一种具有明确谱效关系的红花提取物的用途

摘要

本发明涉及一种具有明确谱效关系的红花提取物的用途，通过蒸馏水回流提取，大孔树脂分离纯化从红花中获得降糖提取物，并初步阐明其医学用途；提取物高效液相指纹图谱中含羟基红花黄色素A和6‑羟基山奈酚‑3,6‑双‑O‑葡萄糖‑7‑O‑葡萄糖苷的峰面积之和不低于50%；并且经计算羟基红花黄色素A与6‑羟基山奈酚‑3,6‑双‑O‑葡萄糖‑7‑O‑葡萄糖苷的峰面积比应为5.0‑8.0。经活性筛选试验证明：本发明所述的方法获得的提取物具有明显的蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP‑1B）抑制作用，在高脂饲料+链脲菌素（STZ）诱发的糖尿病SD大鼠上表现出良好降糖效果，可作为原料或辅助剂用于防治糖尿病的药物或保健品。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有明确谱效关系的红花提取物的用途。

背景技术

红花为菊科植物红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花，具有活血通经，散瘀止痛的功效。用于经闭，痛经，恶露不行，癥瘕痞块，胸痹心痛，瘀滞腹痛，胸胁剌痛，跌扑损伤，褡疡肿痛。自张骞从西域把红花引入我国已有2100多年的栽培和用药历史。红花主产于新疆，维药名为扎朗子古力，是活血化瘀的传统药材之一。通过多年来对红花的研究，已经确定其具有60多种化学成分，主要化学成分有木脂素类、黄酮类、多炔类。黄酮类主要有红花黄色素、羟基红花黄色素。红花中的脂肪酸有月桂酸、棕榈酸、油酸、肉豆蔻酸、亚油酸等不饱和脂肪酸。红花多糖的主要成分有木糖、葡萄糖和阿拉伯糖。

Ⅱ型糖尿病已成为全球非流行性内分泌疾病，发病率逐年上升，糖尿病患者生活质量降低，高血糖及多种并发症增加死亡风险，由于其发病机制复杂，给患者增加巨大的经济负担，超过80％的糖尿病死亡发生在中低等收入国家。该病是由人体自身分泌的胰岛素不足而引起的。而胰岛素的作用是调节人体内糖的代谢，即促进血糖合成糖元，加速血糖分解，降低血糖浓度。在Ⅱ型糖尿病大鼠中，剔除蛋白酪氨酸磷酸酶后，不仅胰岛素敏感性增高，而且糖尿病症状也有所改善。敲除健康小鼠的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)基因，也表现出胰岛素敏感性的提高，且在高脂饮食的诱导下小鼠不发展为Ⅱ型糖尿病和肥胖症。因此，PTP1B是引起胰岛素抵抗的重要原因，PTP1B是治疗糖尿病和肥胖症的重要靶点，通过抑制胰岛素敏感组织中的PTP1B的活性，对糖尿病和肥胖症的治疗都将会有显著改善，寻找PTP1B特异性的抑制剂有着广阔的应用前景，PTP1B是治疗Ⅱ型糖尿病、肥胖等疾病的重要靶点之一。本发明直接针对蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)靶点进行筛选。

目前，市场上已经逐渐出现了红花作为辅助药物治疗糖尿病及其并发症的药品。红花制剂在糖尿病及其并发症中表现出的作用有：①抗氧化应激作用：能降低脂质过氧化反应的发生，对抗自由基生成，保护机体各组织器官；②对血管内皮细胞的保护作用：阻止内皮细胞过度增生，保护全身大小血管；③抗凝、抗血栓作用：可改善患者血液流变，降低血脂水平，改善微循环；④抗炎作用：可拮抗多种炎症因子，抑制炎症反应；⑤对基因表达的调控作用：通过对动物模型肾皮质和脉络膜血管内皮细胞相关基因的改善而达到治疗效果。

本发明涉及的红花提取部位对PTP1B酶抑制的半数抑制浓度(IC50)均小于20μg/mL，具有明显的PTP1B酶抑制活性。本发明研究了红花水提取部位的指纹图谱，并采用灰色关联度法研究红花水提取物指纹图谱与其降糖活性的关系，以关联度的大小来衡量指纹特征峰对药效贡献的大小，最终确定最能反映其药效的特征峰，本发明为新疆红花的质量控制提供了更为全面和准确的谱效基础，为科学评价红花降糖作用提供了理论基础。将中药的指纹图谱和其生物活性相互结合，通过合适的分析方法明确中药的生物活性物质基础，并可将之列为药材提取物质量控制中的重点监控对象。

