壳层可控的丝素蛋白微囊及制备方法

摘要

本发明公开了一种壳层可控的丝素蛋白微囊及制备方法，制备方法为：(1)将丝素蛋白、模板微粒和碳酸盐缓冲液混合得混合液一，滴加蛋白的不良溶剂，混合，离心，除上清液，水洗，得第一种微粒；(2)将第一种微粒、丝素蛋白和碳酸盐缓冲液混合，得混合液二，离心，除上清液，水洗，得第二种微粒；(3)重复步骤(2)；(4)向步骤(3)获得的微粒中加戊二醛水溶液进行蛋白交联，离心，水洗，得到最终微粒；去除模板微粒，再水洗得到壳层可控的丝素蛋白微囊悬液。本发明的微囊是一种中空微囊，可负载生物大分子类药物或其他功效组份。易于操作，省时节能，适合于规模化生产，所用材料具有良好的生物相容性、生物可降解性且无免疫原性。

说明书

技术领域

本发明属于医药及美容护肤领域，具体地涉及一种壳层可控的丝素蛋白微囊及制备方法

背景技术

中空结构的载体在药物传递、生物反应器、生物传感器等领域具有广泛的应用。其中，微囊类载体受到了越来越多的关注。利用层层自组装(Layer-by-layer,LbL)技术，将带正负电荷的聚电解质交替沉积于模板表面再将模板去除，从而得到聚电解质微囊，是制备该类载体最常用的方法。这种方法简便易行、适用范围广，可精确控制微囊的大小、形状、组分等，并可通过改变沉积层数，控制微囊的厚度，进而调节微囊的通透性及其他功能特性。然而，LbL法合成微囊基载体存在固有缺陷，如荷正电的聚电解质的引入存在潜在生物毒性。为克服以上不足，研究者利用多种相互作用机制制备单组分微囊，如2008年，H.J.组用戊二醛处理吸附于模板表面的牛血清白蛋白，交联的同时在最外层覆盖活性醛基，与下层BSA共价结合，从而用戊二醛介导的LbL法制备了牛血清白蛋白单组份微囊(Tong W.；Gao C.；H.,Colloid Polym.Sci.2008,286,1103-1109.)；2011年，Tsukruk组利用丝素蛋白可通过氢键及β折叠物理交联的特性，不引入荷正电聚电解质，用LbL法制备了丝素蛋白单组份微囊，避免潜在的生物毒性，同时保存了LbL法通过改变壳层层数调控通透性的能力(Shchepelina,O.；Drachuk,I.；Gupta,M.K.；Lin,J.；Tsukruk,V.V.,Adv.Mater.2011,23,4655-4660.)；2014年Germershaus组用LbL法制备负载质粒的丝素蛋白微囊，实现基因的有效低毒转染(Li L.；Puhl S.；Meinel L.；Germershaus O.,Biomaterials,2014,35,7929-7939.)。然而，LbL法仍存在操作繁琐、耗时耗能，并且产量随沉积层数增加大大降低的不足，亟待开发LbL衍生法或其他方法，从而提高其实际工业应用价值(Tong W,；Song X,；Gao C.；Chem.Soc.Rev.,2012,41,6103.Zhu,Y.；Tong,W.；Gao,C.；H.J.Mater.Chem.2008,18,1153-1158)。因此，一步法合成微囊受到越来越多的关注，该方法操作简便快捷且省时省力，并可通过调节分子量以及去溶剂的量调节微囊的厚度，进而调节其通透性(Zhu Y.；Tong W,Gao C.；H.J.,Mater.Chem.2008,18,1153-1158.Wang Y.；Bansal V.；Zelikin AN.；Caruso F.,Nano Lett.2008,8,1741-1745.)；本课题组用去溶剂法制备丝素蛋白单组份微囊，一步去溶剂产生微囊厚度约为22.42±8.45nm，相当于LbL法制备的8-10层丝素蛋白沉积得到微囊的厚度，尽管这种单组份微囊孔洞较大，但本课题组修饰纳米金调节其通透性(ZL201410066374.3；Du,B.；Wang,J.；Zhou,Z.；Tang,H.；Li,X.；Liu,Y.；Zhang,Q.Chem.Commun.,2014,50,4423-4426.)。然而，将材料无毒可降解、方法温和简便、微囊通透性精确可控集于一体的单组份微囊及其制备方法还未见报道。

