结合RT-PCR与NEST-PCR的草鱼出血病病毒检测试剂盒和检测方法

摘要

本发明提供一种结合RT‑PCR与NEST‑PCR的草鱼出血病病毒检测试剂盒和检测方法。设计巢式PCR反应(NEST‑PCR)，以RT‑PCR反应产物作为模板，进行NEST‑PCR扩增，有效提高了检测的灵敏度，可检测到携带较低病毒拷贝数的样品。

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种草鱼出血病病毒检测试剂盒和检测方法，尤其涉及一种结合RT-PCR与NEST-PCR的草鱼出血病病毒(GCRV-GD108)检测试剂盒和检测方法，属于鱼类病毒检测技术领域。

【背景技术】

草鱼是我国重要养殖品种，但养殖过程极易发生病害，尤其是病毒性出血病可导致草鱼高发病率与死亡率。草鱼出血病成为制约草鱼养殖业发展的瓶颈。该病主要发生在鱼种阶段，是一种流行广、危害极大的传染性鱼病，病毒的感染可导致病鱼各器官组织出现不同程度的充血、出血，严重时死亡率可高达90％以上。1983年我国首次报道草鱼出血病的病原为草鱼出血病病毒(Grass carp haemorrhage，GCHV)。1995年国际病毒分类委员会将其命名为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp Reovirus,GCRV)，归属于呼肠孤病毒科、水生呼肠孤病毒属。GCRV是中国分离鉴定的第一株鱼类病毒，GCRV 873株为其代表株，也是中国在国际上完成全基因组序列分析的第一株水生呼肠孤病毒。

近年，中国水产科学研究院珠江水产研究所从广东养殖草鱼患出血病病鱼体上分离到一株病毒株(GCRV-GD108株)，证实该毒株对草鱼具有强致病性，并成功克隆其全基因组，成为第二个获得全基因组序列的草鱼出血病病毒株。序列分析显示其隶属水生呼肠孤病毒属，但其分子特性显著有别于草鱼呼肠孤病毒GCRV-873等已知病毒株，并发现GCRV-GD108株在我国南方草鱼各主养区的病毒流行株中具有代表性(Xing Ye,Yuan-yuan Tian,Guo-chengDeng,Yan-yan Chi,Xiao-yan Jiang.Complete genomic sequence of a reovirus isolated from grasscarp in China.Virus Research,2012,163:275–283^[1]；田园园，叶星，邓国成，黎炯，王杭军.南方养殖草鱼呼肠孤病毒的分子特性比较及双重PCR检测方法的建立.病毒学报，2011，27(4)：358-365^[2]；Ye>[3])。

同时近年对南方多个草鱼主养区的随机抽样检测发现，草鱼苗种携带病毒的情况普遍存在，且多与GD108株相同。有些病鱼外表具有明显病症(如体表鳍条基部、腹部、口腔、肌肉等出血)，往往经过RT-PCR即可检测到病毒GD108株，但有些苗种外观及摄食活动正常的草鱼苗种也可能带有病毒、但由于病毒的数量较少而未能通过RT-PCR检测到，选购此类外表健康但实际上携带有病毒的草鱼苗种进行池塘养殖常常导致大批量的死亡，给养殖生产带来极大经济损失。因此提高草鱼出血病病毒GD108株的检测效率与灵敏度，对保障草鱼成鱼养殖的高存活率与养殖经济效益，真正从苗种供给源头上进行有效监控，并对选择使用特异性疫苗进行免疫、实现草鱼出血病的有效防控具有重要的意义。

申请号为201310430466.0的中国发明专利公开了一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测方法，可以实现在一个待测样本中同时检测草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的存在,并能对两种病毒的负载水平进行定量。但是该方法需要在提取病毒总RNA后进行独立的反转录反应，以获得cDNA第一链作为下一步PCR检测的模板；申请号为201210398483.6公开了一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法，根据三种类型草鱼呼肠孤病毒的第二节段的共有序列设计引物，通过RT-PCR法检测样品或细胞中是否有草鱼呼肠孤病毒的感染，但此法无法区分是哪种类型的草鱼呼肠孤病毒。现有技术中尚未见针对GCRV-GD108株、提高其检测效率与灵敏度的检测方法的相关报道。

【发明内容】

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、针对性强的结合RT-PCR与NEST-PCR的草鱼出血病病毒(GCRV-GD108株)检测试剂盒，包括：

(1)一步法RT-PCR反应混合液：25μL的反应体系中，包括One Step Enzyme Mix 1μL，2×1Step Buffer 12.5μL，引物对1的浓度为0.4μM，所述引物对1具有SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列，具体地，引物对1的序列如下：

正向引物：CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(SEQ ID NO：1)

反向引物：TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID NO：2)