近年来，在天然药物研究领域，不但强调提高成分的含量，更加重视活性，以及对活性相关特征的发现和控制，因此采用指纹图谱技术与活性研究相结合的模式逐渐取代盲目追求提高成分含量的研究方法。

中药指纹图谱能够较好反映中药的“多组份、多靶点、多途径综合调节作用”的特点，然而，目前大多数中药的活性成分及其物质基础是不明确的，建立在中药化学指标成分之上的中药指纹图谱并不能有效地表现其与药效的相关性，因此只有将标示有中药活性成分群的特征峰的指纹图谱与其药效结果对应起来，即将中药指纹图谱中化学成分含量变化与其药效变化联系起来，建立起中药谱效关系，才能有效地反映其内在质量，这是中药研究的关键所在。

在深入研究中，发现复杂的提取物工艺，尤其是提取步骤众多、工艺繁复的工艺，极易改变提取物的指纹特征，虽然提取物中已知成分的含量满足了要求，但是在活性方面往往存在着严重的缺陷，造成疗效的下降，不稳定，甚至是无疗效。

经检索所有公开的发明专利中，均未进行有关红花提取物谱效关系方面的研究，未对提取物指纹特征谱图进行有效控制。

发明内容

本发明目的在于，提供一种具有明确谱效关系的红花提取物的用途，通过对红花加热回流提取，大孔树脂分离纯化获得红花提取物，建立有效部位指纹图谱，进行谱效关系分析。本发明为新疆红花的质量控制提供了更为全面和准确的谱效基础。灰度关联度分析表明：其抑制活性与指纹图谱中获得的7个共有峰有关联，说明这7个峰在降糖作用中具有协同作用，其中关联度和含量都比较高的是羟基红花黄色素A(6号峰)和6-羟基山奈酚-3,6-双-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷(3号峰)。另外经初步的活性筛选试验证明：本发明所述的具有明确谱效关系的红花提取物具有蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制作用。通过动物实验进一步阐明了其医学用途，可作为原料或辅助剂用于防治糖尿病的药物或保健品。本发明将中药的指纹图谱和其生物活性相互结合，通过指纹图谱的分析方法明确中药的生物活性物质基础，并可将之列为药材质量控制中的重点监控对象。

本发明所述的一种具有明确谱效关系的红花提取物的用途，提取物按照HPLC法进行指纹图谱分析，图谱上羟基红花黄色素A与6-羟基山奈酚-3,6-双-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷的峰面积比为5.0-8.0，具体操作按下列步骤进行：

a、色谱柱：Phenomenex Gemini 110A-C18，5μm，4.6mm×250mm；

b、流动相：A为甲醇、B为乙腈和C为体积百分比0.2％的甲酸水溶液为流动相，按体积比10-15％A、5％B和85-80％C，时间0-10min；15-20％A、5-10％B和80-70％C，时间10-30min；20-15％A、10-5％B和70-80％C，时间30-40min进行梯度洗脱；

c、检测波长：265nm；

d、系统适用性:以理论板数按羟基红花黄色素A峰计算为4000。

提取物中含羟基红花黄色素A和6-羟基山奈酚-3,6-双-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷的峰面积之和为50％。

所述的具有明确谱效关系的红花提取物在制备抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶1B中的用途。

所述的具有明确谱效关系的红花提取物在制备治疗降血糖的保健品或其它功能性食品中的用途。

本发明所述的具有明确谱效关系的红花提取物的用途，其中红花提取物的制备方法，是参照本课题组已授权的发明专利《一种红花羟基黄色素A的制备方法》(ZL20110606888.5)的制备方法的步骤a、b进行改进，具体操作按下列步骤进行：

1)药材提取:将红花粉碎后，加入20-40倍量的蒸馏水，温度60-70℃水浴浸泡30-120min，回流提取1-3次，每次40-100min，合并提取液；

2)提取液浓缩：将提取液减压浓缩至相对密度为1.01-1.05g/mL，得到浓缩液；

3)水提取物浓缩液纯化:将浓缩液上样到大孔吸附树脂柱，用蒸馏水洗脱糖分，待流出液Molisch反应基本呈阴性时，以10％乙醇洗脱，收集流份，得到红花粗提取物；

4)粗提物干燥：浓缩浸膏，室温干燥得到红花提取物。

将得到的红花提取物按照HPLC法进行指纹图谱分析，图谱上计算羟基红花黄色素A与6-羟基山奈酚-3,6-双-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷的峰面积比应为5.0-8.0，具体操作按下列步骤进行:

