基于荧光共轭聚合物与上转换纳米材料的复合抗菌剂及其使用方法

摘要

本发明公开了一种，基于荧光共轭聚合物与上转换纳米材料的复合抗菌剂及其使用方法，该复合抗菌剂是聚丙烯酸改性的β‑NaYF4:Yb,Tm与水溶性阳离子共轭聚合物的质量比为1:0.005～0.5的混合物，其中聚丙烯酸改性的β‑NaYF4:Yb,Tm作为能量供体，水溶性阳离子共轭聚合物作为能量受体，两者具有明显的协同促进作用，当以980nm的近红外光作为激发光源，激发聚丙烯酸改性的β‑NaYF4:Yb,Tm，继而通过荧光共振能量转移过程将能量转移到水溶性阳离子共轭聚合物上并激发共轭聚合物，利用共轭聚合物产生的单线态氧或活性氧物质可达到显著的杀菌效果。本发明为治疗深层组织细菌感染提供了新平台，为细菌耐药性提供了治疗新方法。

说明书

技术领域

本发明属于光敏杀菌技术领域，具体涉及一种基于荧光共轭聚合物与上转换纳米材料的复合抗菌剂及其使用方法。

背景技术

近年来，细菌耐药性的出现严重危害着公众健康，为了解决这一问题，科研工作者一直在新型抗菌药物及抗菌新方法的研究方面做着积极的努力。由于光动力疗法(PDT)是一种有效治疗细菌感染的方法，受到了人们的广泛关注。共轭聚合物是一种良好的PDT光敏剂，具有高效的抗菌性能，但是目前设计合成出的共轭聚合物虽然抗菌效果较好，但大多采用白光激发，无法应对深层组织的细菌感染。研究发现，上转换纳米材料最突出的优点就是采用红外激发，组织穿透力强，荧光背景低，但其却不是理想的光敏剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于荧光共轭聚合物和上转换纳米材料的复合抗菌剂，以及采用该复合抗菌剂杀菌的方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：该复合抗菌剂是聚丙烯酸改性的β-NaYF₄:Yb,Tm与水溶性阳离子共轭聚合物的质量比为1:0.005～0.5的混合物，其中水溶性阳离子共轭聚合物(PFVCN)的结构式如下所示：

式中n为聚合度，其数均分子量为10000～100000。

本发明的复合抗菌剂优选聚丙烯酸改性的β-NaYF₄:Yb,Tm与水溶性阳离子共轭聚合物的质量比为1:0.01～0.05的混合物。

上述的聚丙烯酸的数均分子量为1000～5000。

采用本发明复合抗菌剂杀菌的方法为：将复合抗菌剂完全溶解于10mmol/L pH值为7.3的4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠(HEPES-Na)缓冲液中，室温振荡反应15～30分钟，然后加入待杀菌的细菌样品，控制复合抗菌剂的质量与细菌个数的比值为3×10^-8mg/个～4×10^-8mg/个，在37℃下孵育20～60分钟，再采用980nm的激光照射20～60分钟，辐照度为80～120mW/cm²。

上述的细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、青枯雷尔氏菌、枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、黑曲霉菌、白色葡萄球菌、普通变形杆菌、沙雷氏菌等中的任意一种。

本发明所采用的水溶性阳离子共轭聚合物单线态氧产量高，非常适合用做PDT的光敏剂，而上转换纳米材料β-NaYF₄:Yb,Tm的发射光谱与该水溶性阳离子共轭聚合物的吸收光谱有很好的重叠，且水溶性阳离子共轭聚合物和聚丙烯酸改性的β-NaYF₄:Yb,Tm可以通过静电相互作用结合在一起，因此，本发明将水溶性阳离子共轭聚合物与聚丙烯酸改性的β-NaYF₄:Yb,Tm复配制备成抗菌剂，其中聚丙烯酸改性的β-NaYF₄:Yb,Tm作为能量供体，水溶性阳离子共轭聚合物作为能量受体，两者具有明显的协同促进作用，当以980nm的近红外光作为激发光源，激发聚丙烯酸改性的β-NaYF₄:Yb,Tm，继而通过荧光共振能量转移(FRET)过程将能量转移到水溶性阳离子共轭聚合物上并激发共轭聚合物，利用共轭聚合物产生的单线态氧或活性氧物质可达到显著的杀菌效果。本发明为治疗深层组织细菌感染提供了新平台，为细菌耐药性提供了治疗新方法。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

