一种四倍体马铃薯高通量测序开发标记的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种四倍体马铃薯高通量测序开发标记的方法及其应用。本发明的四倍体马铃薯高通量测序开发标记的方法大幅降低马铃薯基因组复杂度，操作简便，可快速鉴定出高密度的SNP位点，获得控制目标性状的染色体标签差异遗传区间，最后基于差异遗传区段可开发分子标记。本发明的方法成功的实现了2b‑RAD测序技术在马铃薯四倍体材料标记开发中的应用，不仅解决了马铃薯四倍体材料标记开发困难的问题，并且极大缩短了与性状紧密连锁标记的开发周期。此外，本发明的方法也为其它多倍体复杂基因组生物的遗传区段挖掘、标记开发和基因组研究提供参考。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种四倍体马铃薯高通量测序开发标记的方法及其应用。

背景技术

四倍体马铃薯(2n＝4x＝48)高度杂合，遗传重组频率高，且自交多代后衰退严重，但遗传背景狭窄，基因库贫乏，分子标记开发困难。因此，马铃薯遗传图谱的饱和度差、分子标记数量少，与水稻、玉米、大豆等作物相比在诸多方面都相距甚远。目前的遗传图谱多使用SSR、AFLP等传统标记，标记开发及遗传图谱构建也主要是在二倍体水平上进行的，直接在四倍体水平上开发标记鲜见报道。到目前为止，可供马铃薯育种选择直接应用的分子标记仍然有限，急需开发出更多与育种性状紧密连锁的分子标记，相关分子标记的开发将为马铃薯分子标记辅助育种提供新的标记资源。

高通量简化基因组测序(Reduced-representation sequencing)是在第二代测序基础上发展起来的一种利用酶切技术、序列捕获芯片技术或其他实验手段降低物种基因组复杂程度，针对基因组特定区域进行测序，进而反映部分基因组序列结构信息的测序技术。其中运用最为广泛的是限制性酶切位点相关的DNA(Restriction-site associated DNA，RAD)测序技术，即RAD-seq。该技术利用限制性内切酶对基因组进行酶切，产生一定大小的片段，构建测序文库，对酶切后产生的RAD标记进行高通量测序。由于RAD标记是全基因组范围的呈现特异性酶切位点附近的小片段DNA标签，代表了整个基因组的序列特征，因此通过对RAD标记测序能够在大多数生物中获得成千上万的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)标记。该技术的优点在于：(1)通量高，通过一次测序开发RAD标记的数量是传统分子标记开发技术的10倍；(2)准确性高，数字化信号和高覆盖度使其较传统的分子标记准确性大大提升；(3)数据利用率高，性价比高，由于基因组的复杂度被大幅降低，从而降低了测序成本，因而特别适合在群体水平进行研究；(4)实验周期短，由于具有高通量的特点，经过一次测序能够产生数以万计的标记，大大缩短了传统标记的开发周期；(5)不受基因组序列的限制，对没有参考基因组的物种也可以进行大规模筛查SNP位点。RAD-seq已成功应用于SNP标记的开发、超高密度遗传图谱的构建、动植物重要经济性状的QTL定位、群体遗传结构、系统演化分析和辅助全基因组de novo测序等研究领域。

目前，IIB型限制性内切酶的RAD(IIB digest RAD，2b-RAD)技术是在单酶切RAD-seq技术上发展起来。该技术是利用IIB型限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，这类酶(比如BsaⅪ和AlfⅠ)能在基因组DNA上靶标位点的上游和下游位点切断 DNA，获得长度一致的DNA片段。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种多倍体作物分子标记的开发方法。

本发明提供的多倍体作物分子标记的开发方法包括如下步骤：

1)对多倍体作物子代进行性状调查，选取呈现某一目标性状的子代作为子代甲，选取呈现与所述某一目标性状相反的子代作为子代乙；

所述多倍体作物子代为多倍体作物亲本甲和多倍体作物亲本乙的杂交子代；

所述多倍体作物亲本甲呈现所述目标性状；所述多倍体作物亲本乙呈现与所述目标形状相反的性状；

2)分别提取所述多倍体作物亲本甲、所述多作物多倍体亲本乙、所述子代甲和所述子代乙的基因组DNA，分别得到多倍体作物亲本甲的基因组DNA、多倍体作物亲本乙的基因组DNA、子代甲DNA混池和子代乙DNA混池；