其中，One Step Enzyme Mix包括反转录酶、DNA聚合酶、Rnase抑制剂。

2×1 Step Buffer包括：反应buffer、dNTP混合物(终浓度400uM)、One Step EnhancerSolution。

(2)NEST-PCR反应混合液：20μL的反应体系中，包括PremixTaq Mix10μL，引物对2的浓度为0.4μM，所述引物对2具有SEQ>

正向引物：TGACAGTGCGATTGACAGAGTT(SEQ ID NO：3)

反向引物：ATATATGTATAGTGGCGCGTCC(SEQ ID NO：4)

其中，PremixTaq Mix包括：2倍浓度的DNA聚合酶、Buffer、dNTP混合物。

本发明的另一目的是提供一种结合RT-PCR与NEST-PCR的草鱼出血病病毒(GCRV-GD108株)检测方法，具体包括以下步骤：

(1)、RNA的获取：提取待测草鱼组织的总RNA，作为RT-PCR反应的模板；

(2)、RT-PCR扩增：采用25μL的扩增体系，将反应混合液置于PCR仪进行RT-PCR扩增，所述反应混合液中，包括步骤(1)获取的RNA模板2μL，One Step Enzyme Mix 1μL，2×1 Step Buffer 12.5μL，引物对1的浓度为0.4μM，余量由DEPC处理水补足，放入PCR仪进行RT-PCR扩增，其中，所述引物对1具有SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列，具体地，引物对1的序列如下：

正向引物：CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(SEQ ID NO：1)

反向引物：TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID NO：2)

(3)、检测RT-PCR扩增结果：取RT-PCR扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片在349bp大小处有条带，则确定该样品携带草鱼出血病病毒GCRV-GD108株，若电泳图片在349bp大小处没有条带，则继续进行步骤(4)；

(4)、NEST-PCR扩增：以电泳图片在349bp大小处没有条带的RT-PCR扩增产物作为模板，进行NEST-PCR扩增，采用20μL的扩增体系：DNA模板2μL，PremixTaq Mix 10μL，引物对2的浓度为0.4μM，其余由灭菌ddH₂O补足，其中，所述引物对2具有SEQ>

正向引物：TGACAGTGCGATTGACAGAGTT(SEQ ID NO：3)

反向引物：ATATATGTATAGTGGCGCGTCC(SEQ ID NO：4)

(5)检测NEST-PCR扩增结果：取NEST-PCR扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片在206bp大小处有条带，判定该样品带有草鱼出血病病毒GCRV-GD108株。

优选的，上述步骤(1)具体包括：

A、组织预处理：样品预处理：取待测草鱼样品的组织300mg，加入600μL TN缓冲液(20mMTris-HCl，0.4M NaCl，pH 7.4)匀浆(电动匀浆机，打5次，每次5-6sec)，室温12000g离心15min，取上清；

B、Trizol试剂提取病毒RNA：在1mL Trizol试剂中加入150μL粗提取液，依照Trizol试剂提取RNA的步骤进行，最后溶解30μLDEPC水，用枪头轻打几次或室温20min，直接用于RT-PCR扩增，或-20度短暂保存、或-80℃冰箱保存。

优选的，上述步骤(2)中，RT-PCR扩增的条件为：PCR反应的条件为：50℃30min；94℃2min；进入循环：94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，共35个cycle；最后一个反应结束时，72℃延伸10min，4℃结束。

优选的，上述步骤(4)中，NEST-PCR扩增的条件为：94℃，预变性2min；进入35个循环：98℃10sec，56℃30sec，72℃50sec；最后一个循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。

本发明的优点及应用效果：

本发明针对目前我国草鱼养殖区普遍存在的草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株，提供一种结合RT-PCR与NEST-PCR的检测方法，该方法根据GCRV-GD108株的特异性基因片段设计引物，保证检测的特异性；

本发明采用一步法PT-PCR，改变了常见的将RNA进行反转录后，再取反转录产物作为模板进行PCR反应的做法，通过将反转录与PCR反应所需的各主要成分配制为混合液，简化操作步骤、缩短操作时间，并减少操作误差和出错、污染等可能性；

本发明设计巢式PCR反应(NEST-PCR)，以RT-PCR反应产物作为模板，进行NEST-PCR扩增，有效提高了检测的灵敏度，可检测到携带较低病毒拷贝数的样品；

优化了待检测样品取样方法，常规直接方法中，直接取一定量的待测样品提取RNA，1mLTrizol试剂加入组织的量不能大于30㎎，本发明通过匀浆和离心，取其上清液提取RNA，使每次用于提取RNA的实际组织用量增加，显著提高病毒RNA的获取量和检测灵敏度；

将本发明应用于草鱼苗种的病毒检测中，有利于保障草鱼成鱼养殖的高存活率与养殖经济效益，真正从苗种供给源头上进行有效监控，并对选择使用特异性疫苗进行免疫、实现草鱼出血病的有效防控具有重要意义。