下面实施例中的水溶性阳离子共轭聚合物(PFVCN)参考文献Water-Soluble Conjugated Polymers for Simultaneous Two-Photon Cell Imaging andTwo-Photon Photodynamic Therapy(Advanced Optical Materials,2013,1,92-99)中的方法合成，其数均分子量为27009，分散度为1.87。上转换纳米材料NaYF₄:Yb,Tm根据文献Multicolor>4:Yb,Tm根据文献Surface>

实施例1

按照聚丙烯酸改性的β-NaYF4:Yb,Tm与PFVCN的质量比为1:0.005，将10mg聚丙烯酸改性的β-NaYF4:Yb,Tm、0.05mg PFVCN混合均匀，得到复合抗菌剂。

实施例2

按照聚丙烯酸改性的β-NaYF4:Yb,Tm与PFVCN的质量比为1:0.01，将10mg聚丙烯酸改性的β-NaYF4:Yb,Tm、0.1mg PFVCN混合均匀，得到复合抗菌剂。

实施例3

按照聚丙烯酸改性的β-NaYF4:Yb,Tm与PFVCN的质量比为1:0.02，将10mg聚丙烯酸改性的β-NaYF4:Yb,Tm、0.2mg PFVCN混合均匀，得到复合抗菌剂。

实施例4

按照聚丙烯酸改性的β-NaYF4:Yb,Tm与PFVCN的质量比为1:0.05，将10mg聚丙烯酸改性的β-NaYF4:Yb,Tm、0.5mg PFVCN混合均匀，得到复合抗菌剂。

实施例5

按照聚丙烯酸改性的β-NaYF4:Yb,Tm与PFVCN的质量比为1:0.5，将10mg聚丙烯酸改性的β-NaYF4:Yb,Tm、5mg PFVCN混合均匀，得到复合抗菌剂。

实施例6

采用实施例1～4的复合抗菌剂进行大肠杆菌的杀菌，具体试验情况如下：

挑取已活化好的大肠杆菌菌落于LB液体培养基中，在37℃下摇床振荡培养过夜，得到细菌悬浮液；取5mL细菌悬浮液于已灭菌的离心管中，离心分离，并用质量分数为0.9％的NaCl水溶液离心洗涤，然后向沉淀中加入质量分数为0.9％的NaCl水溶液，振荡均匀，得到细菌悬浮液母液；将细菌悬浮液母液用10mmol/L pH值为7.3的HEPES-Na缓冲液稀释1000倍，在流式细胞仪上计数。

将0.2mg复合抗菌剂在10mmol/L pH值为7.3的HEPES-Na缓冲液中室温振荡反应30分钟，然后加入稀释后的细菌悬浮液母液，混合均匀，使混合体系中复合抗菌剂的质量与细菌个数的比值为3×10^-8mg/个，在37℃下孵育30分钟，再用980nm激光照射样品(光杀组)，辐照度为100mW/cm²，用HEPES-Na缓冲液稀释菌液10⁴倍，取稀释后的菌液100μL涂布于固体LB培养板上，37℃恒温18小 时，计算培养板上形成的细菌菌落数，按下述公式计算杀菌率：

％CFU杀菌率＝1-(实验组的细菌菌落数/对照组的细菌菌落数)×100％

同时，单独以0.2mg聚丙烯酸改性的β-NaYF4:Yb,Tm(对比例1)、0.01mg PFVCN(对比例2)做对比试验。暗杀组按照同样的步骤操作，不同之处在于不用980nm激光照射。试验结果见表1。

表1不同抗菌剂的杀菌结果

光杀组暗杀组对比例17.0％7.0％对比例227.0％27.0％实施例160.1％13.0％实施例280.3％22.3％实施例389.3％26.3％实施例487.0％29.0％

根据表1的实验结果可见，单独采用0.2mg聚丙烯酸改性的NaYF₄:Yb,Tm为抗菌剂，无论是暗杀还是光杀，其杀菌率均仅为7％；单独采用0.01mg>4:Yb,Tm和PFVCN按质量比为1:0.005～0.05复配成复合抗菌剂，当复合抗菌剂的用量为0.2mg时，在暗杀条件下，其杀菌效果与单独采用PFVCN的杀菌效果基本相同，而在光杀条件下，其杀菌率可达到60％，最高可达到近90％，说明聚丙烯酸改性的NaYF₄:Yb,Tm和PFVCN在980nm激光照射下具有明显的协同促进作用，极少量的PFVCN和聚丙烯酸改性的NaYF₄:Yb,Tm复配即可明显提高杀菌率。