所述子代甲DNA混池为将子代甲中每个个体的基因组DNA等量混合后得到的混合DNA样品；

所述子代乙DNA混池为将子代乙中每个个体的基因组DNA等量混合后得到的混合DNA样品；

所述子代甲和所述子代乙中的个体数量均不少于30个，所述子代甲和所述子代乙中的个体数量具体为35个；

3)分别对所述多倍体作物亲本甲的基因组DNA、所述多倍体作物亲本乙的基因组DNA、所述子代甲DNA混池和所述子代乙DNA混池进行高通量简化基因组测序，分别得到多倍体作物亲本甲的染色体标签密度分布图、多倍体作物亲本乙的染色体标签密度分布图、子代甲DNA混池的染色体标签密度分布图和子代乙DNA混池的染色体标签密度分布图；

4)比对上述子代甲DNA混池的染色体标签密度分布图和子代乙DNA混池的染色体标签密度分布图2个图；

选取在子代甲DNA混池的染色体标签密度分布图中特异存在而在子代乙DNA混池的染色体标签密度分布图中没有的染色体区段，作为子代甲染色体特异标签密度分布图；

选取在子代乙DNA混池的染色体标签密度分布图中特异存在而在子代甲DNA混池的染色体标签密度分布图中没有的染色体区段，作为子代乙染色体特异标签密度分布图；

5)比对所述子代甲染色体特异标签密度分布图和所述子代乙染色体特异标签密度分布图，选择差异染色体区段即为目的标签密度差异染色体区段；

6)根据所述目的标签密度差异染色体区段设计合成引物，开发分子标记。

上述方法中，所述高通量简化基因组测序为2b-RAD测序；

所述2b-RAD测序中使用的限制性内切酶为IIB型限制性内切酶；

所述IIB型限制性内切酶具体为BsaXI。

上述方法中，

所述多倍体作物为四倍体马铃薯；所述子代为F1代；在分子标记的具体开发过程中，如果是其他F1代未发生性状分离的多倍体作物，应选择F2代分离群体作为性状调查的群体。

上述方法中，

所述目标性状为马铃薯早熟性状，与其相反的性状为马铃薯晚熟性状；

所述早熟性状为生育期小于75天；所述晚熟性状为生育期大于110天；

所述分子标记是与所述目标性状相关的分子标记。

上述方法中，

所述多倍体作物亲本甲为中薯3号；

所述多倍体作物亲本乙为中薯19号。

上述方法中，

所述分子标记为SCAR标记和/或CAPs标记；

所述SCAR标记由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；

所述CAPs标记由序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成。

本发明的第二个目的是提供上述方法的新用途。

本发明提供了上述方法在多倍体作物分子标记的开发中的应用。

本发明的第三个目的是提供检测待测马铃薯是否含有DNA片段甲的物质的新用途。

本发明提供了检测待测马铃薯是否含有DNA片段甲的物质在如下(1)-(6)中至少一种中的应用：

(1)鉴定或辅助鉴定待测马铃薯熟性性状；

(2)制备鉴定或辅助鉴定待测马铃薯熟性性状的产品；

(3)鉴定或辅助鉴定待测马铃薯为早熟马铃薯还是晚熟马铃薯；

(4)制备鉴定或辅助鉴定待测马铃薯为早熟马铃薯还是晚熟马铃薯的产品；

(5)选育早熟马铃薯；

(6)选育晚熟马铃薯。

上述应用中，所述检测待测马铃薯是否含有DNA片段甲的物质为PCR扩增含有所述DNA片段甲的引物；

所述引物为如下1)或2)：

1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；

2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；

所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；

所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸。

本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测马铃薯熟性的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测马铃薯熟性的方法是检测待测马铃薯是否含有DNA片段甲，

若待测马铃薯含有DNA片段甲，则待测马铃薯为或候选为早熟马铃薯；

若待测马铃薯不含有DNA片段甲，则待测马铃薯为或候选为晚熟马铃薯。

上述方法中，所述检测待测马铃薯是否含有DNA片段甲的方法为如下X1)或X2)：

X1)直接测序马铃薯个体的基因组DNA；

X2)测序含有DNA片段甲的PCR扩增产物；

所述PCR扩增产物所用的引物为如下1)或2)：

1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；

2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；

所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；

所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸。

本发明的第五个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测马铃薯熟性性状的产品。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测马铃薯熟性性状的产品为检测待测马铃薯是否含有DNA片段甲的物质；