丝素蛋白具有卓越的机械稳定性、良好的生物相容性、生物可降解性，是生物活性组份 载体的理想材料。因此，以有机、无机微粒为模板，利用去溶剂法结合LbL法(层层去溶剂法)高效合成通透性可控的丝素蛋白单组份微囊作为功效组份载体在医药及美容护肤领域研究还未见报道。

发明内容

本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种工艺简捷、省时节能、通透性可调节的壳层可控的丝素蛋白微囊的制备方法。

本发明的第二个目的是提供一种壳层可控的丝素蛋白微囊。

本发明的第三个目的是提供一种壳层可控的丝素蛋白微囊的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种壳层可控的丝素蛋白微囊的制备方法，包括如下步骤：

(1)将丝素蛋白、模板微粒和pH＝9-11的碳酸盐缓冲液混合得混合液一，使混合液一中丝素蛋白的浓度为0.4-1.5mg/mL、模板微粒的浓度为6-15mg/mL；向混合液一中滴加蛋白的不良溶剂，混合均匀，所述混合液一与蛋白的不良溶剂的体积比为1:6-10；离心，除去上清液，水洗，离心，得到第一种微粒；

(2)将第一种微粒、与步骤(1)等量的丝素蛋白，和pH＝9-11的碳酸盐缓冲液混合，得混合液二，使混合液二的体积与混合液一的体积相等，向混合液二中滴加蛋白的不良溶剂混合，所述混合液二与蛋白的不良溶剂的体积比为1:6-10；离心，除去上清液，水洗，得到第二种微粒；

(3)重复步骤(2)0、1、2、3、4或5次；

(4)向步骤(3)获得的微粒中加入戊二醛水溶液进行蛋白交联，离心，水洗，得到最终微粒；洗最终微粒，去除模板微粒，再水洗得到壳层可控的丝素蛋白微囊悬液。

蛋白的不良溶剂优选甲醇或乙醇。

模板微粒优选碳酸钙微粒、分子量为5000-50000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒或分子量为5000-50000的聚乳酸微粒。

上述方法制备的壳层可控的丝素蛋白微囊。

壳层可控的丝素蛋白微囊在制备载功效组份微囊中的应用。

所述功效组份优选蛋白或多糖。

本发明的壳层可控的丝素蛋白微囊是一种中空微囊，可负载生物大分子类药物或其他功效组份。制备工艺普适性强，易于操作，省时节能，适合于规模化生产，而且所用材料具有良好的生物相容性、生物可降解性且无免疫原性。

本发明制备的七层丝素蛋白微囊通透性相当于文献LbL法制备的12层丝素蛋白微囊的通透性，五层丝素蛋白微囊的通透性介于LbL法制备的8-10层丝素蛋白微囊通透性之间，简化了制备流程。与本研究组此前授权的专利比较，单层去溶剂微囊孔径大于31.8nm，修饰金纳米粒子封堵单层微囊后孔径小于8nm。本发明中，层层去溶剂沉积调控更精确细致，如五层丝素蛋白微囊的孔径在22.9nm左右，七层丝素蛋白微囊的孔径小于8nm，与单层加金纳米粒子修饰封堵后的效果相当，但无需引入金纳米粒子，降低成本的基础上，减少了不可降 解材料的应用。本发明更适合在功效组份载体、靶向递送及护肤美容领域中应用。