a、色谱柱：Phenomenex Gemini 110A-C18，5μm，4.6mm×250mm；

b、流动相：A为甲醇、B为乙腈和C为体积百分比0.2％的甲酸水溶液为流动相，按体积比10-15％A、5％B和85-80％C，时间0-10min；15-20％A、5-10％B和80-70％C，时间10-30min；20-15％A、10-5％B和70-80％C，时间30-40min进行梯度洗脱；

c、检测波长：265nm；

d、系统适用性:以理论板数按羟基红花黄色素A峰计算为4000。

提取物中含羟基红花黄色素A和6-羟基山奈酚-3,6-双-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷的峰面积之和为50％。

附图说明

图1为本发明10批红花药材提取物HPLC指纹图谱(265nm)。

具体实施方式

实施例1

不同来源的红花样品采集自新疆红花主产地：昌吉吉木萨尔县、塔城裕民县、伊宁霍城县，共10批。

称取红花药材15g粉碎后，加入40倍量的蒸馏水，温度70℃水浴浸泡30min，回流提取3次，每次40min，合并提取液；

将提取液减压浓缩至相对密度为1.01-1.05g/mL，得到浓缩液；

将浓缩液上样到AB-8型大孔吸附树脂柱，树脂层析柱的直径与高度之比为1:9，洗脱速度为1mL/min，先用蒸馏水洗脱糖分，待流出液Molisch反应基本呈阴性时，以体积浓度10％乙醇洗脱，收集流份，浓缩浸膏，得到黄色粉末628mg，室温干燥并保存，得到红花提取物。

实施例2

称取红花药材15g粉碎后，加入20倍量的蒸馏水，温度60℃水浴浸泡120min，回流提取1次，时间100min，得到提取液；

将提取液浓缩至相对密度为1.01-1.05g/mL，得到浓缩液；

将浓缩液上样到AB-8型大孔吸附树脂柱,树脂层析柱的直径与高度之比为1:9，洗脱速度为1mL/min.先用蒸馏水洗脱糖分，待流出液Molisch反应基本呈阴性时，以体积浓度10％乙醇洗脱，收集流份，浓缩浸膏，得到黄色粉末556mg，室温干燥并保存，得到红花提取物。

实施例3

将实施例1获得的红花提取物作为蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂的药物或保健品的用途的生物活性筛选：

筛选方法：用对-硝基苯基磷酸二钠(pNPP)作为底物，根据蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)水解pNPP的磷酸基团而产生颜色反应来测定PTP1B抑制剂的活性。PTP1B抑制活性测定反应体系:179μL PTP1B稀释液，用pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液PBS稀释，室温孵育5min，测试样品或阳性对照样品1μL(将样品配成浓度梯度)或二甲基亚砜(DMSO)1μL，混匀后室温孵育5min，加入35mmol/L的pNPP 20μL，总体积为200μL，温度25℃避光孵育30min后终止反应，在405nm处测定吸收值，以不含酶溶液体系为空白，以钒酸钠为阳性对照。按上述活性测定方法,提取物用DMSO溶解，按不同剂量加入，405nm处测定吸收值，每个实验重复3次，按抑制率＝(OD405_空白-OD405_样品)/OD405_空白×100％,求得不同浓度的抑制率，并运用IBM>

表1 10批红花药材的有效部位的PTP1B酶抑制活性

结论：从实验结果表明，10批红花降糖有效部位都具有蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂功效，样品的IC50值略有差别。

实施例4

红花提取物指纹图谱的建立：

色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：Phenomenex Gemini 110A-C₁₈(5μm，4.6mm×250mm)；流动相：A甲醇，B乙腈，C体积百分比0.2％的甲酸水溶液；按表2进行梯度洗脱；检测波长：265nm；流速：1.0mL/min；柱温：室温；进样量：20μL，流动相条件见表2，以理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于4000。

表2流动相梯度洗脱条件

羟基红花黄色素A对照品溶液的制备：取羟基红花黄色素A对照品3.0mg，精密称定，置容量瓶中，加25％甲醇定容制成每1mL含0.3mg的溶液，用0.22μm有机膜过滤，取续滤液，即得。