所述检测待测马铃薯是否含有DNA片段甲的物质为如下Y1)或Y2)或Y3)或Y4)：

Y1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA 分子组成的引物对A；

Y2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；

所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；

所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；

Y3)含有Y1)所述引物对A或Y2)所述引物对B的PCR试剂；

Y4)含有Y1)所述引物对A或Y2)所述引物对B或Y3)所述PCR试剂的试剂盒。

上述应用或上述方法或上述产品中，

所述DNA片段甲的核苷酸序列为马铃薯基因组(马铃薯基因组参考序列的版本号为Potato(Solanum tuberosum group Phureja DM1-3)Genome Browser v4.03)的第4132599-4133441位，也即为序列5所示的DNA分子。

所述早熟马铃薯为生育期小于75天的马铃薯；所述晚熟马铃薯为生育期大于110天的马铃薯；

所述马铃薯为四倍体马铃薯。

本发明利用2b-RAD技术提供了一种高效快速的四倍体马铃薯高通量测序开发标记的方法，该方法避免了其它RAD技术中片段大小选择的过程，使标签在基因组中的分布更加均匀，尤其对于复杂基因组的标记开发和染色体区段的挖掘更为适用。同时该方法无需预知基因组信息，文库构建简单快捷，标签密度易于调节，成本低廉，也特别适合于连锁图谱与自然群体中遗传变异图谱的构建。

通过实验证明：本发明的四倍体马铃薯高通量测序开发标记的方法大幅降低马铃薯基因组复杂度，操作简便，可快速鉴定出高密度的SNP位点，获得控制目标性状的染色体标签差异遗传区间(区段)，最后基于差异遗传区段可开发分子标记。本发明的方法成功的实现了2b-RAD测序技术在马铃薯四倍体材料标记开发中的应用，不仅解决了马铃薯四倍体材料标记开发困难的问题，并且极大缩短了与性状紧密连锁标记的开发周期。此外，本发明的方法也为其它多倍体复杂基因组生物的遗传区段挖掘、标记开发和基因组研究提供参考。

附图说明

图1为马铃薯亲本与极端子代DNA混池琼脂糖质量检测结果图。Marker II从上到下依次为1200bp、900bp、700bp、500bp、300bp、100bp；亲本1：中薯3号；亲本2：中薯19号；混池1：极端早熟子代混池；混池2：极端晚熟子代混池。

图2为马铃薯极端子代混池染色体特异标签密度分布图。纵坐标：分别为马铃薯12条染色体，由Chr1至Chr12；横坐标：染色体物理距离，单位(Mb)；右侧柱状图：不同颜色表示不同的标签数量，数字表示标签数量；每条染色体中，第一个(上)表示混池1特异标签，第二个(中)为混池2特异标签，第三个(下)为两池之间标签密度差的绝对值；其中，黑色区域表示差异标签密度大，黄色区域表示差异标签密度次之，颜色的深浅表示标签密度的相对差异。

图3为多态性标记SCAR5-5在极端早熟子代材料中的验证结果图。M：MarkerⅡ，从上到下依次为1200bp、900bp、700bp、500bp、300bp、100bp；亲本1：中薯3号；亲本2：中薯19号；55、56、81、91、103、107、117、122和133中为部分极端早熟子代编号。

图4为多态性标记SCAR5-5在极端晚熟子代材料中的验证结果图。M：MarkerⅡ，从上到下依次为1200bp、900bp、700bp、500bp、300bp、100bp；亲本1：中薯3号；亲本2：中薯19号；2、4、5、10、23、34、52、54和60为部分极端晚熟子代编号。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中2％CTAB的配制方法：CTAB 20g+NaCl 81.81g+40mL EDTA(0.5M pH8.0)+100mL Tris+HCl(1M PH8.0)+10g PVP，加入蒸馏水定容至1L，高压灭菌40min，常温保存，使用时加入1％的巯基乙醇，且需置于65℃水中预热。