附图说明

图1为实施例5制备的壳层可控的丝素蛋白微囊(三层)的透射电镜照片；丝素蛋白的浓度分别为(a)0.4mg/mL；(b)0.7mg/mL；(c)1mg/mL；(d)1.3mg/mL。

图2为实施例6制备的壳层可控的丝素蛋白微囊的扫描电镜照片；(a)单层微囊(对比)；(b)三层微囊；(c)五层微囊；(d)七层微囊。

图3为实施例7采用碳酸钙微粒为模板制备的丝素蛋白微囊的扫描电镜照片；(a)碳酸钙模板；(b)三层微囊。

图4为实施例6制备的三层丝素蛋白微囊在FITC-dextran 2000KDa溶液中的共聚焦显微镜照片。

图5为实施例6制备的五层丝素蛋白微囊在FITC-dextran 500KDa(a)以及FITC-dextran 2000KDa(b)溶液中的共聚焦显微镜照片。

图6为实施例6制备的七层丝素蛋白微囊在FITC-dextran 250KDa(a)以及FITC-BSA(b)溶液中的共聚焦显微镜照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。

实施例1丝素蛋白水溶液的制备：

取1g丝素粉，置于5mL LiBr(9.3M)溶液中，60℃缓慢磁力搅拌4h，制成20％的溶液，将所得溶液转入透析袋(MWCO 3500)，蒸馏水透析4d(每4h换水一次)，所得溶液8,000rpm离心20min，重复3次，除去不溶物，再将所得溶液过0.45μm滤膜。最终得到的丝素蛋白水溶液浓度约为6％。浓度测定是通过测定一定体积丝素蛋白水溶液冻干后重量计算所得。储存液存放于4℃备用。

实施例2PLGA微粒的制备：

采用经典的乳液-溶剂挥发法制备PLGA微粒：

将150mg的PLGA(50:50，重均分子量5万)溶解于10mL二氯甲烷中，逐滴滴入至100mL浓度为1％的聚乙烯醇中，高速匀质形成乳液，转移至搅拌器上继续搅拌18h，使二氯甲烷挥发完全，10,000rpm离心15min，加水超声重分散，重复此过程三次，冻干，低温储存。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒(50:50，重均分子量1.5万)，参照上述方法制备。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒(50:50，重均分子量5000)，参照上述方法制备。

实施例3碳酸钙微粒的制备：

将0.33M氯化钙水溶液在搅拌的状态下，加入到等浓度等体积的碳酸钠水溶液中，混合30S，800rpm离心3min，加水超声重分散，重复此过程三次，冻干，干燥处储存。

实施例4聚乳酸微粒的制备：

采用经典的乳液-溶剂挥发法制备聚乳酸微粒：

将150mg的PLA(分子量5万)溶解于10mL二氯甲烷中，逐滴滴入至100mL 1％的聚乙烯醇水溶液中，高速匀质形成乳液，转移至磁力搅拌器上继续搅拌18h，使二氯甲烷挥发完全，10,000rpm离心15min，加水超声重分散，重复此过程三次，冻干，低温储存。

聚乳酸微粒(分子量5000)，参照实施例4制备。

实施例2-4制备的微粒的方法是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制，用其它方法制备的与上述微粒相同的微粒，都可以用于本发明。

实施例5

一种壳层可控的丝素蛋白微囊的制备方法，包括的步骤：

(1)将丝素蛋白、分子量50000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒(模板微粒)和pH＝9的碳酸盐缓冲液混合得混合液一，使混合液一中丝素蛋白的浓度为0.4mg/mL、模板微粒的浓度为7mg/mL；向混合液一中滴加乙醇混合均匀，所述混合液一与乙醇的体积比为1:7；离心，除去上清液，水洗，离心，得到第一种微粒(一层)；

