，37℃下反应12小时；离心清洗除去未反应的小分子并定容成50ml，得到包被有醛基葡聚糖的受氧微球或供氧微球；

D、所述受氧微球和供氧微球组合为微球组合物。

实施例8

一种微球组合物的制备方法，包括以下步骤：

A、受氧微球的制备：用专利号为US 5780646的实施方式中的方法将200mg二甲基噻吩、β-二丁酮和100mg稀土配合物放入微球(购自美国Bangs Laboratories，INC)中，形成受氧微球；所述稀土配合物为铕配合物；

B、供氧微球的制备：用专利号为US 5780646的实施方式中的方法，将200mg光敏剂放入微球中，形成供氧微球；所述光敏剂为根据美国专利US 5709994公开的光氧染料物质亚甲基蓝；

C、醛基葡聚糖包被微球：70℃下，将0.5g的受氧微球或供氧微球加入30ml的质量分数为10％的1，6-己二胺溶液中，90℃下搅拌反应8小时后，经透析或中空纤维管清洗除去未反应的小分子，得到氨化微球；将3g实施例2中的醛基葡聚糖溶解于40ml的磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH＝6.0，加入所述氨化微球，混合均匀后滴加三氢硼氰化钠溶液，所述三氢硼氰化钠溶液为0.4g的三氢硼氰化钠溶于2.5ml的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中得到，37℃下反应16小时；离心清洗除去未反应的小分子并定 容成50ml，得到包被有醛基葡聚糖的受氧微球或供氧微球；

D、所述受氧微球和供氧微球组合为微球组合物。

实施例9

一种微球组合物的制备方法，包括以下步骤：

A、受氧微球的制备：用专利号为US 5780646的实施方式中的方法将200mg二甲基噻吩、β-二丁酮和100mg稀土配合物放入微球(购自美国Bangs Laboratories，INC)中，形成受氧微球；所述稀土配合物为铽配合物；

B、供氧微球的制备：用专利号为US 5780646的实施方式中的方法，将200mg光敏剂放入微球中，形成供氧微球；所述光敏剂为根据美国专利US 5709994公开的光氧染料物质玫瑰红；

C、醛基葡聚糖包被微球：70℃下，将1.5g的受氧微球或供氧微球加入10ml的质量分数为10％的1，6-己二胺溶液中，90℃下搅拌反应16小时后，经透析或中空纤维管清洗除去未反应的小分子，得到氨化微球；将2g实施例3中的醛基葡聚糖溶解于60ml的磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH＝6.0，加入所述氨化微球，混合均匀后滴加三氢硼氰化钠溶液，所述三氢硼氰化钠溶液为0.4g的三氢硼氰化钠溶于2.5ml的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中得到，37℃下反应8小时；离心清洗除去未反应的小分子并定容成50ml，得到包被有醛基葡聚糖的受氧微球或供氧微球；

D、所述受氧微球和供氧微球组合为微球组合物。

实施例10

一种微球组合物的制备方法，包括以下步骤：

A、铕配合物的合成方法：将4.8g的邻苯基联苯溶解于40ml的无水二氯甲烷中，加入5.88g的氯化铝，冷却至0℃；滴加4g的乙酰氯，滴加完毕后室温反应1.5小时，将体系中的有机相用水洗涤三次后，用无水硫酸钠干燥得到5.2g固体物Ⅰ；取3.2g所述固体物Ⅰ溶解于40ml的无水乙醚中，加入2g甲醇钠和4g三氟乙酸乙酯，室温反应2.5小时，将体系中的有机相用水洗涤三次后，用无水硫酸钠干燥得到1.6g固体物Ⅱ；将2.932g六水合三氯化铕与6.39g所述固体物Ⅱ混合均匀，加入40ml无水乙醇溶解，搅拌加入2ml氨水至pH至8，室温反应1小时后，向体系中加入800ml水，过滤收集沉淀，并将沉淀干燥得到9g固体物Ⅲ；取4.0g 4，7-二苯基-1，10-菲咯啉(DPP)加热溶解于120ml乙醇，冷却后收集重结晶晶体；取3.014g所述重结晶晶体与0.997g 4，7-二苯基-1，10-菲咯啉加入300ml甲苯中，62℃下搅拌1.5小时，冷却至室温，除甲苯，得到铕配合物。