下述实施例中的溶液氯仿:异戊醇(24:1)、异丙醇用之前需先预冷。

下述实施例中的亲本中薯3号为马铃薯早熟品种，品种审定编号：国审薯2005005，公众可从中国农业科学研究院蔬菜花卉研究所获得。

下述实施例中的亲本中薯19号为马铃薯晚熟品种，品种审定编号：国审薯2014002，公众可从中国农业科学研究院蔬菜花卉研究所获得。

实施例1、一种四倍体马铃薯材料的标记开发的方法

一、供试材料及其性状调查

1、供试材料

本发明所利用的马铃薯四倍体F1代熟性分离群体，是由四倍体马铃薯早熟品种中薯3号(父本，亲本1)与四倍体马铃薯晚熟品种中薯19号(母本，亲本2)杂交获得。

2、性状调查

对F1代分离群体的熟性性状进行调查。统计出苗(子叶出土)与生理成熟(植株 叶片达到50％枯黄)时间，计算生育期(出苗至生理成熟的天数)。按照生育期长短，将生育期小于75天的记为早熟材料，生育期大于110天的记为晚熟材料，生育期大于75天且小于110天的记为中熟材料。最终获得极端早熟子代材料和极端晚熟子代材料各35份。

二、极端子代DNA混池构建

1、亲本及子代个体基因组DNA提取

采集亲本1、亲本2、极端早熟子代材料和极端晚熟子代材料的马铃薯叶片，采用改良的CTAB小量法提取基因组DNA。具体步骤如下：

(1)取管盖大小的马铃薯叶片2片于1.5mL离心管内。

(2)将含叶片的1.5mL离心管放于液氮中冷冻后，用研磨棒研成粉末，加入65℃预热的2％的CTAB 700uL(添加β巯基乙醇，终浓度为1％)，混匀。

(3)置65℃水浴1h，期间每10min摇动一次。

(4)取出冷却至室温后，加入等体积预冷的氯仿：异戊醇(24：1)溶液700uL，轻轻摇匀5min。

(5)14000rpm，4℃离心10min，吸取上清液约500ul至新的1.5mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻上下震荡混匀。

(6)-20℃冰箱中沉淀30min(可过夜)，14000rpm，4℃离心10min；

(7)倒掉上清液，加入1mL 70％乙醇洗涤沉淀，上下颠倒6-8次，7500rpm离心5min，弃上清。

(8)重复清洗，取1mL 70％乙醇洗涤沉淀，7500rpm离心5min，弃上清液

(9)放入通风橱，至酒精挥发完毕，加入100μL有RNA酶的无菌水复溶，37℃温育1h除去残余的RNA(RNase浓度：0.1mg/mL)。

(10)取2μL DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。

2、极端子代DNA混池构建

(1)将提取的所有极端早熟子代材料的基因组DNA进行等量混合，构建混池1。并电泳检测DNA混池的质量。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。

(2)将提取的所有极端晚熟子代材料的基因组DNA进行等量混合，构建混池2。并电泳检测DNA混池的质量。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。

三、高通量简化基因组测序筛选出差异染色体区段

将质量检测合格的亲本1、亲本2、混池1和混池2进行2b-RAD高通量简化基因组测序，分别获得亲本1的染色体标签密度分布图、亲本2的染色体标签密度分布图、混池1的染色体标签密度分布图和混池2的染色体标签密度分布图，并对各个染色体标签密度图进行比对，找出特异性标签，然后再根据特异性标签绘制混池1的染色体 特异标签密度图和混池2的染色体特异标签密度图，最后根据2个染色体特异标签密度图筛选出混池1和混池2的差异染色体区段。具体步骤如下：

1、建库

利用2b-RAD技术，通过限制性内切酶Bsa XI对全基因组DNA进行酶切，采用标准型NNN接头，构建上述4个马铃薯样品(亲本1、亲本2、混池1和混池2)的标签测序文库，4个样品在Hiseq2500v2平台进行单末端测序，分别获得亲本1的染色体标签密度分布图、亲本2的染色体标签密度分布图、混池1的染色体标签密度分布图和混池2的染色体标签密度分布图。

2、质量过滤

将步骤1获得的原始reads按照以下条件进行质量过滤:

(1)剔除不含有BsaXI酶切识别位点的序列；

(2)剔除低质量序列(低质量序列定义：大于10个碱基的质量分数小于20)；

(3)剔除10个以上有连续相同碱基的序列。

3、个体测序标签统计

将步骤2获得的个体高质量reads利用SOAP软件mapping到已测序马铃薯单倍型DM的参考序列上，获得可用于分型的unique标签数目及深度。

4、全基因组范围SNP筛查和分型分析

(1)构建参考序列

从马铃薯参考基因组序列中提取包含Bsa XI酶切位点的标签作为参考序列，马铃薯参考基因组网址如下：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝Solanum％20tuberosum。