(2)将第一种微粒、与步骤(1)等量的丝素蛋白，和pH＝9的碳酸盐缓冲液混合，得混合液二，使混合液二的体积与混合液一的体积相等，向混合液二中滴加乙醇混合，所述混合液二与乙醇的体积比为1:7；离心，除去上清液，水洗，得到第二种微粒(两层)；

(3)重复步骤(2)1次(三层)；

(4)向步骤(3)获得的微粒中加入质量浓度2％戊二醛水溶液进行蛋白交联，离心，水洗，得到最终微粒；用体积比为1:1的丙酮和N-甲基吡咯烷酮混合液洗最终微粒，去除模板微粒，再水洗得到壳层可控的丝素蛋白微囊悬液。

质量浓度2％戊二醛水溶液与步骤(1)中的混合液一的体积比为1：1。

本实施例步骤(1)中加入的丝素蛋白的量不同，即：使混合液一中丝素蛋白的浓度为0.7mg/mL、1mg/mL、1.3mg/mL替代0.4mg/mL，其它同本实施例，分别制备壳层可控的丝素蛋白微囊悬液。

将上述壳层可控的丝素蛋白微囊悬液滴在铜网上自然干燥，透射电镜下拍照，见图1。

本实施例利用丝素蛋白与PLGA的疏水相互作用(Wang,X.；Wenk,E.；Hu,X.；Castro,G.R.；Meinel,L.；Wang,X.；Li,C.；Merkle,H.；Kaplan,D.L.,Biomaterials 2007,28(28),4161-4169)将析出的丝素蛋白沉积于PLGA微球表面，再将其交联固化，使之不再解聚，溶解模板最终形成丝素蛋白微囊，因此其他尺度的PLGA微球例如：在分子量为5000-50000的任意微粒同样可以作为模板制备不同尺寸的丝素蛋白微囊。

实施例6

一种壳层可控的丝素蛋白微囊的制备方法，包括如下步骤：

(1)将丝素蛋白、分子量50000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒(模板微粒)和pH＝9的碳酸盐缓冲液混合得混合液一，使混合液一中丝素蛋白的浓度为1mg/mL、模板微粒的浓度为7mg/mL；向混合液一中滴加乙醇混合均匀，所述混合液一与乙醇的体积比为1:7；离心，除去上清液，水洗，离心，得到第一种微粒(一层)；

(2)将第一种微粒、与步骤(1)等量的丝素蛋白，和pH＝9的碳酸盐缓冲液混合，得 混合液二，使混合液二的体积与混合液一的体积相等，向混合液二中滴加乙醇混合，所述混合液二与乙醇的体积比为1:7；离心，除去上清液，水洗，得到第二种微粒(两层)；

(3)重复步骤(2)1次(三层)；

(4)向步骤(3)获得的微粒中加入质量浓度2％戊二醛水溶液进行蛋白交联，离心，水洗，得到最终微粒；用体积比为1:1的丙酮和N-甲基吡咯烷酮混合液洗最终微粒，去除模板微粒，再水洗得到壳层可控的丝素蛋白微囊悬液。

质量浓度2％戊二醛水溶液与步骤(1)中的混合液一的体积比为1：1。

本实施例步骤(3)中重复的次数用3、5次替代本实施例的1次，其它同本实施例，制备壳层可控的丝素蛋白微囊悬液。

将上述丝素蛋白微囊悬液滴在硅片上自然干燥，扫描电镜下拍照，见图2。

实施例7

一种壳层可控的丝素蛋白微囊的制备方法，包括的步骤：

(1)将丝素蛋白、碳酸钙微粒(模板微粒)和pH＝9的碳酸盐缓冲液混合得混合液一，使混合液一中丝素蛋白的浓度为1mg/mL、模板微粒的浓度为6mg/mL；向混合液一中滴加乙醇混合均匀，所述混合液一与乙醇体积比为1:6；离心，除去上清液，水洗，离心，得到第一种微粒(一层)；