供试品溶液红花降糖有效部位的制备：分别精密称取10批红花提取物粉末8.0mg于5mL容量瓶中，加25％甲醇定容，用0.22μm有机膜过滤，即得。

指纹图谱及其相似度测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注人液相色谱仪，测定，记录色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件进行相似度评价，谱图见附图1。设定参照图谱，将各色谱图自动匹配，生成对照谱图，进行相似度计算，结果见表3。10批新疆不同产地的红花相似度在0.95以上，均已达到相似度的基本要求，说明样品之间具有良好的相似度。

表3 10批红花药材有效部位的共有峰峰面积与相似度R

所得红花提取物高效液相指纹图谱中含羟基红花黄色素A和6-羟基山奈酚-3,6-双-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷的峰面积之和不低于50％；并且经计算羟基红花黄色素A与6-羟基山奈酚-3,6-双-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷的峰面积比为5.0-8.0。

实施例5

红花提取物药材的指纹图谱与降糖活性的灰色关联度分析：

原始数据处理：将各差异样品的药效学指标组成参考数列，将各差异样品的指纹图谱中的各共有峰峰面积组成比较数列。对所述参考数列和比较数列进行无量纲化处理；优选采用均值化方法进行处理。

求绝对差序列：以药理效应值列为参考数列(Yo(m))，样品列为比较数列(Yi(m))，按公式计算绝对差数列(△oi(m))，其中△oi(m)＝丨Yo(m)-Yi(m)丨。所得的无量纲化的参考数列和比较数列，以用于计算各共有峰与药效之间的关联度。

求关联系数：关联系数反映2个被比较序列的靠近程度。比较序列(Yi(m))与参考序列(Yo(m))的关联系数按公式计算：Koi＝(△min+ρ△max)/(△oi(m)+ρ△max)(分辩系数取ρ＝0.2)。

求关联度：各类关联系数以平均值法求得，对步骤3)所得关联度进行排序，以评价共有峰的药效活性，关联度大于0.6的，视为活性组分。表4结果显示，红花降糖有效部位降糖活性与指纹图谱中获得的7个共有峰都有关联，说明这7个峰在降糖作用中具有协同作用，其中关联度和含量都比较高的是羟基红花黄色素A(6号峰)和6-羟基山奈酚-3,6-双-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷(3号峰)。7个色谱峰关联度从大到小，顺序为P5>P6>P3>P1>P7>P4>P8，见表4。

表4红花降糖有效部位的谱效关系

实施例6

将实施例1获得的红花提取物作为改善胰岛素抵抗的药物或保健品的用途的生物活性筛选：

筛选方法：SD雄性大鼠(200土20)g，室温18-20℃，湿度50-60％，明暗周期12/12h，自由摄食、饮水。给予标准大鼠饲料(含碳水化合物53％，脂肪5％，蛋白质23％)，适应性饲养一周后，空白组给予普通标准饲料，模型组及治疗组给予高糖高脂饲料喂养4周后，禁食8-10小时，于第29天测量空腹血糖，并静脉注STZ 45mg/kg。72h后，取禁食后8-10h的大鼠尾静脉血，测空腹血糖，选择血糖值高于11.1mmol/L者，视为高血糖动物造模成功。分组：空白对照组10只，动物模型随机分为5组，每组10只；

给药：造模成功后，各组每日8:00-9:00给予相应的药物，连续给药4周，空白对照组：基础饲料加相应体积蒸馏水；模型对照组：高脂饲料加相应体积蒸馏水；二甲双胍对照组：高脂饲料+二甲双胍片100mg/kg体重灌胃；药物低剂量组：高脂饲料+药物40mg/kg体重灌胃，中剂量组：高脂饲料+药物80mg/kg体重灌胃；高剂量组：高脂饲料+药物160mg/kg体重灌胃。血糖结果显示，红花水提取物在三个剂量组都具有很好的降糖效果，低剂量组效果最佳，给药4周后处死实验动物，取肝组织分别测定己糖激酶和肝糖原含量，取肌肉组织测定肌糖元含量。研究表明，红花水提取物处理的糖尿病大鼠，血糖值明显下降，差异有显著性(P<0.01),肝脏中己糖激酶活力升高，差异有显著性(P<O.01)，肝糖原含量上升，差异有显著性(P<O.O5)，大鼠肌肉组织中肌糖原含量上升，差异有显著性(P<O.Ol)肝糖原含量上升，大鼠肌肉组织中肌糖原含量上升，差异有显著性(P<O.O5)，结果见表5。

表5大鼠血糖及其他生化指标测定结果

从表中可以看出：红花降糖有效部位在三个剂量组都具有很好的降糖效果，低剂量组效果最佳，血糖值明显下降，进一步验证了其良好的降糖功效。