与肝癌分化相关的基因及其应用

摘要

本发明涉及与肝癌分化相关的基因及其应用，具体的涉及CDKN2AIPNL基因、MFSD2B基因、LSM11基因在制备诊治肝癌分化中的应用。发明通过在TCGA数据库的中挑选肝癌患者的测序数据和临床信息，进行挑选和归类，数据分析获得与肝癌分化相关的差异表达基因，进行临床实验验证，结果表明CDKN2AIPNL基因、MFSD2B基因、LSM11基因的表达和肝癌的分化高度相关。本发明提供与肝癌分化密切相关的分子标志物，可用来动态监测肝癌的分化程度，具有重要的临床意义及应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及与肝癌分化相关的基因及其应用，更具体的涉及CDKN2AIPNL基因、MFSD2B基因、LSM11基因在制备诊治肝癌分化制剂中的应用。

背景技术

肝癌是我国常见的恶性肿瘤，2015年癌症统计数据显示，中国四种最常见肿瘤分别是肺癌、胃癌、肝癌和食管癌，其中预计肝癌新发病约46.6万，继肺癌、胃癌和食管癌之后，排名第四，但是，预计肝癌的死亡率达42.2万，继肺癌和胃癌之后，排名第三。肝癌的治疗方式主要包括手术切除、射频消融等局部治疗、介入栓塞、化疗、生物免疫治疗等。这些治疗手段各有所长，各有一定的适应症和局限性。外科手术是肝癌治疗的主要手段，小肝癌的5年生存率达60-70％。但在切除大肝癌时切缘易残留微小的癌灶，并且对肝脏功能也有较大的负面影响，手术后易发生断面的复发或肝功能不全等并发症。射频消融等局部治疗对较小的肝癌病灶有很好的消融作用，且对肝功能影响不大，但是，当癌灶的体积较大时，往往存在消融不完全等问题。介入栓塞治疗虽然对癌灶有很好的治疗作用，对于较大的肿瘤，或者多发性肿瘤尤为适合，但该方法对肝脏功能有较大的负面影响，治疗过度容易引起肝功能不全等并发症。化疗虽属全身性治疗，但选择性抑制作用不强，化疗药物往往“敌我”不分，毒性较大，因此单靠使用化疗药物很难把癌细胞彻底消灭。中医中药在调动机体脏腑功能、提高人体抗病能力、减轻其它治疗的副作用等方面有其长处，但对肿瘤的局部控制能力较差。生物免疫治疗属于21世纪肿瘤治疗研究的重点，但现有的生物免疫治疗方法只能在残存肿瘤细胞数量较少的情况下发挥作用。各种治疗方法的优点有机地结合起来，制定确切有效的综合治疗方案，扬长避短，发挥各种治疗方法的优势以提高疗效，是进一步提高肝癌远期治疗效果的最重要措施。在医生制定手术方案时，肝癌的分化程度是影响方案的重要因素之一。对于分化程度高或较高的肝癌，医生更倾向于手术切除；如果分化程度差，要慎重选择手术切除。由于手术前医生无法确切地知道肝癌细胞的分化程度，这需要将手术标本放在显微镜让病理医生来检查。这样为医生制定适宜的手术方案增加难度。

本发明通过在TCGA数据库的中挑选333例肝癌患者的测序数据和临床信息，进行挑选和归类，并对所有原始数据集进行总体归一化处理后进行linear bylinear association test，数据分析获得与肝癌分化相关的基因，进一步对筛选到的与肝癌分化相关的差异表达基因进行实验验证，结果表明CDKN2AIPNL基因、MFSD2B基因、LSM11基因的表达和肝癌的分化密切相关，随着肝癌的分化程度变差(低)，基因的表达量不断升高。即本发明找到与肝癌分化密切相关的分子标志物，可用来动态监测肝癌的分化程度，具有重要的临床意义及应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供检测CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11基因表达情况或蛋白含量的试剂在制备诊断肝癌分化制剂中的应用。

为实现上述目的，发明通过生物信息学整合分析筛选到基因CDKN2AIPNL、MFSD2B和LSM11，进而通过RT-PCR验证了他们与肝癌分化具有很好的相关性，可用于制备肝癌分化辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。

肝癌分化采用肝癌Edmondson-Steiner分级法：

Ⅰ级：癌细胞呈高分化状态，核/质比接近正常；

Ⅱ级：癌细胞中度分化，但核/质比增加，核染色更深；

Ⅲ级：癌细胞分化较差，核/质比更高，核异质明显，核分裂多见；

Ⅳ级：癌细胞分化最差，胞质少，核染色质浓染，细胞形状极不规则，排列松散。

进一步，CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11基因或其表达产物在高分化肝癌样本中低表达。CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11基因在不同肝癌分化组中相对表达量：Ⅰ级<Ⅱ级<Ⅲ级<Ⅳ级。

进一步，诊断肝癌分化制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法、northern杂交方法或高通量测序方法检测样本中CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11基因表达情况。