(2)将第一种微粒、与步骤(1)等量的丝素蛋白，和pH＝9的碳酸盐缓冲液混合，得混合液二，使混合液二的体积与混合液一的体积相等，向混合液二中滴加乙醇混合，所述混合液二与蛋白的不良溶剂的体积比为1:6；离心，除去上清液，水洗，得到第二种微粒(两层)；

(3)重复步骤地(2)1次(三层)；

(4)向步骤(3)获得的微粒中加入质量浓度2％戊二醛水溶液进行蛋白交联，离心，水洗，得到最终微粒；用EDTA水溶液(0.2M，pH＝7.5)洗最终微粒，去除模板微粒，再水洗得到壳层可控的丝素蛋白微囊悬液。质量浓度2％戊二醛水溶液与步骤(1)中的混合液一的体积比为1：1。

将上述丝素蛋白微囊悬液滴在硅片上自然干燥，扫描电镜下拍照，见图3。

实验证明，蛋白的不良溶剂选用甲醇也可以用于本发明。

实施例8

三层丝素蛋白微囊的孔径间接分析

1)将实施例6制备的三层丝素蛋白微囊放入容器中，加入分子量为2000kDa质量浓度为2mg/mL的FITC标记的葡聚糖(FITC-dextran 2000KDa)水溶液，混合得混合液，30min后置于共聚焦显微镜下拍照(图4)。

三层丝素蛋白微囊与FITC-dextran 2000KDa的混合液中，微囊内部有与外部溶液相同强度的荧光信号，可知分子量为2000kDa的葡聚糖可以通过微囊壁的孔洞，进入微囊内部，根据文献报道(Shchepelina,O.；Drachuk,I.；Gupta,M.K.；Lin,J.；Tsukruk,V.V.,Adv.Mater.2011,23,4655-4660.)三层丝素蛋白微囊孔径大于31.8nm。

实施例9

五层丝素蛋白微囊的孔径间接分析

1)将实施例6制备的五层丝素蛋白微囊放入容器中，加入分子量为500kDa质量浓度为2mg/mL的FITC标记的葡聚糖(FITC-dextran 500KDa)水溶液，混合得混合液，30min后置于共聚焦显微镜下拍照(图5a)。

2)将实施例6制备的五层丝素蛋白微囊放入容器中，加入分子量为2000kDa质量浓度为2mg/mL的FITC标记的葡聚糖(FITC-dextran 2000KDa)水溶液，混合得混合液，30min后置于共聚焦显微镜下拍照(图5b)。

五层丝素蛋白微囊与FITC-dextran 2000KDa的混合液中，微囊内部荧光强度低于外部溶液的荧光强度，可知分子量为2000kDa的葡聚糖无法通过微囊壁的孔洞，进入微囊内部；五层丝素蛋白微囊与FITC-dextran 500KDa的混合液中，部分微囊内部有与外部溶液相同强度的荧光信号，而部分微囊内部荧光强度低于外部溶液的荧光强度，可知分子量为500kDa的葡聚糖糖的水合直径处于五层丝素蛋白微囊孔径附近。根据文献报道(Shchepelina,O.；Drachuk,I.；Gupta,M.K.；Lin,J.；Tsukruk,V.V.,Adv.Mater.2011,23,4655-4660.)壳层可控的五层丝素蛋白微囊孔径在22.9nm左右。

实施例10

七层丝素蛋白微囊的孔径间接分析

1)将实施例6制备的七层丝素蛋白微囊放入容器中，加入分子量为250kDa质量浓度为2mg/mL的FITC标记的葡聚糖(FITC-dextran250KDa)水溶液，混合得混合液，30min后置于共聚焦显微镜下拍照(图6a)。

2)将七层丝素蛋白微囊与质量浓度为2mg/mL的FITC标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)混合得混合液，30min后置于共聚焦显微镜下拍照(图6b)。