B、二甲基噻吩和β-二丁酮的合成方法：将34.4g溴代苯胺溶解在125ml DMF中，加入0.6mol溴代十四烷和0.6mol二异丙基乙胺，100℃反应12小时后，向反应液中加入300ml的二氯甲烷，将体系用水洗涤三次后，加入乙醇重结晶，得N，N-二取代的对溴苯胺；将所述N，N-二取代的对溴苯胺、3g镁条和碘溶解于50ml THF中配成溶液，保持回流条件下，将溶液滴加到100ml THF中，加液完毕后回流反应1小时，冷却至0℃，向体系中加入0.1mol过氧苯甲酸和50ml THF，室温下反应2.5小时；向体系中缓慢加入摩尔浓度为0.1mol/L盐酸以水解生成的盐后，向体系中加入200ml二氯甲烷，将体系中的有机相用水洗涤三次后，用无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到中间体；将所述中间体溶解于100ml的甲苯溶液中，加入氯化锌和0.11mol 2-巯基乙醇，回流反应4小时，旋转蒸发仪除去甲苯，柱层析得到二甲基噻吩和β-二丁酮。

C、受氧微球的制备：用专利号为US 5780646的实施方式中的方法将200mg所述二甲基噻吩、β-二丁酮和100mg所述铕配合物放入微球(购自美国Bangs Laboratories，INC)中，形成受氧微球；

D、供氧微球的制备：用专利号为US 5780646的实施方式中的方法，将200mg光敏剂放入微球中，形成供氧微球；所述光敏剂为根据美国专利US 5709994公开的可释放单线态氧的叶绿素A；

E、醛基葡聚糖包被微球：70℃下，将1g的受氧微球或供氧微球加入20ml的质量分数为10％的1，6-己二胺溶液中，90℃下搅拌反应12小时后，经透析或中空纤维管清洗除去未反应的小分子，得到氨化微球；将2.5g实施例1中的醛基葡聚糖溶解于50ml的磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH＝6.0，加入所述氨化微球，混合均匀后滴加三氢硼氰化钠溶液，所述三氢硼氰化钠溶液为0.4g的三氢硼氰化钠溶于2.5ml的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中得到，37℃下反应12小时；离心清洗除去未反应的小分子并定容成50ml，得到包被有醛基葡聚糖的受氧微球或供氧微球；

F、所述受氧微球和供氧微球组合为微球组合物。

实施例11

一种微球组合物的制备方法，包括以下步骤：

C、铕配合物的合成方法：将4.5g的邻苯基联苯溶解于50ml的无水二氯甲烷中，加入5.50g的氯化铝，冷却至0℃；滴加4.5g的乙酰氯，滴加完毕后室温反应1小时，将体系中的有机相用水洗涤三次后，用无水硫酸钠干燥得到5.0g固体物Ⅰ；取3.5g所述固体物Ⅰ溶解于30ml的无水乙醚中，加入2.5g甲醇钠和3g三氟乙酸乙酯，室温反应3小时，将体系中的有机相用水洗涤三次后，用无水硫酸钠干燥得到2.0g固体物Ⅱ；将2.800g六水合三氯化铕与6.00g所述固体物Ⅱ混合均匀，加入50ml无水乙醇溶解，搅拌加入1.5ml氨水至pH至7，室温反应1小时后，向体系中加入1000ml水，过滤收集沉淀，并将沉淀干燥得到10g固体物Ⅲ；取3.0g 4，7-二苯基-1，10-菲咯啉(DPP)加热溶解于150ml乙醇，冷却后收集重结晶晶体；取2.500g所述重结晶晶体与1.200g 4，7-二苯基-1，10-菲咯啉加入200ml甲苯中，62℃下搅拌2小时，冷却至室温，除甲苯， 得到铕配合物。

D、二甲基噻吩和β-二丁酮的合成方法：将30.0g溴代苯胺溶解在150ml DMF中，加入0.45mol溴代十四烷和0.8mol二异丙基乙胺，100℃反应12小时后，向反应液中加入200ml的二氯甲烷，将体系用水洗涤三次后，加入乙醇重结晶，得N，N-二取代的对溴苯胺；将所述N，N-二取代的对溴苯胺、3.5g镁条和碘溶解于40ml THF中配成溶液，保持回流条件下，将溶液滴加到120ml THF中，加液完毕后回流反应1小时，冷却至0℃，向体系中加入0.8mol过氧苯甲酸和60ml THF，室温下反应2小时；向体系中缓慢加入摩尔浓度为0.1mol/L盐酸以水解生成的盐后，向体系中加入250ml二氯甲烷，将体系中的有机相用水洗涤三次后，用无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到中间体；将所述中间体溶解于80ml的甲苯溶液中，加入氯化锌和0.13mol 2-巯基乙醇，回流反应3小时，旋转蒸发仪除去甲苯，柱层析得到二甲基噻吩和β-二丁酮。

C、受氧微球的制备：用专利号为US 5780646的实施方式中的方法将200mg二甲基噻吩、β-二丁酮和100mg所述铕配合物放入微球(购自美国Bangs Laboratories，INC)中，形成受氧微球；