【附图说明】

图1为本发明实施例中RT-PCR扩增产物的电泳图；

图2为本发明实施例中NEST-PCR扩增产物的电泳图。

【具体实施方式】

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在未作说明的情况下，本发明采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1

本实施例涉及一种结合RT-PCR与NEST-PCR的草鱼出血病病毒检测方法，为了验证本发明的应用效果，挑选A、B、C、D、E共5尾草鱼样品，其中A为健康草鱼样品，作为阴性对照；B、C为疑似感染有GCRV-GD108株出血病病毒的草鱼；D为外表正常的草鱼；E为具有明显病毒性出血病病症的草鱼，作为阳性对照。采用以下步骤提取各草鱼样品的RNA：

(1)组织预处理：每尾鱼剪取300mg的鳃与肠组织，加入600μl TN缓冲液(20mMTris-HCl，0.4M NaCl，pH 7.4)进行匀浆(电动匀浆机，打5次、每次5-6sec)，室温12000g离心15min，取上清。

(2)Trizol试剂提取病毒RNA：在1mL Trizol试剂中加入150μl粗提取液，依照Trizol试剂提取RNA的步骤进行提取RNA，最后溶解30μLDEPC水，用枪头轻打几次或室温20min，直接用于反转录，或-20℃短暂保存、或-80℃冰箱保存，并分别编号为1#、2#、3#、4#、5#。

为了验证本发明中RNA提取方法的应用效果，本实施例还按照普通方法采用Trizol试剂直接提取草鱼B和C的组织RNA(不经过上述步骤(1)的组织匀浆处理)，并将获取的RNA编号为II#和III#。

将上述获取的1#、II#、III#、2#、3#、4#、5#共7个RNA模板按照下述步骤(3)-(6)继续进行草鱼出血病病毒GCRV-GD108株的检测：

(3)RT-PCR扩增：采用25μL的扩增体系，将反应混合液置于PCR仪进行RT-PCR扩增，所述反应混合液中，包括步骤获取的RNA模板2μL，One Step Enzyme Mix 1μL，2×1StepBuffer 12.5μL(One Step Enzyme Mix、2×1Step Buffer使用TAKARA公司One Step RT-PCR试剂盒(Cat.Nos.RR055A)，引物对1的浓度为0.4μM，余量由DEPC处理水补足，放入PCR仪进行RT-PCR扩增。其中，

PCR反应的条件为：50℃30min；94℃2min；进入循环：94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，共35个cycle；最后一个反应结束时，72℃延伸10min，4℃结束。

所述引物对1具有SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列，具体地，引物对1的序列如下：

正向引物：CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(SEQ ID NO：1)

反向引物：TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID NO：2)

(4)检测RT-PCR扩增结果：取RT-PCR扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳电压为120V，时间为28min，于凝胶成像系统中成像，电泳图片在349bp大小处有条带，则确定该样品携带草鱼出血病病毒GCRV-GD108株，若电泳图片在349bp大小处没有条带，则将该扩增产物作为模板继续进行NEST-PCR扩增。如图1所示，本实施例中，1#阴性对照样品在349bp处未出现扩增条带，II#、III#、2#、3#、4#、5#在349bp处有扩增条带，但是II#、III#的扩增条带比2#、3#的条带弱。说明本实施例的步骤(1)所述的组织预处理步骤可以显著提高病毒RNA的获取量。

(5)NEST-PCR扩增：分别以1#、II#、III#、2#、3#、4#、5#RAN模板的RT-PCR扩增产物作为模板，进行NEST-PCR扩增，采用20μL的扩增体系：RNA模板2μL，PremixTaq Mix(TAKARA公司，Cat.Nos.R004A)10μL，引物对2的浓度为0.4μM，余量由灭菌ddH2O补足。其中，

NEST-PCR反应的条件为：94℃，预变性2min；进入35个循环：98℃10sec，56℃30sec，72℃50sec；最后一个循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。

所述引物对2具有SEQ>

正向引物：TGACAGTGCGATTGACAGAGTT(SEQ ID NO：3)

反向引物：ATATATGTATAGTGGCGCGTCC(SEQ ID NO：4)

(6)检测NEST-PCR扩增结果：取NEST-PCR扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片在206bp大小处有条带，判定该样品带有草鱼出血病病毒GCRV-GD108株。如图2所示，本实施例中，1#样品(阴性对照)的NEST-PCR扩增产物于206bp处依然没有扩增条带，而II#、III#、2#、3#、5#样品在206bp处均有明亮的扩增条带。在RT-PCR中没有扩增条带的4#样品，NEST-PCR后也出现明亮的206bp扩增条带。说明本实施例的步骤(5)所述的NEST-PCR扩增步骤可以提高病毒检测的灵敏度。

因此，判定除阴性对照外的所有草鱼均感染有草鱼出血病病毒GCRV-GD108株，且以RT-PCR产物作为模板，进行NEST-PCR扩增，可以提高检测灵敏度，检测到携带较低病毒拷贝数的样品。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。