(2)个体SNP标记分型

将个体的高质量reads利用SOAP软件(参数设置为：-M4–v2–r0)mapping到参考序列上。利用最大似然法ML进行位点的分型。为了保证SNP位点分型的准确性和严谨性，进行以下条件的过滤：

(a)只留取标签内最多有3个SNP的标签位点；

(b)在个体内标签深度在500以上的不进行分型。

5、根据以上分型结果，对4个样品构建的染色体标签密度分布图等个性化分析，比对混池1的染色体标签密度分布图和混池2的染色体标签密度分布图；选取在混池1染色体标签密度分布图中特异存在而在混池2染色体标签密度分布图没有的染色体区段，作为混池1的染色体特异标签密度分布图；选取在混池2染色体标签密度分布图中特异存在而在混池1的染色体标签密度分布图中没有的染色体区段，作为混池2的染色体特异标签密度分布图；混池1和混池2的染色体特异标签密度分布图如图2 所示。

6、差异区间筛选

比对混池1的染色体特异标签密度分布图和混池2的染色体特异标签密度分布图，筛选出标签密度差异较大的染色体区段，即为差异染色体区段。本发明筛选出的与马铃薯熟性相关的差异染色体区段位于5号染色体约4Mb的位置。

四、标记开发及验证

1、引物设计

调取差异区段标签信息，包括参考序列和序列位置等。根据差异标签的位置，从马铃薯基因组序列网站(http：//solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml)中下载该差异标签左右各700bp的序列。利用Mega5.2将标签序列与下载的序列进行比对，确定该标签的准确性。利用Premier5引物设计软件进行引物设计，将引物序列长度设定为22bp，上游引物设置在1-550bp处，下游引物设置在850-1400bp处，引物扩增片段大小设定为400-900bp之间，Tm值设定为55-63℃之间，共设计3对引物，并送交上海生工生物工程有限公司合成。引物如表1所示：

表1、引物的设计

2、分子标记的检测

(1)分别以亲本1和亲本2的基因组DNA为模板，采用步骤1设计的引物进行PCR扩增，扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳检测引物的质量及特异性。

上述PCR扩增体系(10μL)如表2所示：

表2、PCR扩增体系

上述PCR扩增程序如表3所示：

表3、PCR扩增程序

电泳：上样量为10μL，琼脂糖凝胶为1.2％，电压120V，电泳25min。

根据3对引物的扩增结果，SCAR5-5引物在亲本1中扩增条带，而在亲本2中未扩增出条带，因此SCAR5-5引物可被开发作为SCAR标记用于鉴定马铃薯的熟性性状。

(2)CAPS5-24引物在亲本1和亲本2中均能扩增出清晰且无差异条带，将CAPS5-24引物扩增得到的PCR扩增产物进行酶切，并利用2.0％琼脂糖凝胶进行检测(电压100v，电泳40min)。

上述酶切体系(15μL)：PCR产物8μL、Cutsmart 1.5μL、BsaXI内切酶(0.5μL/U)0.2μL、ddH₂O>

上述酶切反应条件：37℃反应3h。

CAPS5-24引物在亲本1中的PCR扩增产物可被限制性内切酶BsaXI酶切，而在亲本2中的PCR扩增产物不可被限制性内切酶BsaXI酶切，因此CAPS5-24引物可被开发作为CAPs标记用于鉴定马铃薯的熟性性状。

3、分子标记SCAR5-5的验证

选取分子标记SCAR5-5利用极端早熟子代与极端晚熟材料进行验证。具体步骤如下：分别以亲本1、亲本2、极端早熟子代和极端晚熟材料的基因组DNA为模板，采用分子标记SCAR5-5进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，将PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测。上述PCR扩增与产物检测方法同步骤3。

分子标记SCAR5-5在亲本1、亲本2、极端早熟子代和极端晚熟材料中的验证结果如图3和图4所示。从图3中可以看出：除了材料103，分子标记SCAR5-5在极端早熟子代与亲本1中均扩增得到大小为843bp的条带，上述大小为843bp的条带的核苷酸序列为马铃薯基因组(马铃薯基因组参考序列的版本号为Potato(Solanum tuberosum group Phureja DM1-3)Genome Browser v4.03)的第4132599-4133441位，也即为序列5所示的DNA分子；从图4中可以看出，分子标记SCAR5-5在极端晚熟 子代和亲本2中均未扩增出条带。以上结果说明：本发明开发的分子标记SCAR5-5与四倍体马铃薯熟性性状连锁，可用于四倍体马铃薯熟性性状的鉴定。