用于荧光定量PCR方法检测肝癌中CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11基因的产品含有特异性扩增CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11基因的引物；基因芯片包括与CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11基因的核酸序列杂交的探针；northern杂交包括与CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11基因的核酸序列杂交的探针。

优选的，荧光定量PCR方法检测基因CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11，采用特异的引物，检测LSM11基因的引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；检测MFSD2B基因的引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；检测CDKN2AIPNL基因的引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

优选的，检测样本为肝癌组织。样本可以通过穿刺活检等方式取得。

荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。

基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。

进一步，诊断肝癌分化制剂包括用免疫方法检测CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11蛋白含量。

优选的，免疫方法检测CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11蛋白含量为western blot和/或ELISA和/胶体金检测方法。

ELISA法为使用ELISA检测试剂盒检测CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11蛋白含量。试剂盒中的抗体可采用市售的CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。

胶体金法为使用胶体金试剂盒检测CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11蛋白含量，抗体可采用市售的CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11单克隆抗体。进一步，胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。

优选的，检测样本为肝癌组织。

酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。

常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。

本发明的目的在于提供一种检测肝癌分化的试剂盒，试剂盒检测基因CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11，采用特异的引物，检测LSM11基因的引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；检测MFSD2B基因的引物序列为SEQID NO.3和SEQ ID NO.4；检测CDKN2AIPNL基因的引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。

本发明目的是提供了一种检测肝癌分化的蛋白试剂盒，检测试剂盒检测CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11蛋白量。进一步的，试剂盒还包括其他检测试剂。

本发明目的是提供了一种检测肝癌分化的基因芯片，基因芯片包括与CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11基因的核酸序列杂交的探针。

本发明的目的在于提供调节CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11基因表达或蛋白含量的试剂在制备调控肝癌分化制剂中的应用。

本发明的目的在于提供抑制CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11基因表达或降低蛋白含量的试剂在制备肝癌分化诱导剂中的应用。

肿瘤的诱导分化治疗是指利用分化诱导剂促进恶性肿瘤细胞向成熟细胞方向分化，重建正常表型，恢复正常功能，并最终促进肿瘤细胞凋亡和抑制增殖，从而达到治愈肿瘤的目的。肝癌中CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11基因的低表达有利于肝癌的高分化，即抑制CDKN2AIPNL、MFSD2B和/或LSM11基因的表达从而促进肝癌细胞向成熟细胞方向分化，从而达到治愈肝癌的目的。

本领域人员熟知抑制基因的表达或降低蛋白含量通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过激活基因的抑制基因、激活基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制基因表达、激活促进基因mRNA降解的microRNA、导入促进基因编码蛋白降解的分子、抑制促进基因表达的因子及蛋白的表达。即通过激活基因的抑制基因、激活抑制基因表达的蛋白、导入抑制基因表达的siRNA、激活促进基因mRNA降解的microRNA、导入促进蛋白降解的分子、抑制促进基因表达的因子及蛋白的表达。

RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。

附图说明

图1是在肝癌不同分化程度组中3个基因mRNA相对表达情况图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1数据的选择

1 纳入排除标准

TCGA数据库的nationwidechildrens.org_clinical_patient_lihc文件中共记录377例肝癌患者的临床信息。本项目排除history_other_malignancy或history_neoadjuvant_treatment为Yes的患者37例，剩余患者340例纳入本研究。

2 测序平台数据选择：

我们选择相对数据较多的UNC IlluminaHiseq_RNASeqV2平台，有case371例。其中有临床信息的case有336例。

3 肝癌分化程度样本选择

根据临床资料记载(nationwidechildrens.org_clinical_patient_lihc)，340例患者中，高分化49例，中分化156例，低分化116例，更低分化12例，Notavailable(数据不存在)3例。去除NA后，使用333例患者的数据进行后续分析。

实施例2数据分析

上述符合要求的样本中，通过转录组数据分析软件对TCGA数据库肝癌肿瘤组织分级相关的转录组测序数据进行分析。分析方法为用coin包的lbl.test函数linear by linear association test，具体做法是根据每个基因的表达量的四分位数将每个样本划分到为4个表达量区间，然后检测表达量区间与tumor grade的相关性。采用标准是FDR<0.05，得到与肿瘤分级相关基因(包括正相关基因和负相关基因)。为了更好的研究与分化程度相关的基因的功能，我们首先通过GeneCodis3对分级相关基因进行GO功能聚类和KEGG富集。结果显示，差异基因显著富集在有丝分裂细胞周期(mitotic cell cycle)、病毒转录(viraltranscription)、翻译终止(translational termination)、病毒感染周期(viral infectiouscycle)等生物功能，以及细胞周期(Cell cycle)，核糖体(Ribosome)，PPAR，卵母细胞减数分裂(Oocyte meiosis)，黄体酮介导的卵母细胞成熟(Progesterone-mediated oocyte maturation)，脂肪酸代谢(Fatty acid metabolism)，丁酸甲酯代谢(Butanoate metabolism)，丙酮酸盐/酯代谢(Pyruvate metabolism)，p53，补体系统等信号通路。