D、供氧微球的制备：用专利号为US 5780646的实施方式中的方法，将200mg光敏剂放入微球中，形成供氧微球；所述光敏剂为根据美国专利US 5709994公开的光氧染料物质亚甲基蓝；

E、醛基葡聚糖包被微球：70℃下，将0.5g的受氧微球或供氧微球加入30ml的质量分数为10％的1，6-己二胺溶液中，90℃下搅拌反应8小时后，经透析或中空纤维管清洗除去未反应的小分子，得到氨化微球；将3g实施例2中的醛基葡聚糖溶解于40ml的磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH＝6.0，加入所述氨化微球，混合均匀后滴加三氢硼氰化钠溶液，所述三氢硼氰化钠溶液为0.4g的三氢硼氰化钠溶于2.5ml的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中得到，37℃下反应16小时；离心清洗除去未反应的小分子并定容成50ml，得到包被有醛基葡聚糖的受氧微球或供氧微球；

F、所述受氧微球和供氧微球组合为微球组合物。

实施例12

一种微球组合物的制备方法，包括以下步骤：

E、铕配合物的合成方法：将5.0g的邻苯基联苯溶解于30ml的无水二氯甲烷中，加入6.00g的氯化铝，冷却至0℃；滴加3.5g的乙酰氯，滴加完毕后室温反应2小时，将体系中的有机相用水洗涤三次后，用无水硫酸钠干燥得到6.0g固体物Ⅰ；取3.0g所述固体物Ⅰ溶解于50ml的无水乙醚中，加入1.5g甲醇钠和5g三氟乙酸乙酯，室温反应2小时，将体系中的有机相用水洗涤三次后，用无水硫酸钠干燥得到1.0g固体物Ⅱ；将3.200g六水合三氯化铕与6.80g所述固体物Ⅱ混合均匀，加入30ml无水乙醇溶解，搅拌加入2.5ml氨水至pH至9，室温反应1小时后，向体系中加入600ml水，过滤收集沉淀，并将沉淀干燥得到11g固体物Ⅲ；取5.0g 4，7-二苯基-1，10-菲咯啉(DPP)加热溶解于100ml乙醇，冷却后收集重结晶晶体；取3.500g所述重结晶晶体与0.800g 4，7-二苯基-1，10-菲咯啉加入400ml甲苯中，62℃下搅拌1小时，冷却至室温，除甲苯，得到铕配合物。

F、二甲基噻吩和β-二丁酮的合成方法：将40.0g溴代苯胺溶解在100ml DMF中，加入0.8mol溴代十四烷和0.45mol二异丙基乙胺，100℃反应12小时后，向反应液中加入400ml的二氯甲烷，将体系用水洗涤三次后，加入乙醇重结晶，得N，N-二取代的对溴苯胺；将所述N，N-二取代的对溴苯胺、2.5g镁条和碘溶解于60ml THF中配成溶液，保持回流条件下，将溶液滴加到80ml THF中，加液完毕后回流反应1小时，冷却至0℃，向体系中加入0.12mol过氧苯甲酸和40ml THF，室温下反应3小时；向体系中缓慢加入摩尔浓度为0.1mol/L盐酸以水解生成的盐后，向体系中加入150ml二氯甲烷，将体系中的有机相用水洗涤三次后，用无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到中间体；将所述中间体溶解于120ml的甲苯溶液中，加入氯化锌和0.09mol 2-巯基乙醇，回流反应5小时， 旋转蒸发仪除去甲苯，柱层析得到二甲基噻吩和β-二丁酮。

C、受氧微球的制备：用专利号为US 5780646的实施方式中的方法将200mg二甲基噻吩、β-二丁酮和100mg所述铕配合物放入微球(购自美国Bangs Laboratories，INC)中，形成受氧微球；

D、供氧微球的制备：用专利号为US 5780646的实施方式中的方法，将200mg光敏剂放入微球中，形成供氧微球；所述光敏剂为根据美国专利US 5709994公开的光氧染料物质酞菁化合物；

E、醛基葡聚糖包被微球：70℃下，将1.5g的受氧微球或供氧微球加入10ml的质量分数为10％的1，6-己二胺溶液中，90℃下搅拌反应16小时后，经透析或中空纤维管清洗除去未反应的小分子，得到氨化微球；将2g实施例3中的醛基葡聚糖溶解于60ml的磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH＝6.0，加入所述氨化微球，混合均匀后滴加三氢硼氰化钠溶液，所述三氢硼氰化钠溶液为0.4g的三氢硼氰化钠溶于2.5ml的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中得到，37℃下反应8小时；离心清洗除去未反应的小分子并定容成50ml，得到包被有醛基葡聚糖的受氧微球或供氧微球；

F、所述受氧微球和供氧微球组合为微球组合物。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。