七层丝素蛋白微囊与FITC-dextran 250KDa的混合液中，微囊内部荧光强度低于外部溶液的荧光强度，可知分子量为250kDa的葡聚糖无法通过微囊壁的孔洞，进入微囊内部；七层丝素蛋白微囊与FITC-BSA的混合液中，微囊内部荧光强度低于外部溶液的荧光强度，可知BSA无法通过微囊壁的孔洞，进入微囊内部。根据文献报道(Shchepelina,O.；Drachuk,I.；Gupta,M.K.；Lin,J.；Tsukruk,V.V.,Adv.Mater.2011,23,4655-4660.)七层丝素蛋白微囊孔径小于8nm。

实施例8-10表明本发明的方法可以有效调节孔径大小，从而使其对不同分子量的分子具有不同的通透性。此外，由于本领域公知，模型药物葡聚糖是多糖的代表，模型药物BSA是蛋白的代表，本发明的壳层可控的丝素蛋白微囊可以作为多糖类药物及蛋白类药物的载体。

实施例11

一种壳层可控的丝素蛋白微囊的制备方法，包括的步骤：

(1)将丝素蛋白、分子量50000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒(模板微粒)和pH＝9的碳酸盐缓冲液混合得混合液一，使混合液一中丝素蛋白的浓度为1.5mg/mL、模板微粒的浓度为15mg/mL；向混合液一中滴加乙醇混合均匀，所述混合液一与乙醇的体积比为1:7；离心，除去上清液，水洗，离心，得到第一种微粒(一层)；

(2)将第一种微粒、与步骤(1)等量的丝素蛋白，和pH＝9的碳酸盐缓冲液混合，得混合液二，使混合液二的体积与混合液一的体积相等，向混合液二中滴加乙醇混合，所述混合液二与乙醇的体积比为1:7；离心，除去上清液，水洗，得到第二种微粒(两层)；

(3)向步骤(2)获得的微粒中加入质量浓度2％戊二醛水溶液进行蛋白交联，离心，水洗，得到最终微粒；用体积比为1:1的丙酮和N-甲基吡咯烷酮混合液洗最终微粒，去除模板微粒，再水洗得到壳层可控的丝素蛋白微囊悬液。

质量浓度2％戊二醛水溶液与步骤(1)中的混合液一的体积比为1：1。

本实施例得到的微囊与实施例6获得的微囊形态相似，效果相当。

实施例12

一种壳层可控的丝素蛋白微囊的制备方法，包括的步骤：

(1)将丝素蛋白、分子量50000的聚乳酸微粒(模板微粒)和pH＝11的碳酸盐缓冲液混合得混合液一，使混合液一中丝素蛋白的浓度为1mg/mL、模板微粒的浓度为7mg/mL；向混合液一中滴加乙醇混合均匀，所述混合液一与乙醇的体积比为1:10；离心，除去上清液，水洗，离心，得到第一种微粒(一层)；

(2)将第一种微粒、与步骤(1)等量的丝素蛋白，和pH＝11的碳酸盐缓冲液混合，得混合液二，使混合液二的体积与混合液一的体积相等，向混合液二中滴加乙醇混合，所述混合液二与蛋白的不良溶剂的体积比为1:10；离心，除去上清液，水洗，得到第二种微粒(两层)；

(3)重复步骤(2)1次(三层)；

(4)向步骤(3)获得的微粒中加入质量浓度2％戊二醛水溶液进行蛋白交联，离心，水洗，得到最终微粒；用体积比为1:1的丙酮和N-甲基吡咯烷酮混合液洗最终微粒，去除模板微粒，再水洗得到壳层可控的丝素蛋白微囊悬液。

质量浓度2％戊二醛水溶液与步骤(1)中的混合液一的体积比为1：1。

用分子量5000的聚乳酸微粒替代本实施例的分子量50000的聚乳酸微粒，其它同本实施例，制备出壳层可控的丝素蛋白微囊悬液。

本实施例得到的微囊与实施例6获得的微囊形态相似，效果相当。