最后，结合上述分析结果，人为筛选出正相关基因LSM11基因、MFSD2B基因、CDKN2AIPNL基因，LSM11基因、MFSD2B基因、CDKN2AIPNL基因的表达与肿瘤分化密切相关，在肝癌高分化组基因表达量较低，随着肝癌分化程度升高基因表达量不断下降。

实施例3临床样本的采集

本发明中相关肝癌以及癌旁组织均取自医院中经手术治疗过的肝癌患者，并且与患者本人签定知情书。切取离体后的癌以及癌5厘米以外的部分，分别用于实验的癌组织以及癌旁组织，癌灶以及癌旁的诊断和分级均以最终的医院病理诊断为依据。样本均存放于-80℃冰箱中待用。

肝癌Edmondson-Steiner分级法：

Ⅰ级：癌细胞呈高分化状态，核/质比接近正常；

Ⅱ级：癌细胞中度分化，但核/质比增加，核染色更深；

Ⅲ级：癌细胞分化较差，核/质比更高，核异质明显，核分裂多见；

Ⅳ级：癌细胞分化最差，胞质少，核染色质浓染，细胞形状极不规则，排列松散。

经统计，132例原发性肝癌患者采集的样本中，22例为女性(占16.67％)，110例为男性(占83.33％)，年龄在32-79之间，医院病理诊断显示除5例由于样本关系无法确认，127例肝癌样本中9例为Ⅰ级(高分化)、28例Ⅱ级(中度分化)、59例Ⅲ级(分化较差)、31例Ⅳ级(分化最差)。

实施例4实验验证

1 肝癌组织样本RNA抽提

127例肝癌样本的RNA抽提采用试剂Trizol抽提，利用Trizol试剂破坏组织细胞，释放细胞中的RN A。具体抽提过程如下：

(1)从-80℃冰箱中去取出样本组织，放入预冷后的灭菌研钵中进行研磨；

(2)研磨组织粉末移入EP管中，加1毫升的Trizol和200微升氯仿混匀；

(3)4℃最大转速离心10分钟，分层；

(4)加500微升异丙醇，室温静置后4℃最大转速离心15分钟；

(5)加入1毫升75％乙醇洗涤RNA沉淀；

(6)4℃最大转速离心5分钟后，除去液体，自然干燥RNA；

(7)加入30-50微升DEPC水溶解RNA，测定浓度后，低温保存。

提取组织的总RNA通过Nanodrop ND-1000读取260nm和280nm处的吸光度值(A)测定RNA溶液的纯度。经1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察，检测RNA的完整性。

2 RNA逆转录成cDNA

使用M-MLV Reverse Transcriptase逆转录cDNA，操作过程如下：RNA2微克；Random Primer 1微升；Nuclease-Free H₂O补至17微升。

反应条件：70℃下加热5分钟，然后立即放在冰上冷却5分钟，离心。

在上面的反应体系中加入5×Reaction M-MLV Buffer 5微升；dNTP Mixture1.25微升；Ribonuclease Inhibitor 0.75微升；M-MLV Reverse Transcriptase1微升。上述反应液混匀后，37℃下1-2小时。用相同体积的ddH₂O25微升稀释原来的模版cDNA，-20℃保存备用。

3 RT-PCR检测目的基因的表达量

(1)引物设计：

LSM11基因扩增引物：

上游引物：5’-ATGTAGTTGGTGAGGTCTTC-3’(SEQ ID NO.1)

下游引物：5’-CAGAGAATGGCACAGGAA-3’(SEQ ID NO.2)

扩增长度：113bp。

MFSD2B基因扩增引物：

上游引物：5’-AGGTGTCACTTGTTCTGT-3’(SEQ ID NO.3)

下游引物：5’-TGGCTCCTGTTGATGAAG-3’(SEQ ID NO.4)

扩增长度：79bp。

CDKN2AIPNL基因扩增引物：

上游引物：5’-GGAAGACCTGCCACAATT-3’(SEQ ID NO.5)

下游引物：5’-CCCAGCCTCCTTTCTAATC-3’(SEQ ID NO.6)

扩增长度：114bp。

(2)反应体系及反应程序：

将各样品cDNA取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因β-actin引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。

表1反应体系

组分用量(μl)2×SYBR Premix Ex Taq10模板cDNA1上游引物0.3下游引物0.3灭菌水8.4

反应程序：95℃预变性10秒，35个循环(95℃变性5秒，60℃延伸30秒)，循环结束后4℃保存。

4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P<0.05差异有显著性意义。

5 实验结果

取5μlRNA，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，条带清晰，结果显示肝癌组织样本RNA抽提合格。

各样本实时扩增曲线拐点清楚、整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；比较不同分化程度组间(Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级)3个基因的相对表达情况，LSM11基因、MFSD2B基因、CDKN2AIPNL基因在高分化时相对表达量较低，低分化时表达量较高，并且表达趋势显示，三个基因的表达和肝癌的分化高度相关，随着肝癌分化程度升高基因表达量不断下降(具体见图1)，验证结果与高通量数据分析结果一致。